यह प्रोटोकॉल छोटे डीएनए और आरएनए सब्सट्रेट्स पर पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) की किनेज़ गतिविधि को मापने के लिए एक गैर-रेडिक परख का वर्णन करता है।
पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) एंजाइम हैं जो डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के 5 हाइड्रोक्सिल छोर के फॉस्फोरिलेशन को उत्प्रेरित करते हैं। पीएनके की गतिविधि को प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष दृष्टिकोणों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत पीएनके गतिविधि को मापने के लिए एक प्रत्यक्ष, इन विट्रो दृष्टिकोण है जो फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट और पॉलीएक्रेलिमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पर निर्भर करता है। यह दृष्टिकोण रेडियोलेबल सब्सट्रेट्स के उपयोग से बचते हुए फॉस्फोरिलेटेड उत्पादों का समाधान प्रदान करता है। प्रोटोकॉल विवरण कैसे फॉस्फोरिलेशन प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, तैयार करने और बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल चलाने के लिए, और प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा। इस परख का सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हिस्सा बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल को डालना और चलाना है; इस प्रकार, सामान्य कठिनाइयों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण विवरण प्रदान किए जाते हैं। इस प्रोटोकॉल को Grc3 के लिए अनुकूलित किया गया था, एक पीएनके जो अपने बाध्यकारी साथी, लास1 नाभिक के साथ एक अनिवार्य पूर्व-रिबोसोमल आरएनए प्रसंस्करण परिसर में इकट्ठा होता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को अन्य PNK एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस परख को प्रतिक्रिया के विभिन्न घटकों के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, जैसे न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट, धातु आयन, और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड।
पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेसेस (पीएनके) डीएनए की मरम्मत और राइबोसोम असेंबली1,2,,3,,4,5जैसे कई डीएनए और आरएनए प्रसंस्करण मार्गों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं।, ये मौलिक एंजाइम एक न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (एनटीपी, अक्सर एटीपी) से टर्मिनल (गामा) मोनोफॉस्फेट के हस्तांतरण को न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट के 5 ‘ हाइड्रोक्सिल छोर में उत्प्रेरित करते हैं। सबसे अच्छी तरह से विशेषता वाले पीएनके में से एक बैक्टीरियोफेज टी 4 पीएनके है, जिसमें व्यापक सब्सट्रेट विशिष्टता है और आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा डीएनए या आरएनए सब्सट्रेट6,7,8,,,,,9,,11,12के 5 टर्मिनस पर रेडियोधर्मी आइसोटोप लेबल को शामिल करने के लिए भारी उपयोग कियाजाताहै।, पीएनके एंजाइम का एक अन्य उदाहरण सीएलपी 1 है, जो यूकेरिया, यूबैक्टीरिया और आर्चिया में पाया जाता है, और कई आरएनए प्रसंस्करणमार्गों 4,13,,,14, 15,में फंसायाजाताहै।
ऐतिहासिक रूप से, अधिकांश परखते हैं कि पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ गतिविधि को मापने रेडियोधर्मी आइसोटोप लेबलिंग और बाद में ऑटोरेडियोग्राफी5,,16पर निर्भर हैं। हाल के वर्षों में पीएनके गतिविधि को मापने के लिए कई अतिरिक्त परख विकसित की गई हैं, जिनमें एकल अणु दृष्टिकोण, माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस, आणविक बीकन, साथ ही कोलोरिमेट्रिक और ल्यूमिनेसेंस आधारित परख17,18,,,19,,20, 21,,,2222शामिल हैं। जबकि इनमें से कई नए दृष्टिकोण बढ़ी हुई पहचान सीमा प्रदान करते हैं और रेडियोधर्मिता के उपयोग से बचते हैं, प्रत्येक में लागत, स्थिर राल पर निर्भरता और सब्सट्रेट विकल्प में सीमाएं जैसी कमियां हैं।
जीआरसी 3 एक पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ है जो प्री-रिबोसोमल आरएनए,2 ,3,23,के प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाताहै। Grc3 एंडोरिबो न्यूक्लियज़ लास1 के साथ एक अनिवार्य परिसर बनाता है, जो प्री-रिबोसोमल आरएनए3के आंतरिक लिखित स्पेसर 2 (ITS2) को क्लीव्स करता है। Las1 द्वारा ITS2 का क्लीवेज एक उत्पाद उत्पन्न करता है जो 5 ‘ हाइड्रोक्सिल को शरण देता है जिसे बाद में जीआरसी 3 किनेज़ 3 द्वारा फॉस्फोरिलेटेड कियाजाताहै। जीआरसी 3 की न्यूक्लियोटाइड और सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच करने के लिए, एक सस्ती परख जो विभिन्न ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के परीक्षण की अनुमति देती थी। इसलिए, फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले सब्सट्रेट्स का उपयोग करके एक पीएनके फॉस्फोरिलेशन परख विकसित की गई थी। इस परख का सफलतापूर्वक उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि जीआरसी 3 फॉस्फोरिल स्थानांतरण गतिविधि के लिए किसी भी एनटीपी का उपयोग कर सकता है, लेकिन एटीपी24के पक्ष में है। यह प्रोटोकॉल अपने प्री-रिबोसोमल आरएनए सब्सट्रेट (एससी-ITS2, टेबल 1)की आरएनए नकल पर Grc3 की PNK गतिविधि को मापने के लिए मूल परख को अनुकूलित करता है। इस फ्लोरेसेंस-आधारित दृष्टिकोण का एक चुनौतीपूर्ण पहलू फॉस्फोरिलेटेड और नॉनफोस्फोरिलेटेड सब्सट्रेट्स को प्रभावी ढंग से हल करने के लिए बड़े पॉलीएक्रीलामाइड जैल पर निर्भरता है। प्रोटोकॉल कैसे इन बड़े जैल डालना है और आम नुकसान से बचने के लिए जब ऐसा करने पर विशिष्ट विवरण प्रदान करता है ।
आरएनए के साथ काम करने के लिए विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है क्योंकि यह गिरावट के लिए दृढ़ता से अतिसंवेदनशील होता है। राइबोन्यूलेज संदूषण को सीमित करने के लिए सरल निवारक कदम उठाए जा सकते हैं। एक अलग आरएनए वर्कस्टेशन जिसे आसानी से आरएनएएस अवरोधक युक्त सफाई एजेंट के साथ इलाज किया जा सकता है, अक्सर सहायक होता है। नमूनों को संभालते समय हमेशा दस्ताने पहनना और RNase-मुक्त प्रमाणित उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग आवश्यक है। क्योंकि पानी संदूषण का एक और आम स्रोत है, यह हौसले से शुद्ध पानी का उपयोग करें और एक ०.२२ μm फिल्टर का उपयोग कर सभी समाधान निष्फल करने के लिए सबसे अच्छा है ।
वर्णित फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स पर Grc3 PNK की काइनेज गतिविधि को मापने के लिए एक परख है। इस प्रोटोकॉल को रिएक्शन बफर और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट को अनुकूल बनाकर अन्य पीएन?…
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ एंड्रयू सिकेमा और एंड्रिया काइनस्की को इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था; अमेरिका के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS; जिया ES103247 से आरईएस) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर; 146626 से एम.C.पी.
0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
ATP | Sigma | A2383-1G | |
boric acid | Sigma | B0394 | |
bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
TEMED | BioRad | 161-0800 | |
tris base | Sigma | TRIS-RO | |
Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
urea | Fisher Chemical | U15-500 |