Summary

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Published: May 08, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l’attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.

Abstract

Le chinasi polinucleotide (PNK) sono enzimi che catalizzare la fosforilazione dell’estremità idrossile 5′ del DNA e dell’RNA oligonucleotidi. L’attività dei PNK può essere quantificata utilizzando approcci diretti o indiretti. Qui è presentato un approccio diretto in vitro per misurare l’attività PNK che si basa su un substrato oligonucleotide etichettato fluorescente e elettroforesi gel poliacrilammide. Questo approccio fornisce la risoluzione dei prodotti fosforilati evitando l’uso di substrati con etichettatura radio. Il protocollo descrive in dettaglio come impostare la reazione di fosforilazione, preparare ed eseguire grandi gel di poliacrilammide e quantificare i prodotti di reazione. La parte più tecnicamente impegnativa di questo saggio è versare ed eseguire i grandi gel di poliacrilammide; vengono quindi forniti dettagli importanti per superare le difficoltà comuni. Questo protocollo è stato ottimizzato per Grc3, un PNK che si assembla in un complesso di elaborazione dell’RNA pre-ribosomico obbligatorio con il suo partner vincolante, il nucleasi Las1. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per misurare l’attività di altri enzimi PNK. Inoltre, questo saggio può anche essere modificato per determinare gli effetti di diversi componenti della reazione, come il triphosfato nucleoside, gli ioni metallici e gli oligonucleotidi.

Introduction

Le chinasi polinucleotide (PNK) svolgono un ruolo fondamentale in molti percorsi di elaborazione del DNA e dell’RNA, come la riparazione del DNA e l’assemblaggio delribosoide 1,2,3,4,5. Questi enzimi fondamentali catalizzano il trasferimento del monofosfato terminale (gamma) da un triphosfato nucleoside (NTP, il più delle volte ATP) all’estremità idrossile da 5′ di un substrato nucleotide. Uno dei PNK più caratterizzati è il batteriofago T4 PNK, che ha un’ampia specificità del substrato ed è fortemente utilizzato dai laboratori di biologia molecolare per incorporare etichette di isotopi radioattivi sul 5 capolinea di un sottostrato DNA o RNA6,7,8,9,10,11,12. Un altro esempio di enzima PNK è CLP1, che si trova in Eukarya, Eubacteria e Archaea, ed è implicato in diversi percorsi di elaborazione dell’RNA4,13,14,15.

Storicamente, la maggior parte dei saggi che misurano l’attività della chinasi polinucleotide dipendono dall’etichettatura degli isotopi radioattivi e dalla successiva autoradiografia5,16. Negli ultimi anni sono stati sviluppati una serie di analisi aggiuntive per misurare l’attività PNK, tra cui approcci a singola molecola, elettroforesi microchip, fari molecolari, così come saggi colorimetrici e a base di luminescenza17,18,19,20,21,22. Mentre molti di questi nuovi approcci forniscono limiti di rilevamento avanzati ed evitano l’uso della radioattività, ognuno presenta svantaggi, come il costo, la dipendenza dalla resina immobilizzata e le limitazioni nella scelta del substrato.

Grc3 è una chinasi polinucleotide che svolge un ruolo fondamentale nella lavorazione dell’RNA pre-ribosomico2,3,23. Grc3 forma un complesso obbligato con l’endoribonuclease Las1, che fasi la Spacer 2 (ITS2) interna trascritta dell’RNA pre-ribosomico3. Cleavage dell’ITS2 di Las1 genera un prodotto che ospita un idrossilo da 5′ che viene successivamente fosforilato dalla chinasi Grc33. Per studiare la specificità nucleotide e substrato di Grc3, è stato necessario un saggio economico che permettesse di testare diversi substrati di oligonucleotide. Pertanto, è stato sviluppato un saggio di fosforilazione PNK utilizzando substrati con etichetta fluorescente. Questo saggio è stato utilizzato con successo per determinare che Grc3 può utilizzare qualsiasi NTP per l’attività di trasferimento del fosforile, ma favorisce ATP24. Questo protocollo adatta il saggio originale per misurare l’attività PNK di Grc3 su un RNA che imita il suo substrato di RNA pre-ribosomico (SC-ITS2, Tabella 1). Un aspetto impegnativo di questo approccio basato sulla fluorescenza è la dipendenza da grandi gel poliacrilammide per risolvere efficacemente i substrati fosforilati e non fosforilati. Il protocollo fornisce dettagli specifici su come versare questi grandi gel ed evitare insidie comuni quando si fa.

Lavorare con l’RNA richiede particolare attenzione perché è fortemente suscettibile alla degradazione. Ci sono semplici misure preventive che si possono adottare per limitare la contaminazione da ribonucleasi. Una postazione di lavoro RNA separata che può essere facilmente trattata con un agente di pulizia contenente inibitori RNase è spesso utile. È necessario indossare sempre i guanti durante la manipolazione dei campioni e l’uso di consumabili certificati senza RNase. Poiché l’acqua è un’altra fonte comune di contaminazione, è meglio usare acqua appena purificata e sterilizzare tutte le soluzioni utilizzando un filtro da 0,22 m.

Protocol

1. Preparazione Preparare buffer e reagenti. Fare 1x Buffer di reazione combinando 20 L di 1 M Tris (pH – 8,0), 40 L di cloruro di sodio 5 M, 2,5 L di 2 M di cloruro di magnesio, 100 L del 50% (v/v) glicerolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 1 mL. Fare il colorante di carico dell’urea combinando 4,8 g di urea, 200 L di 1 M Tris (pH – 8,0), 20 L di 0,5 M EDTA (pH – 8,0), 0,5 mL dell’1% (w/v) di blu bromofenolo e acqua senza RNase per raggiungere un volume totale di 10 mL…

Representative Results

Nella Figura 1è illustrato un gel rappresentativo di successo di una titolazione di ATP con una quantità fissa di complesso Las1-Grc3 . L’aggiunta dell’enzima ha portato alla scissione dell’RNA mediata da Las1 del substrato di RNA SC-ITS2, portando a un frammento di RNA definito (5-OH C2 RNA). Dopo l’aggiunta di ATP, il frammento di RNA C2 è stato fosforilato da Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Nei gel denaturing l’RNA fosforilato migra più velocemente della sua co…

Discussion

Descritto è un saggio per misurare l’attività della chinasi di Grc3 PNK su substrati nucleotidi etichettati fluorescentemente. Questo protocollo può essere applicato per caratterizzare altri enzimi PNK adattando il buffer di reazione e il substrato di oligonucleotide. Ad esempio, il protocollo richiede una quantità di traccia di EDTA. L’aggiunta di EDTA è vantaggiosa per due motivi: in primo luogo, questo approccio favorisce Grc3 legato al magnesio impedendo all’enzima di legarsi alla traccia di tracce di metalli co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Andrew Sikkema e Andrea Kaminski per la loro lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health Intramural Research Program degli Stati Uniti; Istituto Nazionale delle Scienze della Salute Ambientale degli Stati Uniti (NIEHS; ES103247 a R.E.S) e i Canadian Institutes of Health Research (CIHR; da 146626 a M.C.P).

Materials

0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

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Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

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