Summary

Phage Terapi Søknad om å motvirke Pseudomonas aeruginosa infeksjon i cystisk fibrose sebrafisk embryoer

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

Presentert her er en protokoll for Pseudomonas aeruginosa infeksjon og phage terapi søknad i cystisk fibrose (CF) sebrafisk embryoer.

Abstract

Antimikrobiell resistens, en viktig konsekvens av diagnostisk usikkerhet og antimikrobiell overresept, er en stadig mer anerkjent årsak til alvorlige infeksjoner, komplikasjoner og dødelighet over hele verden med stor innvirkning på vårt samfunn og på helsesystemet. Spesielt blir pasienter med nedsatt immunforsvar eller eksisterende og kroniske patologier, som cystisk fibrose (CF), utsatt for hyppige antibiotikabehandlinger for å kontrollere infeksjonene med utseende og diffusjon av multiresistente isolater. Derfor er det et presserende behov for å ta opp alternative terapier for å motvirke bakterielle infeksjoner. Bruk av bakteriofages, de naturlige fiender av bakterier, kan være en mulig løsning. Protokollen som er beskrevet i dette arbeidet beskriver anvendelsen av phage terapi mot Pseudomonas aeruginosa infeksjon i CF sebrafisk embryoer. Sebrafisk embryoer ble infisert med P. aeruginosa for å vise at phage terapi er effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner som det reduserer dødelighet, bakteriell byrde og pro-inflammatorisk immunrespons i CF embryoer.

Introduction

Phage terapi, bruk av naturlige fiender av bakterier for å bekjempe bakterielle infeksjoner, får fornyet interesse som bakteriell motstand mot antibiotika blir utbredt1,2. Denne terapien, som brukes i flere tiår i Øst-Europa, kan betraktes som en komplementær behandling for antibiotika i herding av lungeinfeksjoner hos pasienter med CF og et mulig terapeutisk alternativ for pasienter smittet med bakterier som er resistente mot alle de som er i brukantibiotika 2,3. Fordelene med antibiotikabehandling er at bakteriofag multipliserer på infeksjonsstedet, mens antibiotika metaboliseres og elimineres fra kroppen4,5. Faktisk har administrasjonen av cocktailer av virulent phages isolert i forskjellige laboratorier vist seg å være effektive i behandling av Pseudomonas aeruginosa infeksjoner i dyremodeller så forskjellige som insekter og pattedyr6,7,8. Phage terapi ble også vist å være i stand til å redusere bakteriell byrde i brannsår infisert med P. aeruginosa og Escherichia coli i en randomisert klinisk studie9.

Sebrafisk (Danio rerio) har nylig dukket opp som en verdifull modell for å studere infeksjoner med flere patogener, inkludert P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus og Burkolderia cepacia12,13. Ved å mikroinjisere bakterier direkte inn iembryoblodsirkulasjonen 14 er det lett å etablere en systemisk infeksjon som motvirkes av sebrafisken medfødt immunsystem, som er evolusjonært bevart med nøytrofiler og makrofaggenerasjon som ligner på det menneskelige motstykket. Videre, i løpet av den første måneden av livet, mangler sebrafiskembryoer den adaptive immunresponsen, noe som gjør dem ideelle modeller for å studere den medfødte immuniteten, som er den kritiske forsvarsmekanismen i menneskeligelungeinfeksjoner 15. Sebrafisk dukket nylig opp som et kraftig genetisk modellsystem for å bedre forstå CF-utbruddet og å utvikle nye farmakologiske behandlinger10,,16,,17. CF sebrafisk modell av cftr knock-down generert med morpholino injeksjon i sebrafisk presenterte en dempet respiratorisk burst respons og redusert nøytrofilmigrasjon 10, mens cftr knock-out fører til nedsatt indre organ posisjon og ødeleggelsen av eksokrin bukspyttkjertelen, en fenotype som speiler menneskelig sykdom16,17. Av størst interesse var funnet at P. aeruginosa bakteriell byrde var betydelig høyere i cftr-tap av funksjon embryoer enn i kontroller ved 8 timer etter infeksjon (hpi), som paralleller resultatene oppnådd med mus og humane bronkial epitelceller2,18.

I dette arbeidet viser vi at phage terapi er effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner i sebrafisk embryoer.

Protocol

Voksen sebrafisk (Danio rerio) fra AB-stammen (European Zebrafish Resource Center EZRC) opprettholdes i henhold til internasjonale (EU-direktiv 2010/63/EU) og nasjonale retningslinjer (italiensk dekret4. mars 2014, n. 26) om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Standardforholdene er satt i fiskeanlegget med en 14 timer lys / 10 h mørk syklus og tankvanntemperatur ved 28 ° C. 1. Utarbeidelse av løsninger og verktøy Klargjør en 50x lagerlø…

Representative Results

Resultater og tall presentert her er referert til CF embryoer generert gjennom injeksjon av cftr morpholinos som beskrevet tidligere10 og i trinn 5. For å validere CF fenotypen ble nedsatt posisjon av indre organer som hjerte, lever og bukspyttkjertel som tidligere beskrevet17 (figur 1) vurdert. Lignende resultater ble oppnådd i tilfelle av WT embryoer som rapportert i vår forrige publikasjon19. <p class=…

Discussion

I dette manuskriptet beskrev vi protokollen for å utføre P. aeruginosa (PAO1) infeksjon i sebrafiskembryoer og hvordan man bruker phage terapi med en cocktail av phages tidligere identifisert som i stand til å infisere PAO1 for å løse det. Bruken av bakteriofages som et alternativ til antibiotikabehandling har vært av økende interesse siden de siste årene. Dette skyldes hovedsakelig spredning av multiresistente (MDR) bakterielle infeksjoner, som utgjør et alvorlig problem for folkehelsen. Selvfølgelig …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av den italienske cystisk fibrose Foundation (FFC # 22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo og FFC # 23 /2019; Un respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).

Materials

Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

References

  1. Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  2. Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
  3. Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
  4. Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
  5. Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
  6. Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
  7. McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
  8. Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
  9. Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
  10. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
  11. Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
  12. Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
  13. Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
  14. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  15. Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
  16. Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
  17. Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
  18. Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
  19. Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
  20. Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
  21. Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  23. Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).

Play Video

Cite This Article
Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

View Video