Detta protokoll beskriver en nonradioactive assay att mäta kinas aktivitet av polynucleotide kinases (PNKs) på små DNA och RNA substrat.
Polynukleotidkinaser (PNKs) är enzymer som katalyserar fosforylering av 5′ hydroxyländen av DNA och RNA oligonukleotider. PK:rnas verksamhet kan kvantifieras med hjälp av direkta eller indirekta tillvägagångssätt. Presenteras här är en direkt, in vitro-strategi för att mäta PNK verksamhet som bygger på en fluorescerande-märkt oligonukleotid substrat och polyakrylamid gel elektrofores. Detta tillvägagångssätt ger upplösning av de fosforylerade produkterna samtidigt som man undviker användning av radiomärkta substrat. Protokollet beskriver hur man ställer in fosforyleringsreaktionen, förbereder och kör stora polyakrylamidgeler och kvantifierar reaktionsprodukterna. Den mest tekniskt utmanande delen av denna analys är hälla och köra de stora polyakrylamide geler; således lämnas viktiga detaljer för att övervinna gemensamma svårigheter. Detta protokoll optimerades för Grc3, en PNK som monterar in i ett obligate pre-ribosomal RNA-bearbeta komplex med dess bindande partner, Las1-nucleaseen. Detta protokoll kan dock anpassas för att mäta aktiviteten hos andra PNK-enzymer. Dessutom kan denna analys också modifieras för att bestämma effekterna av olika komponenter i reaktionen, såsom nukleosidtrifosfat, metalljoner, och oligonukleotider.
Polynukleotid kinaser (PNK) spelar kritiska roller i många DNA och RNA bearbetning vägar, såsom DNA reparation och ribosom montering1,2,3,4,5. Dessa fundamentala enzymer katalyserar överföringen av terminalen (gamma) monofosfat från en nukleosid triphosphate (NTP, oftast ATP) till 5′ hydroxyl slutet av en nukleotid substrat. En av de mest väl karakteriserade PNKs är bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat specificitet och är kraftigt utnyttjad av molekylärbiologiska laboratorier för att införliva radioaktiva isotopetiketter på 5-ändstationen av ett DNA- eller RNA-substrat6,7,8,9,10,11,12. Ett annat exempel på ett PNK-enzym är CLP1, som finns i Eukarya, Eubacteria, och Archaea, och är inblandad i flera RNA bearbetning vägar4,13,14,15.
Historiskt sett är de flesta analyser som mäter polynukleotid kinas aktivitet beroende av radioaktiv isotop märkning och efterföljande autoradiografi5,16. Under de senaste åren har ett antal ytterligare analyser utvecklats för att mäta PNK aktivitet, inklusive enmolekyl metoder, mikrochipelektrofores, molekylära fyrar, samt koloritiska och luminimetriska analyser17,18,19,20,21,22. Medan många av dessa nya metoder ger förbättrade detektionsgränser och undvika användning av radioaktivitet, har var och en nackdelar, såsom kostnad, beroende av immobiliserad harts, och begränsningar i substrat val.
Grc3 är en polynukleotidkinas som spelar en central roll i bearbetningen av pre-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 bildar ett obligate komplex med endoribonucleaseen Las1, som klyver den inre Transkriberade Spacer 2 (ITS2) av pre-ribosomal RNA3. Klyvning av ITS2 genom Las1 genererar en produkt som hyser en 5′ hydroxyl som därefter fosforyleras av Grc3-kinasen3. För att undersöka nukleotid och substrat specificitet Av Grc3, en billig analys som tillät testning av olika oligonukleotid substrat krävdes. Därför utvecklades en PNK fosforyleringsanalys med hjälp av fluorescerande-märkta substrat. Denna analys användes framgångsrikt för att fastställa att Grc3 kan utnyttja någon NTP för fosforyl överföring verksamhet, men gynnar ATP24. Detta protokoll anpassar den ursprungliga analysen för att mäta PNK-aktivitet av Grc3 på en RNA-härma av dess pre-ribosomala RNA-substrat (SC-ITS2, tabell 1). En utmanande aspekt av denna fluorescensbaserade strategi är beroendet av stora polyakrylamidgeler för att effektivt lösa fosforylerade och icke-fosforylerade substrat. Protokollet ger specifika detaljer om hur man häller dessa stora geler och undvika vanliga fallgropar när du gör det.
Att arbeta med RNA kräver särskild omsorg eftersom det är starkt mottagligt för nedbrytning. Det finns enkla förebyggande åtgärder man kan vidta för att begränsa föroreningen av ribonukleas. En separat RNA-arbetsstation som enkelt kan behandlas med ett RNase-hämmare-innehållande rengöringsmedel är ofta till hjälp. Alltid bär handskar när du hanterar prover och användning av RNase-fria certifierade förbrukningsvaror är nödvändig. Eftersom vatten är en annan vanlig föroreningskälla är det bäst att använda nyrenat vatten och sterilisera alla lösningar med hjälp av ett 0,22 μm-filter.
Beskrivs är en analys för att mäta kinas aktivitet av Grc3 PNK på fluorescerande-märkt nukleotid substrat. Detta protokoll kan tillämpas för att karakterisera andra PNK enzymer genom att anpassa Reaction Buffer och oligonukleotid substrat. Till exempel anropar protokollet en spårningsmängd EDTA. Tillsats av EDTA är fördelaktigt av två skäl: För det första gynnar detta tillvägagångssätt magnesium-bundna Grc3 genom att förhindra enzymet från att binda till spårmängder av förorenande metaller i blandn…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Andrew Sikkema och Andrea Kaminski för deras kritiska läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us-medborgareinstitut av miljö- vård- vetenskaper (NIEHS; ZIA ES103247 till R.E.S) och Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 till M.C.P).
0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
ATP | Sigma | A2383-1G | |
boric acid | Sigma | B0394 | |
bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
TEMED | BioRad | 161-0800 | |
tris base | Sigma | TRIS-RO | |
Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
urea | Fisher Chemical | U15-500 |