Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61258
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

يصف هذا البروتوكول مقايسة غير نشطة لقياس نشاط كيناز من كينازات البولي نوكليوتيد (PNKs) على ركائز الحمض النووي والحمض النووي الريبي الصغيرة.

Abstract

الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNKs) هي إنزيمات تحفز الفسفر من نهاية الهيدروكسيل 5 'من الحمض النووي والحمض النووي الريبي oligonucleotides. ويمكن قياس نشاط الـ PNK باستخدام نهج مباشرة أو غير مباشرة. يُعرض هنا نهج مباشر في المختبر لقياس نشاط PNK الذي يعتمد على الركيزة القلوية ذات التسمية الفلورية وأوليغونوكليوتيد وبوليكريلاميد هلام الكهرباء. يوفر هذا النهج القرار من المنتجات الفوسفورية مع تجنب استخدام ركائز radiolabeled. البروتوكول تفاصيل كيفية إعداد تفاعل الفوسفور، وإعداد وتشغيل المواد الهلامية بوليكلايد كبيرة، وقياس منتجات التفاعل. الجزء الأكثر تحديا من الناحية الفنية من هذا المقايسة هو صب وتشغيل المواد الهلامية بوليكريلايد كبيرة; وبالتالي، يتم توفير تفاصيل هامة للتغلب على الصعوبات المشتركة. تم تحسين هذا البروتوكول لGrc3، وهو PNK الذي يتجمع في مجمع معالجة الحمض النووي الريبي الإلزامي مع شريكه الملزم، النوى Las1. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لقياس نشاط الإنزيمات PNK الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الفحص لتحديد آثار مختلف مكونات التفاعل، مثل ثلاثي الفوسفات النووي، والأيونات المعدنية، وأوليغونوكليوتيدات.

Introduction

3- تلعب الكنايات المتعددة النوكليوتيدات (PNK) أدواراً حاسمة في العديد من مسارات معالجة الحمض النووي والحمض النووي الريبي ( DNA) ، مثل إصلاح الحمض النووي وتجميع الريبوسوم1،2،3،4،5. هذه الإنزيمات الأساسية تحفز نقل محطة (غاما) أحادي الفوسفات من ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد (NTP، في معظم الأحيان ATP) إلى نهاية الهيدروكسيل 5 'من الركيزة النيوكليوتيد. واحدة من أكثر PNKs تتميز بشكل جيد هو bacteriophage T4 PNK ، التي لديها خصوصية الركيزة العريضة وتستخدم بشكل كبير من قبل مختبرات البيولوجيا الجزيئية لدمج تسميات النظائر المشعة على 5 ذرة من الحمض النووي أو الركيزة RNA6،7،8،9،10،,12.11 مثال آخر من إنزيم PNK هو CLP1، الذي تم العثور عليه في Eukarya، Eubacteria، و Archaea، وتورط في عدة مسارات معالجة الحمض النووي الريبي4،13،14،15.

تاريخيا، معظم المقايسات التي تقيس نشاط كيناز متعدد النوكليوتيد تعتمد على وضع العلامات النظائر المشعة والتصوير الذاتي اللاحق5،16. في السنوات الأخيرة تم تطوير عدد من المقايسات إضافية لقياس نشاط PNK، بما في ذلك نهج جزيء واحد، electrophoresis رقاقة، منارات الجزيئية، وكذلك colorimetric والإنارة المستندة إلىالمقايسات 17،18،19،20،21،22. وفي حين أن العديد من هذه النهج الجديدة توفر حدوداً معززة للكشف وتتجنب استخدام النشاط الإشعاعي، فإن لكل منها عيوباً، مثل التكلفة والاعتماد على الراتنج غير المُجَدَّد، والقيود المفروضة على اختيار الركيزة.

Grc3 هو كيناز متعدد النوى التي تلعب دورا محوريا في معالجة ما قبل الريبوزوم RNA2,3,23. Grc3 يشكل مجمع ملزم مع endoribonuclease Las1، الذي يشقوق الداخلية المناسخة 2 (ITS2) من الجيش الملكي النيبالي قبل الريبوسوم3. انشقاق ITS2 بواسطة Las1 يولد منتج إيواء 5 'الهيدروكسيل التي هي في وقت لاحق phosphorylated من قبل kinase Grc33. للتحقيق في النيوكليوتيد وخصوصية الركيزة من Grc3، كان مطلوبا اختبار غير مكلفة التي سمحت باختبار ركائز oligonucleotide مختلفة. ولذلك، تم تطوير مقايسة فوسفيجيلة PNK باستخدام ركائز مسمّاة بالفلورسنت. تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتحديد أن Grc3 يمكن الاستفادة من أي NTP لنشاط نقل الفوسفوريل، ولكن تفضل ATP24. هذا البروتوكول يكيف المقايسة الأصلية لقياس نشاط PNK من Grc3 على تقليد الحمض النووي الريبي لركيزة الحمض النووي الريبي (SC-ITS2، الجدول 1). أحد الجوانب الصعبة لهذا النهج القائم على الفلورسين هو الاعتماد على جلات البولي أكريلاميد الكبيرة لحل ركائز الفوسفور وغير الفوسفورية بشكل فعال. ويوفر البروتوكول تفاصيل محددة حول كيفية صب هذه المواد الهلامية الكبيرة وتجنب المزالق الشائعة عند القيام بذلك.

يتطلب العمل مع الحمض النووي الريبي عناية خاصة لأنه معرض بشدة للتدهور. هناك خطوات وقائية بسيطة يمكن للمرء أن تتخذ للحد من التلوث ريبونوكليس. محطة عمل منفصلة الحمض النووي الريبي التي يمكن علاجها بسهولة مع عامل التنظيف RNase التي تحتوي على مثبطات غالبا ما تكون مفيدة. من الضروري ارتداء القفازات دائمًا عند التعامل مع العينات واستخدام المواد الاستهلاكية المعتمدة الخالية من RNase. لأن المياه هي مصدر آخر للتلوث، فمن الأفضل استخدام المياه النقية الطازجة وتعقيم جميع الحلول باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- الإعداد

  1. إعداد المخزن المؤقت والكواشف.
    1. جعل 1x التفاعل العازلة من خلال الجمع بين 20 ميكرولتر من 1 م تريس (درجة مئوية = 8.0)، 40 ميكرولتر من 5 م كلوريد الصوديوم، 2.5 ميكرولتر من 2 م كلوريد المغنيسيوم، 100 ميكرولتر من 50٪ (الخامس / الخامس) الجلسرين، والمياه الخالية من RNase للوصول إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.
    2. جعل صبغة تحميل اليوريا عن طريق الجمع بين 4.8 غرام من اليوريا، 200 ميكرولتر من 1 م تريس (pH = 8.0)، 20 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (pH = 8.0)، 0.5 مل من 1٪ (ث / الخامس) الأزرق البروموفينول، والمياه الخالية من RNase لتصل إلى حجم إجمالي قدره 10 مل.
    3. جعل 10x TBE العازلة من خلال الجمع بين 108 غرام من قاعدة تريس، 55 غرام من حمض البوريك، 40 مل من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة = 8.0)، والمياه الخالية من RNase لتصل إلى حجم إجمالي 1 لتر.
    4. جعل 10٪ (ث / الخامس) persulfate الأمونيوم (APS). تزن 0.5 غرام من وكالة الأنباء الجزائرية وإضافة 3 مل من الماء RNase خالية من أجل حل الصلبة. إضافة مياه خالية من RNase لتصل إلى حجم إجمالي قدره 5 مل. لف الأنبوب في احباط وتخزين الحل في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تذوب APS مع مرور الوقت. استبدال 10٪ APS الأسهم كل 2 أسابيع.
  2. الحصول على إنزيم كيناز متعدد النوى.
    1. الحصول على نقية Las1-Grc3 PNK انزيم2 المخزنة في التفاعل العازلة (انظر الخطوة 1.1.1) في تركيز المخزون من 20 μM. سوف تختلف المخزن المؤقت استناداً إلى PNK معينة.
  3. إعداد الركيزة حمض نووي.
    ملاحظة: هذا البروتوكول يرصد 5'-الفوسفور من الركيزة RNA 27 nt التي تؤوي موقع معالجة Las1-Grc3 (موقع C2) الواردة في Saccharomyces cerevisiae قبل الريبوسوم الداخلية المناسخة 2 (SC-ITS2؛ انظر الجدول 1),25،26.2
    1. كيميائيا توليف الركيزة RNA oligonucleotide التي تحتوي على نهاية 5'-هيدروكسيل جنبا إلى جنب مع تسمية 3'-fluorescent. وسوف تستخدم الفلوروفور لتصور الجيش الملكي النيبالي. تأكد من وضع الفلوروفور على نهاية الحمض النووي الريبي التي لا تستهدف الفوسفور. كبديل للمصادر التجارية، يمكن تنفيذ وضع العلامات الفلورية الداخلية والمحطة الطرفية لركائز الحمض النووي الريبي في المنزل باستخدام بروتوكولات فعالة من حيث التكلفة27.
    2. إزالة الفلوروفور الزائدة من رد فعل الرنا وضع العلامات بواسطة HPLC تنقية28.
    3. Resuspend الحمض النووي الريبي باستخدام مياه خالية من RNase إلى 500 nM.
    4. تخزين aliquots RNA في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير.
  4. إعداد سلسلة تركيز ATP.
    1. جعل 20 mM المخزون العامل من ATP باستخدام التفاعل العازلة (انظر الخطوة 1.1.1). استخدم هذا المخزون العامل لتوليد أربعة عمليات تخفيف تسلسلية تتراوح بين 20 mM-0.02 mM.
    2. لجعل التخفيف الأول من سلسلة التركيز، مزيج 1 ميكرولتر من 20 mM ATP المخزون العمل مع 9 ميكرولتر من العازلة رد الفعل. وهذا سيؤدي إلى تخفيف 10 أضعاف من ATP مع تركيز النهائي من 2 mM.
    3. استخدم مخزون ATP 2 mM المتولد في الخطوة 1.4.2 لجعل التخفيف التالي في سلسلة التركيز. مزيج 1 μL من 2 mM ATP المخزون مع 9 ميكرولتر من التفاعل العازلة. وهذا سيجعل تركيز سهم ATP جديد من 0.2 mM.
    4. مواصلة التخفيف 1 μL من المخزون ATP السابقة مع 9 ميكرولتر من التفاعل العازلة لجعل الأسهم ATP اللاحقة في سلسلة التركيز.

2. في المختبر RNA كيناز رد فعل

ملاحظة: يمكن استخدام هذا الفحص لقياس عدة متغيرات مثل الوقت، أو مستويات النيوكليوتيدات، أو تركيز الإنزيم. والهدف من هذه التجربة هو تقييم كمية الحمض النووي الريبي الفوسفوري في وجود ثابت Las1-Grc3 المعقدة ومستويات ATP متفاوتة.

  1. لكل تفاعل كيناز RNA-انزيم، الجمع بين 1 ميكرولتر من 500 nM RNA الركيزة، 8.3 ميكرولتر من 130 nM Las1-Grc3، و 0.2 μL من 5 mM EDTA.
    ملاحظة: إذا كان تنفيذ العديد من ردود الفعل، وإعداد مخزون رئيسي من خليط RNA-انزيم و aliquot 9.5 μL من هذا المزيج الرئيسي لكل أنبوب رد فعل.
  2. إبدأ التشايس
    1. تعيين كتلة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    2. في فواصل 10 s، مزيج 0.5 ميكرولتر من واحد ATP substock من سلسلة تركيز ATP أعدت في الخطوة 1.4 مع واحد خليط انزيم RNA ووضع التفاعل في كتلة الحرارة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: إضافة 0.5 μL من العازلة رد فعل بدلا من ATP إلى واحد خليط RNA-انزيم لPNK التحكم السلبي. استخدام آخر السيطرة اللازمة كذلك (أي الركيزة RNA في غياب إنزيم PNK).
    3. احتضان ردود الفعل لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الفلورسنتي المسمى RNA حساس للضوء; لذلك ، تغطية ردود الفعل مع احباط.
    4. باستخدام نفس الترتيب كما هو الحال في الخطوة 2.2.2، إخماد كل رد فعل كل 10 s عن طريق ارتفاع التفاعل مع 10 ميكرولتر من صبغة تحميل اليوريا (انظر الخطوة 1.1.2).
      ملاحظة: بالإضافة إلى 4 م يوريا، يمكن إضافة البروتين K في هذه الخطوة لتحلل إنزيم. اتبع التعليمات التي يقدمها المورد لتحديد كمية البروتياز المطلوبة وظروف التفاعل.
    5. استخدام ردود الفعل في المختبر في المختبر RNA كيناز فورا لتحليل المصب (انظر القسم 3) أو تخزين في -20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.

3. جل الكهرباء

  1. إعداد 15٪ أكريلاميد/8 م محلول هلام اليوريا.
    تنبيه: يجب التعامل مع الأكريلاميد بعناية، لأنه سم عصبي. ارتدي دائماً القفازات ومعطف المختبر ونظارات واقية عند التعامل معها.
    1. في كوب زجاجي 150 مل، والجمع بين 22.5 مل من premixed 40٪ الأكريلاميد / bis-أكريلاميد 29:1 الحل، 6 مل من 10x TBE (انظر الخطوة 1.1.3)، 28.8 غرام من اليوريا، والمياه الخالية من RNase إلى حجم إجمالي قدره 59 مل. يحرك بلطف الحل.
      ملاحظة: اعتمادا على طول الركيزة RNA، تغيير النسبة المئوية من polyacrylamide قد يحسن القرار بين الحمض النووي الريبي غير مففوريريلات.
    2. لإذابة اليوريا، قم بسخّن المحلول في الميكروويف لمدة 20 s، حرك السائل، ثم وضع المحلول مرة أخرى في الميكروويف لمدة 20 s أخرى. يحرك بلطف الحل حتى يذوب اليوريا تماما.
    3. ببطء تبريد الحل عن طريق وضع كوب الزجاج في حمام المياه الضحلة التي تحتوي على الماء البارد. تأكد من أن مستوى الماء البارد المحيط بكأس كوب فوق مستوى المحلل داخل كوب الزجاج. وهذا من شأنه أن يعزز كفاءة نقل الحرارة. انتظر 5 دقائق.
      ملاحظة: لا تستمر مع هذا البروتوكول إذا كان كوب الزجاج يشعر دافئ; يجب أن يكون الماء أقل من 25 درجة مئوية. إذا كان لا يزال يشعر دافئ بعد 5 دقائق، ثم استبدال الماء في حمام الماء مع الماء البارد العذب وانتظر آخر 5 دقائق.
    4. تصفية وإزالة الحل باستخدام وحدة الترشيح 0.22 ميكرومتر المتاح لإزالة الجسيمات وفقاعات الهواء المجهرية.
  2. صب هلام denaturing.
    1. استخدم الصابون والماء الدافئ لتنظيف لوحة زجاجية قصيرة وطويلة مصممة للجلات ذات الأبعاد الإجمالية 31.0 سم × 38.5 سم. رش كل لوحة زجاجية مع الإيثانول 95٪ ومسح الزجاج لإزالة أي رطوبة.
      ملاحظة: يمكن أن تكون إحدى اللوحتين مُصفّتين لمنع تلف الجل عند فصل شطيرة الصفيحة الزجاجية. ومع ذلك، هذه الخطوة غير ضرورية لأن هذا البروتوكول تم تصميمه لتصور RNA دون فصل لوحات الزجاج.
    2. وضع لوحة زجاجية طويلة أفقيا على رأس مربع حتى يتم رفعها قبالة benchtop.
      تنبيه: الأكريلاميد سام، وبالتالي يجب تغطية محطة صب الجل في ورقة مقاعد البدلاء التي يمكن أن تمتص أي سائل منسكبة ويتم وضعها على الفور في كيس نفايات بعد اكتمال الإجراء.
    3. ضع 0.4 مم نظيفة على طول حواف طويلة من لوحة زجاجية طويلة.
    4. وضع لوحة زجاجية قصيرة فوق لوحة طويلة وضمان حواف لوحة قصيرة، لوحة طويلة، ويتم محاذاة الفواصل. المشبك كل جانب باستخدام ثلاثة المشابك المعدنية متباعدة بالتساوي.
    5. إضافة 24 μL من TEMED إلى 15٪ من محلول أكريلاميد/8 م يوريا المعدة في الخطوة 3.1 وخلط الحل.
    6. أضف 600 ميكرولتر من 10% (w/v) APS (انظر الخطوة 1.1.4) إلى الحل في الخطوة 3.2.5 ومزج الحل بلطف.
    7. صب على الفور الحل بين لوحات الزجاج.
      ملاحظة: لتجنب الفقاعات، انقر على الزجاج كما يتم صب الحل.
    8. إضافة بعناية نظيفة، 0.4 ملم، 32 مشط جيدا إلى الجزء العلوي من شطيرة لوحة زجاجية.
    9. السماح بحد أدنى من 30 دقيقة لالكريلاميد البلمرة.
  3. تشغيل هلام denaturing.
    1. تعيين كتلة الحرارة إلى 75 درجة مئوية.
    2. إزالة المشابك المعدنية عقد شطيرة لوحة الزجاج معا وغسل جيدا وتجفيف شطيرة لوحة الزجاج.
    3. ضع شطيرة لوحة الزجاج في جهاز الجل مع لوحة قصيرة تواجه الداخل.
    4. إعداد 0.5x TBE تشغيل العازلة من خلال الجمع بين 100 مل من TBE 10x مع 1.9 L RNase خالية من المياه. إضافة 600 مل من المخزن المؤقت تشغيل إلى الغرف العلوية والسفلى من جهاز هلام.
    5. قم بإزالة المشط بلطف وشطف الآبار بدقة باستخدام حقنة.
      ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لإزالة اليوريا من الآبار.
    6. تشغيل ما قبل هلام لمدة 30 دقيقة في 50 W. الجهد هو ما يقرب من 2000 V.
      تنبيه: يعمل هذا الجهاز الجل في قوة واط عالية والمستخدمين يجب أن تظهر الاحتياطات.
    7. شطف الآبار بدقة باستخدام حقنة.
      ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لتحميل حتى عينة في الآبار.
    8. نبض تدور ردود الفعل مطفأة من الخطوة 2.2.5. ثم احتضان الأنابيب في 75 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. كرر نبض تدور.
    9. على الفور تحميل 10 ميكرولتر من العينة في بئر وتشغيل هلام لمدة 3 ساعة في 50 W.
      ملاحظة: الفلورسنتي المسمى RNA حساس للضوء; لذلك، تغطية الجهاز هلام مع احباط.
  4. صورة هلام denaturing.
    1. إيقاف التيار الكهربائي واستنزاف الغرفة العليا للجهاز هلام.
    2. غسل وتجفيف الجانب الخارجي من شطيرة لوحة الزجاج باستخدام الصابون والماء. تغطية شطيرة لوحة الزجاج مع احباط أثناء نقل هلام.
    3. قم بتركيب شطيرة لوحة الزجاج على خشبة ماسح ليزر قادر على الكشف عن الفلورس الكمية والحساسة.
      ملاحظة: هذا الجل هو رقيقة للغاية لأقصى دقة. لهذا السبب، تم تصميم هذا البروتوكول لتجنب صعوبات إزالة الجل من شطيرة لوحة الزجاج عن طريق تصور مباشرة الحمض النووي الريبي الفلوري المسمى من خلال لوحات الزجاج. ومن ثم فإن استخدام الألواح الزجاجية المنخفضة الفلورية المتاحة تجارياً سيزيد الإشارة الملتقطة عن طريق تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    4. تعيين الإثارة وأطوال موجية الانبعاثات من الماسح الضوئي بالليزر للفلوروفور المطلوب.
      ملاحظة: قد تختلف الإثارة المثلى وأطوال الانبعاثات الموجية بالنسبة للفلوروفوريس المحددة. وبالنسبة لفلوروفور FAM، تبلغ الأطوال الموجية للانبعاثات والإثارة 495 نانومتر و535 نانومتر على التوالي.
    5. تحديد المنطقة التي سيتم تصورها على مرحلة الماسح الضوئي بالليزر وصورة هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 1).

4- تحليل الصور وتقدير كمية الإشارات

  1. قم بتحميل صورة الجل الرقمي المكتسبة في الخطوة 3.4.5 في برنامج procesing للصور (انظر جدول المواد).
  2. باستخدام الزر الأيسر للماوس، انقر واسحب مستطيل لتحديد مربع قالب لوضع علامة على الحدود على الصورة هلام الرقمية التي سيتم استخدامها لتحديد كل نطاق RNA. الفرقة RNA ينظر في خليط التفاعل في مجموعة في غياب إنزيم PNK عادة ما تكون الفرقة جيدة لتوليد هذا القالب.
    ملاحظة: لتجنب التحيز الناتج عن إشارة الخلفية، من المهم أن تكون المنطقة المحيطة بكل نطاق RNA متطابقة. لهذا السبب، من الأفضل استخدام نفس مربع القالب لترسيم كل نطاق RNA.
  3. فتح مدير ROI تحت "أدوات" ووضع علامة على موقف مربع القالب بالنقر فوق "إضافة".
    ملاحظة: يمكن أيضاً رسم برامج الكمية مربعات تلقائياً بعد دليل مستخدم البرامج.
  4. باستخدام الزر الأيسر من الماوس، انقر واسحب مربع القالب إلى الفرقة RNA المقبلة وكرر الخطوة 4.3. Continute هذه العملية حتى تم وضع موقف جميع غير فوسفوريريلات رنا العصابات في كل رد فعل قد وضعت.
  5. قياس الكثافة المتكاملة داخل كل مربع عن طريق النقر فوق "قياس" في مدير ROI.
  6. لحساب الكمية النسبية من الحمض النووي الريبي الفوسفوري في رد فعل، تقسيم الكثافة المتكاملة من الفرقة الحمض النووي الريبي الفوسفوري على مجموع الكثافات المتكاملة من غير فوسفوري العصابات الحمض النووي الريبي والفوسفورية من نفس التفاعل. ويمكن أيضا أن يطبق هذا النهج لحساب المبلغ النسبي للرنا غيرphosphorylated.
  7. لتصور تراكم الرنا الفوسفوري المنتج واستنزاف المقابلة من الركيزة الحمض النووي الريبي غيرphosphorylated عبر سلسلة تركيز ATP، رسم المبلغ النسبي للرنا المحسوبة في الخطوة 4.6 ضد تركيز ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر في الشكل 1هلام denaturing ممثل ناجح من المعايرة من ATP مع كمية ثابتة من مجمع Las1-Grc3 . إضافة انزيم أدى إلى انشقاق RNA بوساطة لاس1 من الركيزة الحمض النووي الريبي SC-ITS2، مما أدى إلى جزء RNA محدد (5-OH C2 RNA). عند إضافة ATP، تم فسفور شظايا الحمض النووي الريبي C2 بواسطة Grc3 PNK (5-P C2 RNA). في الهلام الهلامي النافورج ينجر الرنا أسرع من نظيره غيرphosphorylated. كما هو مبين في الشكل 2، يمكن تصور الفوسفور من ج2 RNA جزء من رسم المبلغ النسبي للRNA C2 غيرphophorylated وفسفورية ضد تركيز ATP. Grc3 PNK أيضا الفوسفور 5-نهاية الركيزة SC-ITS2 غير المصقول، وإن كان بمعدل أقل. هذا يؤكد العمل السابق مما يوحي Grc3 PNK يظهر تفضيل الركيزة نحو الركيزة C2 RNA24. يظهر هلام denaturing غير ناجحة في الشكل 3. وكان هذا الجل غير ناجحة لأن الركيزة RNA 21 nt تحتوي على منتجات التحلل(الشكل 3، المسار الأول). وتداخلت هذه المنتجات المتحللة مع المنتج الفوسفوري وجعلت من المستحيل تحديد الفوسفور بدقة. وعلى النقيض من ذلك، فإن أقصر منتج لتحلل الحمض النووي الريبي(الشكل 3،السهام الرمادية) يمكن تحليله بنجاح لأن هذه المنطقة من الجل لم تتضمن أي أنواع إضافية من الحمض النووي الريبي تعوق التحديد الكمي الدقيق لنظيرها الفوسفوري. لتجنب RNA ينحلال النطاقات، والحفاظ على مساحة العمل والحلول RNase خالية، والحد من عدد دورات RNA تجميد thaw.

Figure 1
الشكل 1: مثال على تحليل هلام denaturing من الحمض النووي الريبي الفوسفوري. في المختبر الحمض النووي الريبي كيناز المقايسة من Las1-Grc3 (110 nM) محتضنة مع 500 NM SC-ITS2 RNA. X علامات رد فعل التحكم دون Las1-Grc3 ويمثل المثلث الأسود المعايرة ATP من 0-10 mM. C2 RNA هو نتيجة لSC-ITS2 RNA الانقسام من قبل النوى Las1 وهو الركيزة الذاتية لنشاط Grc3 PNK. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: القياس الكمي لفسفور الحمض النووي الريبي. مؤامرة densiometric من نشاط RNA RNA 1-Grc3 كيناز التي أعرب عنها كنسبة مئوية من الحمض النووي الريبي C2 غيرphosphorylated (الخط الرمادي؛ 5-OH C2 RNA) واليوراسيل C2 RNA (خط بني؛ 5-P C2 RNA) عبر سلسلة تركيز ATP. علامات أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من ثلاثة نسخ متماثلة فنية مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على تحليل هلام denaturing غير ناجحة من الحمض النووي الريبي الفوسفوري. في المختبر RNA كيناز المقايس من T4 PNK (0-0.625 U) المحتضنة مع 5 ميكرومتر 21 NT RNA. X علامات رد فعل التحكم دون T4 PNK. هذا RNA فقط يحتوي على السيطرة على المنتجات RNA المتدهورة التي تجعل من المستحيل التمييز بين 21 nt الفوسفورية المنتج من المنتج التحلل (السهام السوداء). ويمكن تحليل الفسفور من أقصر تحلل RNA المنتج (السهام الرمادية)، لأنه لا توجد منتجات التحلل التي تتداخل مع نظيره الفوسفوري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تسلسل (5'→3') رمز أوليغو مصدر
SC-ITS2 GUCGUUUUAGGUUUUAC
CAACUGCGGC/36-FAM/		 mp 911 (بيلون وآخرون. NSMB 2019) 26
C2 RNA GGUUUUACCAACUG
CGGC/36-FAM/		 غير مُنَدِيًا Las1 الانقسام المنتج من SC-ITS2
21-nt ACGUACGCGGAA
UACUUCUCGAA/36-TAMSP/		 النائب 596 (بيلون وآخرون RNA، 2018) 24

الجدول 1: ركائز الحمض النووي الريبي المسماة بالفلورسنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف هو مقايسة لقياس نشاط كيناز من Grc3 PNK على ركائز النيوكليوتيدات الفلورية التي تحمل علامة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوصيف إنزيمات PNK الأخرى عن طريق تكييف العازلة رد الفعل وركيزة القلة. على سبيل المثال، يستدعي البروتوكول كمية من EDTA. إضافة EDTA مفيد لسببين: أولاً، هذا النهج يفضل Grc3 المرتبطة بالمغنيسيوم عن طريق منع الإنزيم من الربط إلى كميات ضئيلة من المعادن الملوثة في الخليط. ثانياً، هناك كمية صغيرة من EDTA تمنع نشاط تلويث الريبونوكleaس المعتمدة على المعادن دون تعطيل نشاط الريبونوكleaز المستقل للمعادن في Las1. ويمكن تغيير تركيز EDTA اعتمادا على مصدر PNK محددة. يوفر هذا الفحص أيضًا ميزة على مقايسات الفوسفور PNK التقليدية التي تعتمد على أوليغونوكليوتيدات ذات نظائر مشعة قصيرة نصف عمر (أي، نصف عمر أسبوعين للفوسفور-32). ويمكن تكييف هذا البروتوكول لقياس نشاط إنزيم معين وحرفية ميخائيليس مينتين وكذلك تحديد اعتماد الفوسفور على معلمات مختلفة، مثل طبيعة النيوكليوتيدات والركائز والأيونات المعدنية.

يعتمد هذا البروتوكول على تشغيل جلات بولياكريلاميد كبيرة من أجل تحقيق دقة كافية لتمييز الركيزة غير الفوفورية عن منتجها الفوسفوري. صب ومعالجة هذه المواد الهلامية هي خطوات حاسمة في البروتوكول. على سبيل المثال، يجب تسخين محلول الأكريلاميد لتذويب اليوريا ثم تبريده ببطء قبل صب الجل. تبريد هذا الحل بسرعة كبيرة جدا يمكن أن يؤدي إلى تشكيل بلورات. يجب أيضا توخي الحذر لتجنب إدخال فقاعات الهواء والغبار في حين صب وتحديد هلام. يُنصح بتصوير الجل دون إزالة الألواح الزجاجية لتجنب تمزيق الجل، وهو رقيق ويصعب التعامل معه بمجرد إزالته من اللوحات الزجاجية.

ويمكن تكييف هذا البروتوكول لقياس الفوسفور من ركائز oligonucleotide مختلفة الحجم. استخدم هذا المقايسة خاصة 15٪ هلام الاكريلاميد لتحقيق قرار من الفوسفور من 27 NT (SC-ITS2 RNA) و 18 NT (C2 RNA) ركائز. إضافة مجموعة فوسفات واحدة إلى نهاية 5 من SC-ITS2 الجيش الملكي النيبالي ينتج تحول متواضع بالمقارنة مع تغيير التنقل الناجمة عن 5-الفوسفور من الرنا C2 أقصر(الشكل 1). وهذا يبرز قيد في طول RNA عند استخدام هذه التقنية. مع ركائز الحمض النووي الريبي أطول، وتضاءل مساهمة مجموعة الفوسفات في الوزن الجزيئي العام للأنواع الحمض النووي الريبي. لهذا السبب، يمكن أن تكون الأمثل النسبة المئوية من الاكريلاميد وكذلك الهلام تشغيل الوقت لتحقيق قرار من ركائز مختلفة الحجم29. بشكل عام، تستخدم نسب أعلى من الأكريلاميد لركائز أقل أليوغنوكليوتيدات بينما تنخفض النسب المئوية من الأكريلاميد (إلى 8%) توفير قرار أفضل من ركائز oligonucleotide أكبر.

القيد الرئيسي لهذا المقايسة هو أنه منخفض الإنتاجية. صب وتشغيل المواد الهلامية denaturing يستغرق قدرا كبيرا من الوقت، والحد من عدد من المواد الهلامية والعينات التي يمكن تحليلها في يوم واحد. ويمكن أن يكون أحد التطبيقات المستقبلية للتغلب على هذا القيد هو تطوير رقائق الميكروفلوياميك القادرة على حل منتجات القلاغوت الفوسفورية. ميكروفلوريميك القائم على جل الكهربائي لديها العديد من المزايا على الكهربائي هلام التقليدية، مثل أصغر حجم العينة، والأتمتة، والسرعة. ومع ذلك، رقائق microfluidic الحالية لم يكن لديك قرار النيوكليوتيدات واحد. في الختام، فإن استخدام الديل الكهربائي للكشف عن الهجرة المتغيرة من القلوى القلويين غير النشطين يوفر تقنية مفيدة لرصد المتطلبات الحفازة وتفضيل الركيزة من إنزيمات كيناز البولي نويات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتور أندرو سيكيما وأندريا كامينسكي على قراءتهما النقدية لهذه المخطوطة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني الأمريكي لبرنامج البحوث الصحية الداخلية؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (NIEHS) ZIA ES103247 إلى R.E.S) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR; 146626 إلى M.C.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

الكيمياء الحيوية، الإصدار 159، الكناز المتعدد النوى، هلام البولي أكريلاميد، تفاعل نقل الفوسفوريل، فوسفورل الحمض النووي الريبي، Grc3، فحص غير نشط
مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillon, M. C., Stanley, R. E.… More

Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter