Fagterapi Ansøgning om at modvirke Pseudomonas aeruginosa infektion i cystisk fibrose zebrafisk embryoner
Summary
Præsenteret her er en protokol for Pseudomonas aeruginosa infektion og fagterapi ansøgning i cystisk fibrose (CF) zebrafisk embryoner.
Abstract
Antimikrobiel resistens, en væsentlig konsekvens af diagnostisk usikkerhed og antimikrobiel overrecept, er en stadig mere anerkendt årsag til alvorlige infektioner, komplikationer og dødelighed på verdensplan med en enorm indvirkning på vores samfund og på sundhedssystemet. Især patienter med nedsat immunforsvar eller allerede eksisterende og kroniske patologier, såsom cystisk fibrose (CF), udsættes for hyppige antibiotikabehandlinger for at kontrollere infektioner med udseende og diffusion af multiresistente isolater. Derfor er der et presserende behov for at løse alternative behandlingsformer for at modvirke bakterielle infektioner. Brug af bakteriofager, de naturlige fjender af bakterier, kan være en mulig løsning. Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, beskriver anvendelsen af fagterapi mod Pseudomonas aeruginosa-infektion i CF zebrafiskembryoner. Zebrafisk embryoner blev inficeret med P. aeruginosa at påvise, at fagterapi er effektiv mod P. aeruginosa infektioner, da det reducerer dødelighed, bakteriel byrde og pro-inflammatorisk immunrespons i CF embryoner.
Introduction
Fagterapi, brugen af de naturlige fjender af bakterier til at bekæmpe bakterielle infektioner, er garnering fornyet interesse som bakteriel resistens over for antibiotika bliver udbredt1,,2. Denne behandling, der anvendes i årtier i Østeuropa, kan betragtes som en supplerende behandling af antibiotika i at kurere lungeinfektioner hos patienter med CF og et muligt terapeutisk alternativ for patienter smittet med bakterier, der er resistente over for alle de i øjeblikket i brug antibiotika2,,3. Fordele ved antibiotikabehandling er, at bakteriofager formere sig på infektionsstedet, mens antibiotika metaboliseres og elimineres fra kroppen4,,5. Faktisk har administrationen af cocktails af virulente fager isoleret i forskellige laboratorier vist sig at være effektiv til behandling af Pseudomonas aeruginosa infektioner i dyremodeller så forskellige som insekter og pattedyr6,7,8. Fagterapi viste sig også at være i stand til at reducere bakteriebyrden i brænde sår inficeret med P. aeruginosa og Escherichia coli i et randomiseret klinisk forsøg9.
Zebrafisk (Danio rerio) har for nylig vist sig som en værdifuld model til at studere infektioner med flere patogener, herunder P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus og Burkolderia cepacia12,13. Ved microinjecting bakterier direkte ind i embryoblodcirkulationen 14 er det let at etablere en systemisk infektion, der modvirkes af zebrafisk medfødte immunsystem, som er evolutionære bevaret med neutrofiler og makrofag generation ligner det menneskelige modstykke. Desuden, i løbet af den første måned af livet, zebrafisk embryoner mangler adaptive immunrespons, hvilket gør dem ideelle modeller for at studere den medfødte immunitet, som er den kritiske forsvarsmekanisme i menneskelige lungeinfektioner15. Zebrafisk nylig frem som en kraftfuld genetisk model system til bedre at forstå CF debut og til at udvikle nye farmakologiske behandlinger10,16,17. CF zebrafisk model af cftr knock-down genereret med morpholino injektion i zebrafisk præsenteret en dæmpet respiratorisk burst respons og reduceret neutrofil migration10, mens cftr knock-out fører til nedsat indre organ position og ødelæggelse af eksokrine bugspytkirtel, en fænotype, der afspejler sygdommehos mennesker 16,17. Af største interesse var konstateringen af, at P. aeruginosa bakterielle byrde var betydeligt højere i cftr-tab-of-funktion embryoner end i kontrol på 8 timer efter infektion (hpi), som paralleller resultaterne opnået med mus og menneskelige bronkial epitelceller2,18. cftr
I dette arbejde viser vi, at fagterapi er effektiv mod P. aeruginosa infektioner i zebrafisk embryoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskript beskrev vi protokollen til at udføre P. aeruginosa (PAO1) infektion i zebrafisk embryoner og hvordan man anvender fagterapi med en cocktail af fager tidligere identificeret som i stand til at inficere PAO1 at løse det. Brugen af bakteriofager som et alternativ til antibiotikabehandlinger har været af stigende interesse siden de sidste par år. Dette skyldes hovedsagelig udbredelsen af multiresistente bakterielle infektioner (MDR), som udgør et alvorligt problem for folkesundheden. Selvføl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den italienske cystisk fibrose Foundation (FFC #22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo og FFC#23/2019; Ueståsom respiro i più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
