Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61258
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Abstract

Polinükleotid kinazlar (PNKs) DNA ve RNA oligonükleotidlerinin 5' hidroksil ucunun fosforilasyonını katalize eden enzimlerdir. PNK'ların etkinliği doğrudan veya dolaylı yaklaşımlar kullanılarak ölçülebilir. Burada sunulan bir floresan etiketli oligonükleotid substrat ve poliakrilamid jel elektroforez dayanan PNK aktivitesini ölçmek için doğrudan, in vitro bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, fosforlu ürünlerin çözünürlüğünü sağlarken, radyoetiketli yüzeylerin kullanımından kaçınılır. Protokol, fosforilasyon reaksiyonu nasıl ayarlanacağını, büyük poliakrilamid jellerinin nasıl hazırlanacağını ve çalıştırılabildiğini ve reaksiyon ürünlerinin nasıl ölçülmesini ayrıntılarıyla anlatır. Bu sataşma en teknik olarak zorlu kısmı dökülen ve büyük poliakrilamid jelleri çalışan; böylece, ortak zorlukların üstesinden gelmek için önemli ayrıntılar sağlanmaktadır. Bu protokol Grc3 için optimize edildi, bağlayıcı ortağı ile zorunlu bir pre-ribozomal RNA işleme kompleksi içine monte bir PNK, Las1 nükleaz. Ancak, bu protokol diğer PNK enzimlerinin aktivitesini ölçmek için uyarlanabilir. Ayrıca, bu tetkik de reaksiyonun farklı bileşenlerinin etkilerini belirlemek için değiştirilebilir, nükleozit trifosfat gibi, metal iyonları, ve oligonükleotidler.

Introduction

Polinükleotid kinazlar (PNK) DNA onarımı ve,ribozom montaj1,2,3,4,5gibi birçok DNA ve RNA işleme yollarında kritik rol oynamaktadır., Bu temel enzimler terminal (gama) monofosfatının nükleozit trifosfattan (NTP, en sık ATP) nükleotit substratının 5' hidroksil ucuna transferini katalizler. En iyi karakterize PNKs biri bakteriyofaj T4 PNK, geniş substrat özgüllüğü vardır ve ağır bir DNA veya RNA substrat5terminus üzerine radyoaktif izotop etiketleri dahil etmek için moleküler biyoloji laboratuvarları tarafından kullanılan 6,7,8,9,10,11,12. Bir PNK enziminin başka bir örneği CLP1, Eukarya bulunan, Eubacteria, ve Arke, ve çeşitli RNA işleme yollarıkarıştığı 4,13,14,15.

Tarihsel olarak, polinükleotid kizaz aktivitesiölçmek en tahliller radyoaktif izotop etiketleme ve sonraki otoradyografi5,bağlıdır ,16. Son yıllarda ek tahliller bir dizi pnk aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir, tek molekül yaklaşımları da dahil olmak üzere, mikroçip elektroforez, moleküler işaretleri, yanı sıra kolorimetrik ve parlaklık tabanlı tahliller17,18,19,20,21,22. Bu yeni yaklaşımların çoğu gelişmiş algılama limitleri sağlarken ve radyoaktivite kullanımını önlemek, her maliyet gibi dezavantajları vardır, immobilize reçine güven, ve substrat seçiminde sınırlamalar.

Grc3 pre-ribozomal RNA2,,,3,23işlenmesinde önemli bir rol oynayan bir polinükleotid kinaz olduğunu. Grc3 endoribonuclease Las1 ile zorunlu bir kompleks oluşturur, hangi iç Transkripsiyonu Spacer cleaves 2 (ITS2) pre-ribozomal RNA3. Las1 tarafından ITS2 dekolte daha sonra Grc3 kinizaz3tarafından fosforile bir 5 'hidroksil barındıran bir ürün üretir. Grc3'ün nükleotit ve substrat özgüllüğünü araştırmak için, farklı oligonükleotid substratlarının test edilmesine izin veren ucuz bir test gerekiyordu. Bu nedenle floresan etiketli substratlar kullanılarak PNK fosforilasyon titreti geliştirilmiştir. Bu tsur, Grc3'ün fosforil transfer aktivitesi için herhangi bir NTP kullanabileceğini belirlemek için başarıyla kullanıldı, ancak ATP24'ünlehine. Bu protokol, grc3'ün pnk aktivitesini, ribozomal RNA substratının bir RNA mimiküzerinde ölçmek için orijinal testini uyarlar (SC-ITS2, Tablo 1). Bu floresan tabanlı yaklaşımın zorlu bir yönü fosforlu ve fosforile olmayan yüzeyleri etkili bir şekilde çözmek için büyük poliakrilamid jeller güven. Protokol, bu büyük jellerin nasıl döküleceklerine ve bunu yaparken ortak tuzaklardan nasıl kaçınılacaklarına dair özel ayrıntılar sağlar.

RNA ile çalışmak, bozulmaya karşı güçlü bir şekilde duyarlı olduğu için özel bir bakım gerektirir. Ribonükleaz kontaminasyonunu sınırlamak için atabileceğiniz basit önleyici adımlar vardır. RNase inhibitörü içeren bir temizlik maddesi ile kolayca tedavi edilebilen ayrı bir RNA iş istasyonu genellikle yararlıdır. Numuneleri işlerken her zaman eldiven takmak ve RNase içermeyen sertifikalı sarf malzemelerinin kullanılması gereklidir. Su başka bir yaygın kontaminasyon kaynağı olduğundan, taze arıtılmış su kullanmak ve 0,22 μm filtre kullanarak tüm çözümleri sterilize etmek en iyisidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hazırlık

  1. Arabellek ve reaktifleri hazırlayın.
    1. Toplam 1 m Tris (pH = 8,0), 40 μL 5 M sodyum klorür, 2,5 μL 2 M magnezyum klorür, 100 μL %50 (v/v) gliserol ve 1 mL'lik rNase içermeyen suyu birleştirerek 1x Reaksiyon Tamponu yapın.
    2. 4,8 g üre, 200 μL 1 M Tris (pH = 8,0), 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL %1 (w/v) bromofenol mavisi ve RNase içermeyen suyu birleştirerek üre yükleme boyası yapın.
    3. 108 g Tris baz, 55 g borik asit, 40 mL 0,5 M EDTA (pH = 8,0) ve Toplam 1 L'lik rNase içermeyen suyu birleştirerek 10x TBE tamponu yapın.
    4. %10 (w/v) amonyum persülfat (APS) yapın. 0,5 g APS ağırlığında ve katı eritmek için 3 mL RNase içermeyen su ekleyin. Toplam 5 mL hacme ulaşmak için RNase içermeyen su ekleyin. Tüpü folyoya sarın ve çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
      NOT: Çözünmüş APS zamanla çürür. Her 2 haftada bir %10 APS hissesini değiştirin.
  2. Polinükleotid kinaz enzimini elde edin.
    1. Reaksiyon Tamponu'nda depolanan saf Las1-Grc3 PNKenzim2'yi (bkz. adım 1.1.1) 20 μM'lik bir stok konsantrasyonunda edinin. Depolama arabelleği belirli PNK bağlı olarak değişir.
  3. Nükleik asit substratı hazırlayın.
    NOT: Bu protokol, Saccharomyces cerevisiae pre-ribozomal iç transkripsiyonlu spacer 2 (SC-ITS2; bakınız Tablo 1)2,25,26içinde yer alan Las1-Grc3 işleme sitesi (C2 sitesi) barındıran 27 nt RNA substrat5'-fosforilasyon izler.
    1. Kimyasal olarak 5'-hidroksil ucu içeren bir RNA oligonükleotid substratı ve 3'-floresan etiket sentez. Florofor RNA görselleştirme için kullanılacaktır. Florofor fosforilasyon için hedeflenmemiş RNA ucunda konumlandırılmış olduğundan emin olun. Ticari kaynaklara alternatif olarak, RNA substratlarının iç ve terminal floresan etiketlemesi, uygun maliyetli protokoller kullanılarak şirket içinde yapılabilir27.
    2. HPLC-arıtma28ile RNA etiketleme reaksiyonundan fazla florofor kaldırın.
    3. 500 nM RNa içermeyen su kullanarak lyophilized RNA resuspend.
    4. RNA aliquots'u uzun süreli depolama için -80 °C'de veya kısa süreli depolama için -20 °C'de saklayın.
  4. ATP konsantrasyon serisini hazırlayın.
    1. Reaksiyon Arabelleği kullanarak 20 mM'lik bir ATP çalışma stoğu yapın (bkz. adım 1.1.1). 20 mM-0,02 mM arasında değişen dört seri seyreltme oluşturmak için bu çalışma stoğunu kullanın.
    2. Konsantrasyon serisinin ilk seyreltilmesini yapmak için, 20 mM ATP çalışma stokunun 1 μL'sini 9 μL Reaksiyon Tamponu ile karıştırın. Bu 2 mM son konsantrasyonu ile ATP 10 kat seyreltme neden olacaktır.
    3. 1.4.2 adımda oluşturulan 2 mM ATP stoğunu kullanarak konsantrasyon serisindeki bir sonraki seyreltme yi kullanın. 2 mM ATP stokunun 1 μL'sini 9 μL Reaksiyon Tamponu ile karıştırın. Bu 0.2 mM yeni bir ATP stok konsantrasyonu yapacaktır.
    4. Konsantrasyon serisinde sonraki ATP stoğunu yapmak için önceki ATP stokunun 1 μL'sini 9 μL Reaksiyon Tamponu ile seyreltmeye devam edin.

2. In vitro RNA kinaz reaksiyonu

NOT: Bu çalışma, zaman, nükleotit seviyeleri veya enzim konsantrasyonu gibi çeşitli değişkenleri ölçmek için kullanılabilir. Bu deneyin amacı, sabit Las1-Grc3 kompleksi ve değişen ATP düzeyleri nin varlığında fosforile RNA miktarını değerlendirmektir.

  1. Her RNA-enzim kinaz reaksiyonu için 1 μL 500 nM RNA substrat, 8,3 μL 130 nM Las1-Grc3 ve 0,2 μL 5 mM EDTA'yı birleştirin.
    NOT: Birkaç reaksiyon gerçekleştiriyorsanız, rna-enzim karışımının ana stoğunu hazırlayın ve her reaksiyon tüpüne bu ana karışımın 9,5 μL'lik aliquot'unu hazırlayın.
  2. Tazyiki başlatın.
    1. Isı bloğunu 37 °C'ye ayarlayın.
    2. 10 s aralıklarla, adım 1.4'te hazırlanan ATP konsantrasyon serisinden bir ATP alt stokunun 0,5 μL'sini bir RNA-enzim karışımıyla karıştırın ve reaksiyonu 37 °C ısı bloğuna yerleştirin.
      NOT: PNK negatif kontrolü için bir RNA-enzim karışımına ATP yerine 0,5 l Reaksiyon Tamponu ekleyin. Başka bir gerekli kontrol de kullanın (yani, PNK enzimyokluğunda RNA substrat).
    3. Reaksiyonları 37 °C'de 60 dk kuluçkaya yatırın.
      NOT: Floresan etiketli RNA ışığa duyarlıdır; bu nedenle, folyo ile reaksiyonları kapsayacak.
    4. Adım 2.2.2'deki aynı sırayı kullanarak, her 10 s'lik her reaksiyonu 10 μL üre yükleme boyası ile şişirerek söndürün (bkz. adım 1.1.2).
      NOT: 4 M üre ek olarak, proteinaz K enzim iksiyon etmek için bu adımda eklenebilir. Gerekli proteaz miktarını ve reaksiyon koşullarını belirlemek için tedarikçi tarafından verilen talimatları uygulayın.
    5. Daha sonraki bir tarihte analiz edilmesi için instream analizi için hemen söndürülen in vitro RNA kinaz reaksiyonlarını kullanın (bkz. bölüm 3) veya -20 °C'de saklayın.

3. Jel elektroforez

  1. %15 akrilamid/8 M üre jel çözeltisi hazırlayın.
    DİkKAT: Akrilamid bir nörotoksin olduğu için, dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük takın.
    1. 150 mL cam kabında, 22,5 mL premix %40 akrilamid/bis-akrilamid 29:1 çözeltisi, 6 mL 10x TBE (bkz. adım 1.1.3), 28.8 g üre ve RNase içermeyen suyu toplam 59 mL hacminde birleştirir. Çözeltiyi yavaşça karıştırın.
      NOT: RNA substrat uzunluğuna bağlı olarak poliakrilamid yüzdesinin değiştirilmesi fosforilasyonsuz ve fosforlu RNA arasındaki çözünürlüğü artırabilir.
    2. Üre yi eritmek için çözeltiyi mikrodalgafırında 20 s ısıtın, sıvıyı karıştırın ve hemen çözeltiyi 20 s'lik bir fırına geri yerleştirin. Üre tamamen eriyene kadar çözeltiyi hafifçe karıştırın.
    3. Cam kabı soğuk su içeren sığ bir su banyosuna yerleştirerek çözeltiyi yavaşça soğutun. Cam kabı çevreleyen soğuk su seviyesinin cam kabın içindeki çözelti seviyesinin üzerinde olduğundan emin olun. Bu verimli ısı transferi teşvik edecektir. 5 dk bekleyin.
      NOT: Cam kabı sıcak hissediyorsa bu protokolile devam etmeyin; su 25 °C'nin altında olmalıdır. Hala 5 dakika sonra sıcak hissediyorsa, o zaman taze soğuk su ile su banyosunda su değiştirin ve başka bir 5 dakika bekleyin.
    4. Partikülleri ve mikroskobik hava kabarcıklarını temizlemek için 0,22 μm tek kullanımlık filtrasyon ünitesi kullanarak çözeltiyi filtreleyin ve gazdan arındırın.
  2. Denatüre jeli dökün.
    1. 31,0 cm x 38,5 cm boyutlarında jeller için tasarlanmış kısa ve uzun cam plakayı temizlemek için sabun ve ılık su kullanın. Sprey her cam plaka% 95 etanol ile ve herhangi bir nem kaldırmak için cam silin.
      NOT: Cam plakalı sandviçi ayırırken jelin zarar görmesini önlemek için iki plakadan biri silikonhaline getirilebilir. Ancak, bu protokol cam plakaları ayırmadan RNA'yı görselleştirmek için tasarlandığından, bu adım gerekli değildir.
    2. Uzun cam plakayı bir kutunun üzerine yatay olarak yerleştirin, böylece tezgahın üstünden yükselir.
      DİkKAT: Akrilamid toksiktir, bu nedenle jel döküm istasyonu dökülen sıvıyı emebilecek tezgah kağıdıyla kaplanmalı ve işlem tamamlandıktan sonra derhal bir atık torbasına konulmalıdır.
    3. Uzun cam plakanın uzun kenarları boyunca temiz bir 0,4 mm boşluk yerleştirin.
    4. Kısa cam plakayı uzun plakanın üzerine yerleştirin ve kısa plakanın, uzun plakanın ve boşluklayıcıların kenarlarının hizalandığından emin olun. Üç eşit aralıklı metal kelepçe kullanarak her iki tarafı kelepçe.
    5. Adım 3.1'de hazırlanan %15 akrilamid/8 M üre çözeltisine 24°L TEMED ekleyin ve çözeltiyi karıştırın.
    6. Adım 3.2.5'te çözeltiye %10 (w/v) APS'nin 600 μL'sini ekleyin (bkz. adım 1.1.4) ve çözeltiyi yavaşça karıştırın.
    7. Hemen cam plakalar arasında çözelti dökün.
      NOT: Kabarcıkları önlemek için, çözelti dökülür gibi cam dokunun.
    8. Dikkatle cam plaka sandviç üstüne temiz, 0,4 mm, 32 iyi tarak ekleyin.
    9. Akrilamid polimerize için en az 30 dakika bekleyin.
  3. Denatüre jeli çalıştırın.
    1. Isı bloğunu 75 °C'ye ayarlayın.
    2. Cam plakalı sandviçi bir arada tutan metal kelepçeleri çıkarın ve cam plakalı sandviçi iyice yıkayıp kurutun.
    3. Cam tabak sandviçini jel aparatına yerleştirin ve kısa plaka içe bakacak şekilde.
    4. 100 mL 10x TBE'yi 1,9 L RNase içermeyen su ile birleştirerek 0,5 x TBE çalışan tampon hazırlayın. Jel aparatının alt ve üst odalarına çalışan tamponun 600 mL'sini ekleyin.
    5. Tarakları yavaşça çıkarın ve bir şırınga kullanarak kuyuları iyice durulayın.
      NOT: Bu adım, üreyi kuyulardan çıkarmak için çok önemlidir.
    6. 50 W. Voltaj'da 30 dk için jelin önceden çalıştırılyaklaşık 2.000 V.'dir.
      DİkKAT: Bu jel aparatı yüksek watt'ta çalışır ve kullanıcılar önlem almalıdır.
    7. Bir şırınga kullanarak kuyuları iyice durulayın.
      NOT: Bu adım, numunenin kuyulara eşit olarak yüklenmesi için çok önemlidir.
    8. Nabız adım 2.2.5'ten gelen söndürülen reaksiyonları döndürür. Daha sonra tüpleri 75 °C'de 3 dk kuluçkaya yatırın. Nabız dönüşünü tekrarlayın.
    9. Hemen kuyu başına 10 μL numune yükleyin ve jeli 50 W'da 3 saat çalıştırın.
      NOT: Floresan etiketli RNA ışığa duyarlıdır; bu nedenle jel aparatını folyo ile kaplayın.
  4. Denaturing jelgörüntü.
    1. Güç kaynağını kapatın ve jel aparatının üst haznesini boşaltın.
    2. Cam plakalı sandviçin dış tarafını sabun ve su kullanarak yıkayın ve kurutun. Jel taşırken folyo ile cam plaka sandviç kapağı.
    3. Cam plakalı sandviçi, kantitatif ve hassas floresan algılama yeteneğine sahip bir lazer tarayıcının sahnesine monte edin.
      NOT: Bu jel maksimum çözünürlük için son derece incedir. Bu nedenle bu protokol, cam plakalı RNA'yı doğrudan cam plakalar üzerinden görselleştirerek jeli cam plakalı sandviçten çıkarmanın zorluklarını önlemek için tasarlanmıştır. Ticari olarak mevcut düşük floresan cam plakaların kullanımı sinyal-gürültü oranını artırarak yakalanan sinyali artıracaktır.
    4. İstenilen florofor için lazer tarayıcının uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayın.
      NOT: Optimal uyarma ve emisyon dalga boyları belirli florofororlar için farklılık gösterebilir. FAM florofor için uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 495 nm ve 535 nm'dir.
    5. Lazer tarayıcı aşamasında görüntülenecek alanı tanımlayın ve jeli üreticinin talimatlarına göre görüntüleyin(Şekil 1).

4. Görüntü analizi ve sinyal nicelemesi

  1. Adım 3.4.5'te edinilen dijital jel görüntüyü görüntü dürbünleme yazılımına yükleyin (bkz.
  2. Farenin sol düğmesini kullanarak, her RNA bandını ölçmek için kullanılacak dijital jel görüntüsündeki sınırları işaretlemek için bir şablon kutusu tanımlamak için bir dikdörtgeni tıklatın ve sürükleyin. PNK enziminin yokluğunda belirlenen reaksiyon karışımında görülen RNA bandı genellikle bu şablonu oluşturmak için iyi bir banttır.
    NOT: Arka plan sinyalinin neden olduğu önyargıyı önlemek için, ölçülen her RNA bandını çevreleyen alanın aynı olması önemlidir. Bu nedenle, her RNA bandını ayırmak için aynı şablon kutusunu kullanmak en iyisidir.
  3. "Araçlar" altında YG Yöneticisi'ni açın ve " Ekle " seçeneğini tıklayarak şablon kutusunun konumunuişaretleyin.
    NOT: Quantitation programları da otomatik olarak yazılım kullanım kılavuzu aşağıdaki kutuları çizebilirsiniz.
  4. Farenin sol düğmesini kullanarak şablon kutusunu bir sonraki RNA bandına sürükleyip 4.3 adımını yineleyin. Her reaksiyonda fosforlu ve fosforlu RNA bantlarının konumu işaretlenene kadar bu işlemi devam edin.
  5. YG Yöneticisi'ndeki "Ölçü "seçeneğini tıklayarak her kutudaki tümleşik yoğunluğu ölçün.
  6. Bir reaksiyonda fosforile RNA'nın göreceli miktarını hesaplamak için, fosforilasyonsuz ve fosforlu RNA bantlarının entegre yoğunluklarının toplamı ile fosforilasyonlu RNA bandının entegre yoğunluğunu aynı reaksiyondan ayırın. Bu yaklaşım, fosforilatsız RNA'nın göreli miktarını hesaplamak için de uygulanabilir.
  7. Fosforlu RNA ürünbirikimini ve ATP konsantrasyonu serisi boyunca fosforlu RNA substratının tükenmesini görselleştirmek için, 4.6 adımda hesaplanan göreli RNA miktarını ATP konsantrasyonuna göre çizin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sabit miktarda Las1-Grc3 kompleksi bulunan ATP titrasyonunun jelini inkar eden başarılı bir temsilci Şekil 1'degösterilmiştir. Enzimin eklenmesi, SC-ITS2 RNA substratının Las1 aracılı RNA bölünmesiile sonuçlandı ve tanımlanmış bir RNA parçasına (5-OH C2 RNA) yol açtı. ATP'nin eklenmesi yle C2 RNA parçası Grc3 PNK (5-P C2 RNA) tarafından fosforlandı. Denaturing jellerde fosforilasyonlu RNA fosforlu olmayan muadili daha hızlı göç eder. Şekil 2'degösterildiği gibi, C2 RNA parçasının fosforilasyonunu atp konsantrasyonuna göre fosforlu ve fosforlu C2 RNA'nın göreceli miktarı çizilerek görüntülenebilir. Grc3 PNK ayrıca kesilmemiş SC-ITS2 substratının 5 ucunu daha düşük bir oranda da olsa fosforietti. Bu grc3 PNK onun C2 RNA substrat24doğru substrat tercihi gösteren önceki çalışmaları doğrular. Başarısız bir denaturing jel Şekil 3gösterilir. 21 nt RNA substratı bozulma ürünleri içerdiğinden bu jel başarısız oldu(Şekil 3, ilk şerit). Bu bozulma ürünleri fosforilasyon ürünü ile örtüşmüş ve fosforilasyonun doğru bir şekilde ölçülmesi imkansız hale getirmiyordu. Buna karşılık, jelin bu alanı fosforlu muadili doğru nicelliği engelleyen herhangi bir ek RNA türü içermediğinden, en kısa RNA bozunma ürünü(Şekil 3, gri oklar) başarıyla analiz edilebilir. RNA bozunma bantlarını önlemek için çalışma alanını ve çözümleri RNase'siz tutun ve RNA donma-çözülme döngülerinin sayısını sınırlayın.

Figure 1
Şekil 1: Fosforilasyonlu RNA'nın jel analizini denatüre örneği. Las1-Grc3 in vitro RNA kinaz tayı (110 nM) 500 nM SC-ITS2 RNA ile kuluçkaya yatırılmış. X, Las1-Grc3 olmadan kontrol reaksiyonu işaretler ve siyah üçgen 0-10 mM'den ATP'nin titrasyonuna işaret eder. C2 RNA Las1 nükleaz tarafından SC-ITS2 RNA bölünmesi sonucu ve Grc3 PNK aktivitesi için endojen substrat olduğunu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: RNA fosforilasyonunun nicelleştirilmesi. Las1-Grc3 RNA kinaz aktivitesinin densiometric çizimi, bir ATP konsantrasyon serisi boyunca fosforilatsız C2 RNA (gri çizgi; 5-OH C2 RNA) ve fosfori lasyonalı C2 RNA (kahverengi çizgi; 5-P C2 RNA) yüzdesi olarak ifade edilir. Hata çubukları, üç bağımsız teknik çoğaltmadan standart sapmayı işaretler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Fosforilasyonlu RNA'nın başarısız bir denaturing jel analizi örneği. T4 PNK in vitro RNA kinaz titreci (0-0.625 U) 5 μm 21 nt RNA ile kuluçkaya yatırılmış. X, T4 PNK olmadan kontrol reaksiyonu işaretler. Bu RNA kontrolü, 21 nt fosforile ürünü bozunma ürününden (siyah oklar) ayırt etmeyi imkansız hale getiren bozulmuş RNA ürünleri içerir. En kısa RNA bozunma ürününün (gri oklar) fosforilasyon ürünü olan fosforilasyon muadili ile örtüşen dedradasyon ürünleri olmadığı için analiz edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sıra (5'→3') Oligo Kodu Kaynak
SC-ITS2 GUCGUUUUAGGUUUUAC
CAACUGCGGC/36-FAM/		 mp 911 (Pillon ve ark. NSMB 2019) 26.000
C2 RNA GGUUUUACCAACUG
CGGC/36-FAM/		 Yok SC-ITS2'nin Las1 dekolte ürünü
21-nt ACGUACGGAA
UACUUCGAA/36-TAMSp/		 mp 596 (Pillon ve ark. RNA, 2018) 24.000

Tablo 1: Floresan etiketli RNA yüzeyleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tanımlanan floresan etiketli nükleotit substratlar üzerinde Grc3 PNK kinaz aktivitesini ölçmek için bir töz. Bu protokol Reaksiyon Tamponu ve oligonükleotid substratuyarlayarak diğer PNK enzimlerini karakterize etmek için uygulanabilir. Örneğin, protokol EDTA bir izleme miktarı için çağırır. EDTA eklenmesi iki nedenden dolayı yararlıdır: Birincisi, bu yaklaşım karışımı kirlenmiş metallerin eser miktarda enzim bağlanmasını engelleyerek magnezyum bağlı Grc3 lehine. İkinci olarak, az miktarda EDTA, ilişkili Las1 metal-bağımsız ribonükleaz aktivitesini bozmadan metale bağımlı ribonükleazların kontamine olan aktivitesini engeller. EDTA konsantrasyonu spesifik PNK kaynağına bağlı olarak değiştirilebilir. Bu tahlil aynı zamanda kısa yarı ömür radyoizotopları ile etiketlenmiş oligonükleotidlere dayanan geleneksel PNK fosforilasyon tahlillerine göre bir avantaj sağlar (yani fosfor-32 için 2 haftalık yarı ömür). Bu protokol, spesifik enzim aktivitesini ve Michaelis-Menten kinetiklerini ölçmek ve fosforilasyonun nükleotitlerin, substratların ve metal iyonlarının doğası gibi çeşitli parametrelere olan bağımlılığını belirlemek için uyarlanabilir.

Bu protokol, fosforlu olmayan bir substratı fosforlu ürününden ayırmak için yeterli çözünürlüğü elde etmek için büyük denaturing poliakrilamid jellerinin çalıştırılmasına dayanır. Bu jellerin dökülmesi ve işlenmesi protokolün kritik adımlarıdır. Örneğin, akrilamid çözeltisi üre eritmek için ısıtılır ve jel dökmeden önce yavaş yavaş soğutulmalıdır. Bu çözeltinin çok hızlı soğutulması kristallerin oluşmasına neden olabilir. Ayrıca, yağmur yağarken ve jeli ayarlarken hava kabarcıkları ve tozların ortaya konmasını önlemeye özen de kullanılmalıdır. Cam plakaları çıkarmadan jel görüntüleme ince ve cam plakalar kaldırıldı kez işlemek zor jel, ripping önlemek için tavsiye edilir.

Bu protokol farklı büyüklükteki oligonükleotid alt tabakalarının fosforilasyonunun ölçülmesini ölçmek için uyarlanabilir. Bu özel tsurel 27 nt (SC-ITS2 RNA) ve 18 nt (C2 RNA) yüzeylerin fosforilasyon çözünürlüğü elde etmek için% 15 akrilamid jel kullanılır. SC-ITS2 RNA'nın 5 ucuna bir fosfat grubunun eklenmesi, kısa C2 RNA'nın 5 fosforilasyonuna bağlı hareket değişimine kıyasla mütevazı bir kayma üretir (Şekil 1). Bu, bu tekniği kullanırken RNA uzunluğubir sınırlama vurgulamaktadır. Daha uzun RNA substratları ile fosfat grubunun RNA türlerinin genel molekül ağırlığına katkısı azalır. Bu nedenle, akrilamid yüzdesi yanı sıra jel çalışma süresi farklı boyutlusubstratlar 29çözünürlüğü elde etmek için optimize edilebilir. Genel olarak, akrilamid daha yüksek yüzdeleri daha küçük oligonükleotid substratlar için kullanılırken, akrilamidin daha düşük yüzdeleri (%8'e kadar) daha büyük oligonükleotid substratlarının daha iyi çözümünü sağlar.

Bu tsurcun en önemli sınırlaması düşük iş bölümü olmasıdır. Döküm ve denaturing jeller çalışan bir gün içinde analiz edilebilir jeller ve numunelerin sayısını sınırlayan, zaman önemli miktarda alır. Bu sınırlamayı aşmak için gelecekte yapılacak bir uygulama, fosforiyal oligonükleotid ürünlerini çözebilen mikroakışkan yongaların geliştirilmesi olabilir. Mikroakışkan bazlı jel elektroforez, daha küçük numune boyutu, otomasyon ve hız gibi geleneksel jel elektroforezlerine göre birçok avantaja sahiptir. Ancak, mevcut mikroakışkan yongaların tek nükleotit çözünürlüğü yoktur. Sonuç olarak, radyoaktif olmayan oligonükleotidlerin değişmiş göçünü tespit etmek için denatüre jel elektroforezinin kullanılması, polinükleotid kiziz enzimlerinin katalitik gereksinimlerini ve substrat tercihini izlemek için yararlı bir teknik sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Dr. Andrew Sikkema ve Andrea Kaminski'ye bu el yazmasının eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247' den R.E.S) ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR; 146626 to M.C.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

Biyokimya Sayı 159 polinükleotid kinaz poliakrilamid jel fosforil transfer reaksiyonu RNA fosforilasyon Grc3 radyoaktif olmayan analiz
Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillon, M. C., Stanley, R. E.… More

Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter