Summary

Applicazione di terapia del fago per contrastare l'infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

Presentato qui è un protocollo per l’infezione da Pseudomonas aeruginosa e l’applicazione della terapia del fago negli embrioni di zebrafish della fibrosi cistica (CF).

Abstract

La resistenza antimicrobica, una delle principali conseguenze dell’incertezza diagnostica e della sovraprescrizione antimicrobica, è una causa sempre più riconosciuta di infezioni gravi, complicazioni e mortalità in tutto il mondo con un enorme impatto sulla nostra società e sul sistema sanitario. In particolare, i pazienti con sistema immunitario compromesso o patologie preesistenze e croniche, come la fibrosi cistica (CF), sono sottoposti a frequenti trattamenti antibiotici per controllare le infezioni con l’aspetto e la diffusione di isolati multifarmacologici resistenti. Pertanto, vi è l’urgente necessità di affrontare terapie alternative per contrastare le infezioni batteriche. L’uso di batteriofagi, i nemici naturali dei batteri, può essere una possibile soluzione. Il protocollo dettagliato in questo lavoro descrive l’applicazione della terapia del fago contro l’infezione da Pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish CF. Gli embrioni di zebrafish sono stati infettati da P. aeruginosa per dimostrare che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa in quanto riduce la letalità, il peso batterico e la risposta immunitaria pro-infiammatoria negli embrioni CF.

Introduction

La terapia del fago, l’uso dei nemici naturali dei batteri per combattere le infezioni batteriche, sta raccogliendo rinnovato interesse man mano che la resistenza batterica agli antibiotici diventadiffusa 1,,2. Questa terapia, utilizzata da decenni nell’Europa orientale, potrebbe essere considerata un trattamento complementare agli antibiotici nella cura delle infezioni polmonari nei pazienti con CF e una possibile alternativa terapeutica per i pazienti infetti da batteri resistenti a tutti gli antibiotici attualmente in uso2,,3. I vantaggi della terapia antibiotica sono che i batteriofagi si moltiplicano nel sito di infezione, mentre gli antibiotici vengono metabolizzati ed eliminati dalcorpo 4,5. In effetti, la somministrazione di cocktail di fagi virulenti isolati in diversi laboratori si è dimostrata efficace nel trattare le infezioni da Pseudomonas aeruginosa in modelli animali diversi come insetti e mammiferi6,,7,,8. La terapia del fago ha anche dimostrato di essere in grado di ridurre il carico batterico nelle ferite da ustione infettate da P. aeruginosa ed Escherichia coli in uno studio clinico randomizzato9.

Zebrafish (Danio rerio) è recentemente emerso come un modello prezioso per studiare le infezioni con diversi agenti patogeni, tra cui P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,,13. Microiniettando batteri direttamente nella circolazione sanguignadell’embrione 14 è facile stabilire un’infezione sistemica che viene contrastata dal sistema immunitario innato zebrafish, che è evolutivo conservato con neutrofili e generazione di macrofagi simile alla controparte umana. Inoltre, durante il primo mese di vita, gli embrioni di zebrafish mancano della risposta immunitaria adattiva, rendendoli modelli ideali per studiare l’immunità innata, che è il meccanismo di difesa critico nelle infezioni polmonariumane 15. Zebrafish è recentemente emerso come un potente sistema di modelli genetici per comprendere meglio l’insorgenza della CF e sviluppare nuovi trattamentifarmacologici 10,,16,,17. Il modello cf zebrafish di cftr knock-down generato con iniezione di morfolino nel pesce zebra ha presentato una risposta di scoppio respiratorio smorzato e una ridotta migrazione neutrofila10, mentre il knock-out cftr porta a una posizione interna dell’organo compromessa e alla distruzione del pancreas esocrina, un fenotipo che rispecchia la malattia umana16,,17. Di maggiore interesse è stato il risultato che il carico batterico P. aeruginosa è stato significativamente più elevato negli embrioni cftr-perdita di funzione che nei controlli a 8 ore dopo l’infezione (hpi), che è parallelo ai risultati ottenuti con topi e cellule epiteliali bronchialiumane 2,18.

In questo lavoro, dimostriamo che la terapia del fago è efficace contro le infezioni da P. aeruginosa negli embrioni di zebrafish.

Protocol

I pesci zebra adulti (Danio rerio) del ceppo AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) sono mantenuti secondo le linee guida internazionali (Direttiva UE 2010/63/UE) e nazionali (decreto italiano 4marzo 2014, n. 26) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Le condizioni standard sono fissate nell’impianto ittico con un ciclo di buio di 14 ore /10 h e una temperatura dell’acqua del serbatoio a 28 °C. 1. Preparazione di soluzioni e strumenti <li…

Representative Results

I risultati e le cifre qui presentati sono riferiti agli embrioni di CF generati attraverso l’iniezione di cftr morpholinos come descritto inprecedenza 10 e nella fase 5. Per convalidare il fenotipo CF, è stata presa in considerazione la posizione compromessa di organi interni come cuore, fegato e pancreas come descritto in precedenza17 (Figura 1). Risultati analoghi sono stati ottenuti nel caso degli embrioni WT, come riportato nella…

Discussion

In questo manoscritto, abbiamo descritto il protocollo per eseguire l’infezione da P. aeruginosa (PAO1) negli embrioni di zebrafish e come applicare la terapia del fago con un cocktail di fagi precedentemente identificati come in grado di infettare PAO1 per risolverlo. L’uso di batteriofagi come alternativa ai trattamenti antibiotici è stato di crescente interesse dagli ultimi anni. Ciò è dovuto principalmente alla diffusione di infezioni batteriche multi-resistenti ai farmaci (MDR), che costituiscono un grav…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).

Materials

Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

References

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Cite This Article
Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

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