Presentert her er en protokoll for Pseudomonas aeruginosa infeksjon og phage terapi søknad i cystisk fibrose (CF) sebrafisk embryoer.
Antimikrobiell resistens, en viktig konsekvens av diagnostisk usikkerhet og antimikrobiell overresept, er en stadig mer anerkjent årsak til alvorlige infeksjoner, komplikasjoner og dødelighet over hele verden med stor innvirkning på vårt samfunn og på helsesystemet. Spesielt blir pasienter med nedsatt immunforsvar eller eksisterende og kroniske patologier, som cystisk fibrose (CF), utsatt for hyppige antibiotikabehandlinger for å kontrollere infeksjonene med utseende og diffusjon av multiresistente isolater. Derfor er det et presserende behov for å ta opp alternative terapier for å motvirke bakterielle infeksjoner. Bruk av bakteriofages, de naturlige fiender av bakterier, kan være en mulig løsning. Protokollen som er beskrevet i dette arbeidet beskriver anvendelsen av phage terapi mot Pseudomonas aeruginosa infeksjon i CF sebrafisk embryoer. Sebrafisk embryoer ble infisert med P. aeruginosa for å vise at phage terapi er effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner som det reduserer dødelighet, bakteriell byrde og pro-inflammatorisk immunrespons i CF embryoer.
Phage terapi, bruk av naturlige fiender av bakterier for å bekjempe bakterielle infeksjoner, får fornyet interesse som bakteriell motstand mot antibiotika blir utbredt1,2. Denne terapien, som brukes i flere tiår i Øst-Europa, kan betraktes som en komplementær behandling for antibiotika i herding av lungeinfeksjoner hos pasienter med CF og et mulig terapeutisk alternativ for pasienter smittet med bakterier som er resistente mot alle de som er i brukantibiotika 2,3. Fordelene med antibiotikabehandling er at bakteriofag multipliserer på infeksjonsstedet, mens antibiotika metaboliseres og elimineres fra kroppen4,5. Faktisk har administrasjonen av cocktailer av virulent phages isolert i forskjellige laboratorier vist seg å være effektive i behandling av Pseudomonas aeruginosa infeksjoner i dyremodeller så forskjellige som insekter og pattedyr6,7,8. Phage terapi ble også vist å være i stand til å redusere bakteriell byrde i brannsår infisert med P. aeruginosa og Escherichia coli i en randomisert klinisk studie9.
Sebrafisk (Danio rerio) har nylig dukket opp som en verdifull modell for å studere infeksjoner med flere patogener, inkludert P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus og Burkolderia cepacia12,13. Ved å mikroinjisere bakterier direkte inn iembryoblodsirkulasjonen 14 er det lett å etablere en systemisk infeksjon som motvirkes av sebrafisken medfødt immunsystem, som er evolusjonært bevart med nøytrofiler og makrofaggenerasjon som ligner på det menneskelige motstykket. Videre, i løpet av den første måneden av livet, mangler sebrafiskembryoer den adaptive immunresponsen, noe som gjør dem ideelle modeller for å studere den medfødte immuniteten, som er den kritiske forsvarsmekanismen i menneskeligelungeinfeksjoner 15. Sebrafisk dukket nylig opp som et kraftig genetisk modellsystem for å bedre forstå CF-utbruddet og å utvikle nye farmakologiske behandlinger10,,16,,17. CF sebrafisk modell av cftr knock-down generert med morpholino injeksjon i sebrafisk presenterte en dempet respiratorisk burst respons og redusert nøytrofilmigrasjon 10, mens cftr knock-out fører til nedsatt indre organ posisjon og ødeleggelsen av eksokrin bukspyttkjertelen, en fenotype som speiler menneskelig sykdom16,17. Av størst interesse var funnet at P. aeruginosa bakteriell byrde var betydelig høyere i cftr-tap av funksjon embryoer enn i kontroller ved 8 timer etter infeksjon (hpi), som paralleller resultatene oppnådd med mus og humane bronkial epitelceller2,18.
I dette arbeidet viser vi at phage terapi er effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner i sebrafisk embryoer.
I dette manuskriptet beskrev vi protokollen for å utføre P. aeruginosa (PAO1) infeksjon i sebrafiskembryoer og hvordan man bruker phage terapi med en cocktail av phages tidligere identifisert som i stand til å infisere PAO1 for å løse det. Bruken av bakteriofages som et alternativ til antibiotikabehandling har vært av økende interesse siden de siste årene. Dette skyldes hovedsakelig spredning av multiresistente (MDR) bakterielle infeksjoner, som utgjør et alvorlig problem for folkehelsen. Selvfølgelig …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den italienske cystisk fibrose Foundation (FFC # 22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo og FFC # 23 /2019; Un respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Stereomicroscope | Leica | S9I | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |