Summary
Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.
Abstract
Le chinasi polinucleotide (PNK) sono enzimi che catalizzare la fosforilazione dell'estremità idrossile 5' del DNA e dell'RNA oligonucleotidi. L'attività dei PNK può essere quantificata utilizzando approcci diretti o indiretti. Qui è presentato un approccio diretto in vitro per misurare l'attività PNK che si basa su un substrato oligonucleotide etichettato fluorescente e elettroforesi gel poliacrilammide. Questo approccio fornisce la risoluzione dei prodotti fosforilati evitando l'uso di substrati con etichettatura radio. Il protocollo descrive in dettaglio come impostare la reazione di fosforilazione, preparare ed eseguire grandi gel di poliacrilammide e quantificare i prodotti di reazione. La parte più tecnicamente impegnativa di questo saggio è versare ed eseguire i grandi gel di poliacrilammide; vengono quindi forniti dettagli importanti per superare le difficoltà comuni. Questo protocollo è stato ottimizzato per Grc3, un PNK che si assembla in un complesso di elaborazione dell'RNA pre-ribosomico obbligatorio con il suo partner vincolante, il nucleasi Las1. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare l'attività di altri enzimi PNK. Inoltre, questo saggio può anche essere modificato per determinare gli effetti di diversi componenti della reazione, come il triphosfato nucleoside, gli ioni metallici e gli oligonucleotidi.
Introduction
Le chinasi polinucleotide (PNK) svolgono un ruolo fondamentale in molti percorsi di elaborazione del DNA e dell'RNA, come la riparazione del DNA e l'assemblaggio delribosoide 1,2,3,4,5. Questi enzimi fondamentali catalizzano il trasferimento del monofosfato terminale (gamma) da un triphosfato nucleoside (NTP, il più delle volte ATP) all'estremità idrossile da 5' di un substrato nucleotide. Uno dei PNK più caratterizzati è il batteriofago T4 PNK, che ha un'ampia specificità del substrato ed è fortemente utilizzato dai laboratori di biologia molecolare per incorporare etichette di isotopi radioattivi sul 5 capolinea di un sottostrato DNA o RNA6,7,8,9,10,11,12. Un altro esempio di enzima PNK è CLP1, che si trova in Eukarya, Eubacteria e Archaea, ed è implicato in diversi percorsi di elaborazione dell'RNA4,13,14,15.
Storicamente, la maggior parte dei saggi che misurano l'attività della chinasi polinucleotide dipendono dall'etichettatura degli isotopi radioattivi e dalla successiva autoradiografia5,16. Negli ultimi anni sono stati sviluppati una serie di analisi aggiuntive per misurare l'attività PNK, tra cui approcci a singola molecola, elettroforesi microchip, fari molecolari, così come saggi colorimetrici e a base di luminescenza17,18,19,20,21,22. Mentre molti di questi nuovi approcci forniscono limiti di rilevamento avanzati ed evitano l'uso della radioattività, ognuno presenta svantaggi, come il costo, la dipendenza dalla resina immobilizzata e le limitazioni nella scelta del substrato.
Grc3 è una chinasi polinucleotide che svolge un ruolo fondamentale nella lavorazione dell'RNA pre-ribosomico2,3,23. Grc3 forma un complesso obbligato con l'endoribonuclease Las1, che fasi la Spacer 2 (ITS2) interna trascritta dell'RNA pre-ribosomico3. Cleavage dell'ITS2 di Las1 genera un prodotto che ospita un idrossilo da 5' che viene successivamente fosforilato dalla chinasi Grc33. Per studiare la specificità nucleotide e substrato di Grc3, è stato necessario un saggio economico che permettesse di testare diversi substrati di oligonucleotide. Pertanto, è stato sviluppato un saggio di fosforilazione PNK utilizzando substrati con etichetta fluorescente. Questo saggio è stato utilizzato con successo per determinare che Grc3 può utilizzare qualsiasi NTP per l'attività di trasferimento del fosforile, ma favorisce ATP24. Questo protocollo adatta il saggio originale per misurare l'attività PNK di Grc3 su un RNA che imita il suo substrato di RNA pre-ribosomico (SC-ITS2, Tabella 1). Un aspetto impegnativo di questo approccio basato sulla fluorescenza è la dipendenza da grandi gel poliacrilammide per risolvere efficacemente i substrati fosforilati e non fosforilati. Il protocollo fornisce dettagli specifici su come versare questi grandi gel ed evitare insidie comuni quando si fa.
Lavorare con l'RNA richiede particolare attenzione perché è fortemente suscettibile alla degradazione. Ci sono semplici misure preventive che si possono adottare per limitare la contaminazione da ribonucleasi. Una postazione di lavoro RNA separata che può essere facilmente trattata con un agente di pulizia contenente inibitori RNase è spesso utile. È necessario indossare sempre i guanti durante la manipolazione dei campioni e l'uso di consumabili certificati senza RNase. Poiché l'acqua è un'altra fonte comune di contaminazione, è meglio usare acqua appena purificata e sterilizzare tutte le soluzioni utilizzando un filtro da 0,22 m.
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Protocol
1. Preparazione
- Preparare buffer e reagenti.
- Fare 1x Buffer di reazione combinando 20 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 40 L di cloruro di sodio 5 M, 2,5 L di 2 M di cloruro di magnesio, 100 L del 50% (v/v) glicerolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 1 mL.
- Fare il colorante di carico dell'urea combinando 4,8 g di urea, 200 L di 1 M Tris (pH - 8,0), 20 L di 0,5 M EDTA (pH - 8,0), 0,5 mL dell'1% (w/v) di blu bromofenolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 10 mL.
- Fare 10x TBE buffer combinando 108 g di base Tris, 55 g di acido borico, 40 mL di 0,5 M EDTA (pH - 8,0) e acqua libera da RNase per raggiungere un volume totale di 1 L.
- Fare 10% (w/v) persulfato di ammonio (APS). Pesare 0,5 g di APS e aggiungere 3 mL di acqua senza RNase per sciogliere il solido. Aggiungere acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 5 mL. Avvolgere il tubo in un foglio e conservare la soluzione a 4 gradi centigradi.
NOTA: L'APS disciolto decade nel tempo. Sostituire il 10% di stock APS ogni 2 settimane.
- Ottenere l'enzima chinasi polinucleotide.
- Acquisire l'enzima las1-Grc3 PNKpuro 2 immagazzinato nel buffer di reazione (c'è il punto 1.1.1) in una concentrazione di magazzino di 20 M. Il buffer di archiviazione varia a seconda del PNK specifico.
- Preparare il substrato acido nucleico.
NOTA: questo protocollo monitora 5'-fosforilazione di un substrato di RNA da 27 nt che ospita il sito di elaborazione Las1-Grc3 (sito C2) contenuto all'interno del distanziale interno pre-ribosomale 2 (SC-ITS2; vedi Tabella 1)2,25,26.- Sintetizzare chimicamente un substrato di oligonucleotide all'RNA contenente un'estremità 5'-idrossile insieme a un'etichetta a fluorescente da 3'. Il fluoroforo verrà utilizzato per la visualizzazione dell'RNA. Assicurarsi che il fluoroforo sia posizionato sull'estremità dell'RNA non mirata alla fosforilazione. In alternativa alle fonti commerciali, l'etichettatura fluorescente interna e terminale dei substrati di RNA può essere eseguita in-house utilizzando protocolli convenienti27.
- Rimuovere il fluorforo in eccesso dalla reazione di etichettatura dell'RNA da HPLC-purificazione28.
- Rispendere l'RNA lyophilized utilizzando acqua senza RNase a 500 nM.
- Conservare gli aliquots di RNA a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine o a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a breve termine.
- Preparare la serie di concentrazione ATP.
- Creare un materiale di lavoro di 20 mM di ATP utilizzando Reaction Buffer (vedere il passaggio 1.1.1). Utilizzare questo magazzino di lavoro per generare quattro diluizioni seriali che vanno da 20 mM-0,02 mM.
- Per effettuare la prima diluizione della serie di concentrazione, mescolare 1 L del magazzino di lavoro ATP da 20 mM con 9 L di Buffer di reazione. Questo si tradurrà in una diluizione 10 volte dell'ATP con una concentrazione finale di 2 mM.
- Utilizzare il titolo ATP da 2 mM generato nel passaggio 1.4.2 per effettuare la diluizione successiva nella serie di concentrazione. Miscela 1 L del titolo ATP da 2 mM con 9 L di Buffer di reazione. Questo farà una nuova concentrazione di stock ATP di 0,2 mM.
- Continuare a diluire 1 L del precedente titolo ATP con 9 L di Reaction Buffer per rendere il successivo stock ATP nella serie di concentrazione.
2. Reazione di chinasi dell'RNA in vitro
NOTA: Questo saggio può essere utilizzato per misurare diverse variabili come il tempo, i livelli di nucleotidi o la concentrazione di enzimi. L'obiettivo di questo esperimento è quello di valutare la quantità di RNA fosforilato in presenza di costanti livelli di ATP complessi Las1-Grc3 e diversi.
- Per ogni reazione di chinasi RNA-enzimatica, combinare 1 L di substrato RNA 500 nM, 8,3 L di 130 nM Las1-Grc3 e 0,2 L di 5 mM EDTA.
NOTA: Se si effettuano diverse reazioni, preparare uno stock master della miscela RNA-enzima e aliquot 9,5 L di questo mix master per ogni tubo di reazione. - Inizia il saggio.
- Impostare il blocco di calore a 37 gradi centigradi.
- A intervalli di 10 s, mescolare 0,5 L di un sottosoccante ATP della serie di concentrazione ATP preparato al punto 1.4 con una miscela RNA-enzima e posizionare la reazione nel blocco di calore di 37 gradi centigradi.
NOTA: Aggiungere 0,5 L di Buffer di reazione invece di ATP a una miscela RNA-enzima per un controllo negativo PNK. Utilizzare anche un altro controllo necessario (cioè il substrato dell'RNA in assenza di enzima PNK). - Incubare le reazioni per 60 min a 37 gradi centigradi.
NOTA: L'RNA con etichetta fluorescente è sensibile alla luce; quindi, coprire le reazioni con un foglio. - Utilizzando lo stesso ordine del punto 2.2.2, spegnete ogni reazione ogni 10 s con il richiamo della reazione con 10 L di colorante di carico dell'urea (c'è il punto 1.1.2).
NOTA: Oltre all'urea 4 M, a questo passaggio può essere aggiunta la proteinasi K per degradare l'enzima. Seguire le istruzioni fornite dal fornitore per determinare l'importo della proteasi richiesto e le condizioni di reazione. - Utilizzare immediatamente le reazioni di chinasi dell'RNA in vitro per l'analisi a valle (vedere la sezione 3) o per conservarlo a -20 gradi centigradi per essere analizzato in un secondo momento.
3. Elettroforesi gel
- Preparare la soluzione di gel di urea 15% acrilammide/8 M.
CAUTION: L'acrilammide deve essere maneggiata con cura, perché è una neurotossina. Indossare sempre guanti, un camice da laboratorio e occhiali da gioco quando lo si maneggiano.- In un bicchiere da 150 mL, unire 22,5 mL di acrylammide/bis-acrylamide 29:1, 6 mL di 10x TBE (vedi punto 1.1.3), 28,8 g di urea e acqua senza RNase ad un volume totale di 59 mL. Mescolare delicatamente la soluzione.
NOTA: A seconda della lunghezza del substrato dell'RNA, alterare la percentuale di poliacrilammide può migliorare la risoluzione tra RNA non fosforilato e fosforilato. - Per sciogliere l'urea, scaldare la soluzione nel forno a microonde per 20 s, mescolare il liquido e posizionare immediatamente la soluzione nel forno a microonde per altri 20 s. Mescolare delicatamente la soluzione fino a quando l'urea si scioglie completamente.
- Raffreddare lentamente la soluzione mettendo il bicchiere di vetro in un bagno d'acqua poco profondo contenente acqua fredda. Assicurarsi che il livello di acqua fredda che circonda il bicchiere di vetro sia al di sopra del livello di soluzione all'interno del bicchiere di vetro. Ciò promuoverà un trasferimento di calore efficiente. Attendere 5 min.
NOTA: Non continuare con questo protocollo se il bicchiere di vetro si sente caldo; l'acqua deve essere al di sotto dei 25 gradi centigradi. Se si sente ancora caldo dopo 5 minuti, quindi sostituire l'acqua nel bagno d'acqua con acqua fredda fresca e attendere altri 5 minuti. - Filtrare e degasre la soluzione utilizzando un'unità di filtrazione usa e getta da 0,22 m per rimuovere il particolato e le bolle d'aria microscopiche.
- In un bicchiere da 150 mL, unire 22,5 mL di acrylammide/bis-acrylamide 29:1, 6 mL di 10x TBE (vedi punto 1.1.3), 28,8 g di urea e acqua senza RNase ad un volume totale di 59 mL. Mescolare delicatamente la soluzione.
- Versare il gel denaturing.
- Utilizzare sapone e acqua tiepida per pulire una lastra di vetro corta e lunga progettata per gel con dimensioni complessive di 31,0 cm x 38,5 cm. Spruzzare ogni lastra di vetro con il 95% di etanolo e pulire il vetro per rimuovere l'umidità.
NOTA: Una delle due piastre può essere siliconizzata per evitare danni al gel quando si separa il panino con la piastra di vetro. Tuttavia, questo passaggio non è necessario perché questo protocollo è progettato per visualizzare l'RNA senza separare le lastre di vetro. - Posizionare la lunga lastra di vetro orizzontalmente sopra una scatola in modo che sia elevata dal piano della panca.
CAUTION: L'acrilammide è tossica, quindi la stazione di versamento di gel deve essere coperta in carta da banco in grado di assorbire qualsiasi liquido versato ed essere immediatamente collocata in un sacchetto di rifiuti dopo che la procedura è stata completata. - Posizionare un distanziale pulito di 0,4 mm lungo i lunghi bordi della lunga lastra di vetro.
- Disporre la piastra di vetro corta in cima alla piastra lunga e assicurarsi che i bordi della piastra corta, la piastra lunga e i distanziatori siano allineati. Bloccare ogni lato utilizzando tre morsetti metallici estasiati uniformemente.
- Aggiungere 24 L di TEMED alla soluzione di acrilammide 15%/8 M urea preparata al punto 3.1 e mescolare la soluzione.
- Aggiungere 600 L del 10% (w/v) APS (vedere il punto 1.1.4) alla soluzione nel passaggio 3.2.5 e mescolare delicatamente la soluzione.
- Versare immediatamente la soluzione tra le lastre di vetro.
NOTA: Per evitare le bolle, toccare il vetro mentre la soluzione viene versata. - Aggiungere con cura un pettine pulito, 0,4 mm, 32 ben sulla parte superiore del panino alla piastra di vetro.
- Lasciare un minimo di 30 min per l'acrilammide di polimerizzare.
- Utilizzare sapone e acqua tiepida per pulire una lastra di vetro corta e lunga progettata per gel con dimensioni complessive di 31,0 cm x 38,5 cm. Spruzzare ogni lastra di vetro con il 95% di etanolo e pulire il vetro per rimuovere l'umidità.
- Eseguire il gel denaturing.
- Impostare il blocco di calore a 75 gradi centigradi.
- Rimuovere i morsetti metallici che tengono insieme il panino con la piastra di vetro e lavare accuratamente e asciugare il panino con piastra di vetro.
- Inserire il panino in vetro nell'apparato gel con la piastra corta rivolta verso l'interno.
- Preparare il buffer di esecuzione TBE 0,5x combinando 100 mL di 10x TBE con acqua libera da 1,9 L RNase. Aggiungere 600 mL del buffer di corsa alle camere superiore e inferiore dell'apparato gel.
- Rimuovere delicatamente il pettine e sciacquare accuratamente i pozzetti con una siringa.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per rimuovere l'urea dai pozzetti. - Pre-eseguire il gel per 30 min a 50 W. Voltage è di circa 2.000 V.
CAUTION: Questo apparato gel funziona ad un alto wattaggio e gli utenti dovrebbero mostrare precauzione. - Sciacquare accuratamente i pozzetti con una siringa.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale anche per il caricamento del campione nei pozzetti. - L'impulso ruota le reazioni dissezionate dal punto 2.2.5. Quindi incubare i tubi a 75 gradi centigradi per 3 min. Ripetere il giro dell'impulso.
- Caricare immediatamente 10 L di campione per pozzo ed eseguire il gel per 3 h a 50 W.
NOTA: L'RNA con etichetta fluorescente è sensibile alla luce; quindi, coprire l'apparato gel con lamina.
- Immagine del gel denaturante.
- Spegnere l'alimentazione e drenare la camera superiore dell'apparato gel.
- Lavare e asciugare il lato esterno del panino alla piastra di vetro con acqua e sapone. Coprire il panino con lastra di vetro con un foglio durante il trasporto del gel.
- Montare il panino a lastra di vetro sul palco di uno scanner laser in grado di rilevare la fluorescenza quantitativa e sensibile.
NOTA: Questo gel è estremamente sottile per la massima risoluzione. Per questo motivo, questo protocollo è progettato per evitare le difficoltà di rimuovere il gel dal panino lastra di vetro visualizzando direttamente l'RNA etichettato fluorescente attraverso le lastre di vetro. L'uso di lastre di vetro a bassa fluorescenza disponibili in mercato aumenterà il segnale catturato migliorando il rapporto segnale-rumore. - Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione dello scanner laser per il fluorforo desiderato.
NOTA: Le lunghezze d'onda ottimali per l'eccitazione e l'emissione possono differire per fluorofori specifici. Per il fluorforo FAM, le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione sono rispettivamente di 495 nm e 535 nm. - Definire l'area da visualizzare sullo stage dello scanner laser e selezionare il gel in base alle istruzioni del produttore (Figura 1).
4. Analisi delle immagini e quantificazione del segnale
- Caricare l'immagine digitale acquisita al punto 3.4.5 nel software di procesing delle immagini (vedere Tabella dei materiali).
- Utilizzando il pulsante sinistro del mouse, fare clic e trascinare un rettangolo per definire una casella modello per contrassegnare i contorni dell'immagine gel digitale che verrà utilizzata per quantificare ogni banda di RNA. La banda di RNA vista nella miscela di reazione impostata in assenza di enzima PNK è di solito una buona banda per generare questo modello.
NOTA: Per evitare la distorsione causata dal segnale di fondo, è fondamentale che l'area che circonda ogni banda di RNA misurata sia identica. Per questo motivo, è meglio usare la stessa casella modello per delimitare ogni banda di RNA. - Aprire Gestione ROI in "Strumenti" e contrassegnare la posizione della casella del modello facendo clic su "Aggiungi".
NOTA: i programmi di quantificazione possono anche disegnare automaticamente le caselle seguendo il manuale dell'utente del software. - Utilizzando il pulsante sinistro del mouse, fare clic e trascinare la casella del modello sulla banda RNA successiva e ripetere il passaggio 4.3. Continuare questo processo fino a quando non è stata contrassegnata la posizione di tutte le bande di RNA non fosforilate e fosforilate in ogni reazione.
- Misurare la densità integrata all'interno di ogni casella facendo clicsu" Misura " in Gestione ROI.
- Per calcolare la quantità relativa di RNA fosforilato in una reazione, dividere la densità integrata della banda di RNA fosforiata per la somma delle densità integrate delle bande di RNA non fosforilate e fosforilate dalla stessa reazione. Questo approccio può essere applicato anche per calcolare la quantità relativa di RNA non fosforilato.
- Per visualizzare l'accumulo di prodotto fosforilato dell'RNA e il corrispondente esaurimento del substrato di RNA non fosforilato nella serie di concentrazioni ATP, tracciare la quantità relativa di RNA calcolata al punto 4.6 rispetto alla concentrazione di ATP.
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Representative Results
Nella Figura 1è illustrato un gel rappresentativo di successo di una titolazione di ATP con una quantità fissa di complesso Las1-Grc3 . L'aggiunta dell'enzima ha portato alla scissione dell'RNA mediata da Las1 del substrato di RNA SC-ITS2, portando a un frammento di RNA definito (5-OH C2 RNA). Dopo l'aggiunta di ATP, il frammento di RNA C2 è stato fosforilato da Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Nei gel denaturing l'RNA fosforilato migra più velocemente della sua controparte non misforicolata. Come illustrato nella Figura 2, la fosforilazione del frammento di RNA C2 potrebbe essere visualizzata tracciando la quantità relativa di RNA C2 non fosforilato e fosforylated rispetto alla concentrazione ATP. Grc3 PNK ha anche fosforilato la 5-end del substrato SC-ITS2 non tagliato, anche se a un tasso inferiore. Questo conferma il lavoro precedente suggerendo Grc3 PNK mostra la preferenza substrato verso il suo substrato RNA C224. Nella Figura 3 è illustrato un gel di denaturazione non riuscito. Questo gel non ha avuto successo perché il substrato RNA 21 nt conteneva prodotti di degradazione (Figura 3, prima corsia). Questi prodotti di degradazione si sovrapponevano al prodotto fosforilato e rendevano impossibile quantificare con precisione la fosforilazione. Al contrario, il prodotto di degradazione dell'RNA più corto(Figura 3, frecce grigie) potrebbe essere analizzato con successo perché questa area del gel non conteneva altre specie di RNA che ostacolavano la quantificazione accurata della sua controparte fosforicolata. Per evitare bande di degradazione dell'RNA, mantenere lo spazio di lavoro e le soluzioni senza RNase e limitare il numero di cicli di congelamento dell'RNA.
Figura 1: Esempio di denaturazione dell'analisi del gel dell'RNA fosforilato. Analisi della chinasi dell'RNA in vitro di Las1-Grc3 (110 nM) incubato con 500 nM SC-ITS2 RNA. X segna la reazione di controllo senza Las1-Grc3 e il triangolo nero rappresenta la titolazione di ATP da 0-10 mM. L'RNA C2 è il risultato della scissione dell'RNA SC-ITS2 da parte della nucleasi Dis1 ed è il substrato endogeno per l'attività Grc3 PNK. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione della fosforilazione dell'RNA. Trama densiometrica dell'attività di chinasi RNA RNA Las1-Grc3 espressa come percentuale di RNA C2 non fosforilato (linea grigia; 5-OH C2 RNA) e RNA C2 fosforylated (linea marrone; 5-P C2 RNA) in una serie di concentrazioni ATP. Le barre di errore contrassegnano la deviazione standard da tre repliche tecniche indipendenti. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di analisi del gel di denaturazione non riuscita dell'RNA fosforilato. Analisi della chinasi dell'RNA in vitro di T4 PNK (0-0,625 U) incubato con 5 m 21 nt RNA. X segna la reazione di controllo senza T4 PNK. Questo controllo solo dell'RNA contiene prodotti RNA degradati che rendono impossibile distinguere il prodotto fosforilato da 21 nt dal prodotto di degradazione (frecce nere). La fosforilazione del prodotto di degradazione dell'RNA più corto (frecce grigie) può essere analizzata, perché non ci sono prodotti di dedradazione che si sovrappongono alla sua controparte fosforicolata. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sequenza (5'→3') | Codice Oligo | fonte | |
| SC-ITS2 | GUCGUUUUAGGUUUUAC CAACUGCGGC/36-FAM/ |
mp 911 | (Pillon et al. NSMB 2019) 26 anni |
| C2 RNA | GGUUUUACCAACUG CGGC/36-FAM/ |
N/A | Prodotto di scissione Las1 di SC-ITS2 |
| 21-nt | ACGUACGCGGAA UACUUCGAA/36-TAMSp/ |
mp 596 | (Pillon et al. RNA, 2018) Il numero 24 del 24 |
Tabella 1: substrati di RNA con etichetta fluorescente.
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Discussion
Descritto è un saggio per misurare l'attività della chinasi di Grc3 PNK su substrati nucleotidi etichettati fluorescentemente. Questo protocollo può essere applicato per caratterizzare altri enzimi PNK adattando il buffer di reazione e il substrato di oligonucleotide. Ad esempio, il protocollo richiede una quantità di traccia di EDTA. L'aggiunta di EDTA è vantaggiosa per due motivi: in primo luogo, questo approccio favorisce Grc3 legato al magnesio impedendo all'enzima di legarsi alla traccia di tracce di metalli contaminanti nella miscela. In secondo luogo, una piccola quantità di EDTA inibisce l'attività di contaminare le ribonucleasi dipendenti dal metallo senza interrompere l'attività della ribonucleasi indominabile in metallo las1 associata. La concentrazione di EDTA può essere alterata a seconda della fonte del PNK specifico. Questo saggio fornisce anche un vantaggio rispetto ai tradizionali saggi di fosforilazione PNK che si basano su oligonucleotidi etichettati con radioisotopi di breve durata (cioè, 2 settimane di emituzione per fosforo-32). Questo protocollo può essere adattato per misurare l'attività enzimatica specifica e la cinetica Michaelis-Menten, nonché determinare la dipendenza della fosforilazione da vari parametri, come la natura dei nucleotidi, substrati e ioni metallici.
Questo protocollo si basa sull'esecuzione di grandi gel di poliacrilamide denaturanti al fine di ottenere una risoluzione sufficiente per distinguere un substrato non fosforilato dal suo prodotto fosforilato. Versare e maneggiare questi gel sono passaggi critici nel protocollo. Ad esempio, la soluzione di acrilammide deve essere riscaldata per sciogliere l'urea e poi raffreddata lentamente prima di versare il gel. Raffreddare questa soluzione troppo rapidamente può portare alla formazione di cristalli. È inoltre necessario fare attenzione a evitare l'introduzione di bolle d'aria e polvere durante la colata e l'impostazione del gel. Si consiglia di creare la risonanza del gel senza rimuovere le lastre di vetro per evitare di strappare il gel, che è sottile e difficile da maneggiare una volta rimosso dalle lastre di vetro.
Questo protocollo può essere adattato per misurare la fosforilazione di substrati oligonucleotidi di diverse dimensioni. Questo particolare saggio ha utilizzato un gel di acrilammide del 15% per ottenere la risoluzione della fosforilazione di substrati da 27 nt (SC-ITS2 RNA) e 18 nt (C2 RNA). L'aggiunta di un gruppo di fosfati alla 5-end dell'RNA SC-ITS2 produce un cambiamento modesto rispetto al cambiamento di mobilità indotto al 5-fosforilazione del più corto C2 RNA (Figura 1). Ciò evidenzia una limitazione nella lunghezza dell'RNA quando si utilizza questa tecnica. Con substrati di RNA più lunghi, il contributo di un gruppo di fosfati al peso molecolare complessivo della specie di RNA è diminuito. Per questo motivo, la percentuale di acrilammide e il tempo di esecuzione del gel possono essere ottimizzati per ottenere la risoluzione di substrati di dimensionidiverse 29. In generale, percentuali più elevate di acrilammide sono utilizzate per i substrati di oligonucleotide più piccoli, mentre percentuali più basse di acrilammide (fino all'8%) fornire una migliore risoluzione dei substrati oligonucleotidi più grandi.
La limitazione principale di questo analisi è che si tratta di bassa velocità effettiva. Versare ed eseguire gel denaturing richiede una notevole quantità di tempo, limitando il numero di gel e campioni che possono essere analizzati in un giorno. Una futura applicazione per superare questa limitazione potrebbe essere lo sviluppo di chip microfluidici in grado di risolvere i prodotti oligonucleotidi fosforilati. L'elettroforesi gel a base di microfluidi ha molti vantaggi rispetto all'elettroforesi gel tradizionale, come le dimensioni del campione più piccole, l'automazione e la velocità. Tuttavia, gli attuali chip microfluidico non hanno una singola risoluzione nucleotide. In conclusione, l'uso di denaturazione dell'elettroforesi gel per rilevare la migrazione alterata di oligonucleotidi nonradioattivi fornisce una tecnica utile per monitorare i requisiti catalitici e la preferenza substrata degli enzimi chinasi polinucleotidi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski per la loro lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health Intramural Research Program degli Stati Uniti; Istituto Nazionale delle Scienze della Salute Ambientale degli Stati Uniti (NIEHS; ES103247 a R.E.S) e i Canadian Institutes of Health Research (CIHR; da 146626 a M.C.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
