Summary

Kistik Fibrozis Zebrabalık Embriyolarında Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonuna Karşı Faj Tedavisi Uygulaması

Published: May 12, 2020
doi:

Summary

Burada sunulan Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu ve kistik fibrozis faj tedavisi uygulaması için bir protokoldür (CF) zebra balığı embriyoları.

Abstract

Tanısal belirsizlik ve antimikrobiyal overprescription önemli bir sonucu olan antimikrobiyal direnç, toplumumuz ve sağlık sistemi üzerinde büyük bir etkisi ile ciddi enfeksiyonlar, komplikasyonlar ve mortalite dünya çapında giderek tanınan bir nedenidir. Özellikle, bağışıklık sistemi zayıf veya kistik fibrozis (CF) gibi önceden var olan ve kronik patolojileri olan hastalar, multiila dirençli izolasyonların görünümü ve difüzyonu ile enfeksiyonları kontrol etmek için sık antibiyotik tedavileri tabi tutulur. Bu nedenle, bakteriyel enfeksiyonlara karşı alternatif tedaviler ele acil bir ihtiyaç vardır. Bakterilerin doğal düşmanları olan bakteriyofajların kullanımı olası bir çözüm olabilir. Bu çalışmada ayrıntılı protokol CF zebra balığı embriyolarında Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonuna karşı faj tedavisi nin uygulanmasını açıklamaktadır. Zebra balığı embriyoları, CF embriyolarında öldürücülüğü, bakteriyel yükü ve pro-inflamatuar immün yanıtı azalttığı için faj tedavisinin P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı etkili olduğunu göstermek için P. aeruginosa ile enfekte edildi.

Introduction

Faj tedavisi, bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele için bakterilerin doğal düşmanlarının kullanımı, antibiyotiklere bakteriyel direnç yaygın hale geldikçe yenilenen ilgi topluyor1,2. Bu tedavi, Doğu Avrupa’da yıllardır kullanılan, CF olan hastalarda akciğer enfeksiyonları kür antibiyotikler için tamamlayıcı bir tedavi ve şu anda kullanılan antibiyotikler tüm dirençli bakteriler ile enfekte hastalar için olası bir tedavi alternatif olarak kabul edilebilir2,3. Antibiyotik tedavisinin avantajları bakteriyofajlar enfeksiyon yerinde çoğalmak vardır, antibiyotikler metabolize edilir ve vücuttan ortadan kaldırır ise4,5. Nitekim, farklı laboratuvarlarda izole öldürücü fajlar kokteyllerin uygulanması böcek ve memeliler6,7,,8gibi farklı hayvan modellerinde Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonlarıtedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır . Faj tedavisi de randomize klinik çalışmada P. aeruginosa ve Escherichia coli ile enfekte yanık yaralarıbakteriyel yükü azaltmak mümkün olduğu gösterilmiştir9.

Zebra balığı(Danio rerio)son zamanlarda p. aeruginosa10,,11, Mycobacterium apse ve Burkolderia cepacia12dahil olmak üzere çeşitli patojenler ile enfeksiyonları incelemek için değerli bir model olarak ortaya çıkmıştır 12,13. Bakterileri doğrudan embriyo kan dolaşımına mikroenjekte ederek14,insan karşısına benzer nötrofiller ve makrofaj oluşumu ile korunmuş olan zebrabalığı doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından etkisiz hale getirilebilen sistemik bir enfeksiyon oluşturmak kolaydır. Ayrıca, yaşamın ilk ayı boyunca, zebra balığı embriyoları adaptif bağışıklık yanıtı eksikliği, onları doğuştan gelen bağışıklık eğitimi için ideal modeller yapma, hangi insan akciğer enfeksiyonları kritik savunmamekanizması15. Zebrabalığı son zamanlarda daha iyi CF başlangıcı anlamak ve yeni farmakolojik tedaviler geliştirmek için güçlü bir genetik model sistemi olarak ortaya çıktı10,16,17. Cftr knock-down CF zebrabalığı knock-down zebrabalığı morfinono enjeksiyonu ile oluşturulan bir sönümlü solunum patlaması yanıtı ve azaltılmış nötrofil göçsundu 10, cftr knock-out bozulmuş iç organ pozisyonu ve ekofrin pankreas imha yol açar ken, insan hastalığı aynalar bir fenotip16,17. En büyük ilgi p. aeruginosa bakteriyel yük önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulma oldu -ctr kaybı-fonksiyon embriyoları 8 saat post-enfeksiyon (hpi), hangi fareler ve insan bronşiyal epitel hücreleri ile elde edilen sonuçlara paralel kontroller daha2,18. cftr

Bu çalışmada, faj tedavisinin zebra balığı embriyolarında P. aeruginosa enfeksiyonlarına karşı etkili olduğunu gösterin.

Protocol

AB türünden (Avrupa Zebrabalığı Kaynak Merkezi EZRC) yetişkin zebra balıkları(Danio rerio),bilimsel amaçlariçin kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin uluslararası (AB Direktifi 2010/63/EU) ve ulusal yönergelere (İtalyankararnamesi 4 Mart 2014, n. 26) uygun olarak muhafaza edilmektedir. Standart koşullar 14 saat Açık/10 h karanlık çevrim ve 28 ° C tank su sıcaklığı ile balık tesisinde ayarlanır. 1. Çözüm ve araçların hazırlanması <o…

Representative Results

Burada sunulan sonuçlar ve rakamlar cftr morfonoenjeksiyonu ile üretilen CF embriyolarına daha önce10 ve adım 5’te açıklandığı gibi atıfta bulunulmuştur. CF fenotipini doğrulamak için, daha önce açıklandığı gibi kalp, karaciğer ve pankreas gibi iç organların bozulmuş pozisyonu17 (Şekil 1)dikkate alındı. Benzer sonuçlar, önceki yayınımızda bildirilen WT embriyoları durumunda elde edilebildi<sup class="xr…

Discussion

Bu yazıda, zebra balığı embriyolarında P. aeruginosa (PAO1) enfeksiyonu nun nasıl uygulanacağı ve daha önce PAO1’e bulaşabildiği tespit edilen bir faj kokteyli ile faj tedavisinin nasıl uygulanacağı protokolünü açıklanmıştır. Antibiyotik tedavisine alternatif olarak bakteriyofajkullanımı son birkaç yıldır artan ilgi olmuştur. Bunun başlıca nedeni, halk sağlığı için ciddi bir sorun teşkil eden çoklu ilaca dirençli (MDR) bakteriyel enfeksiyonların yayılmasıdır. Tabii ki, bu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma İtalyan Kistik Fibrozis Vakfı tarafından desteklenmiştir (FFC#22/2017; Associazione “Gli amici della Ritty” Casnigo ve FFC#23/2019; Più Onlus La Mano tesa Onlus içinde Un respiro).

Materials

Bacto Agar BD 214010
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
CsCl Sigma-Aldrich 289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS Sigma-Aldrich D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich 886-86-2 common name tricaine
Femtojet Micromanipulator Eppendorf 5247
Fleming/brown P-97 Sutter Instrument Company P-97
LE-Agarose Sigma-Aldrich 11685660001
Low Melting Agarose Sigma-Aldrich CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Methyl Blue Sigma-Aldrich 28983-56-4
Microinjection needles Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98% Aldrich-P7629 103-85-5
Oligo Morpholino Gene Tools designed by the researcher
PEG6000 Calbiochem 528877
Phenol Red Solution Sigma-Aldrich CAS 143-74-B
Potassium chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Pronase Sigma-Aldrich 9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% Sigma-Aldrich S9888
Stereomicroscope Leica S9I
Tris HCl Sigma-Aldrich T5941
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tryptone Oxoid LP0042B
Yeast extract Oxoid LP0021B
Z-MOLDS Microinjection Word Precision Instruments

References

  1. Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  2. Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
  3. Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
  4. Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
  5. Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
  6. Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
  7. McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
  8. Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
  9. Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
  10. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
  11. Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
  12. Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
  13. Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
  14. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  15. Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
  16. Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
  17. Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
  18. Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
  19. Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
  20. Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
  21. Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  23. Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).

Play Video

Cite This Article
Cafora, M., Forti, F., Briani, F., Ghisotti, D., Pistocchi, A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (159), e61275, doi:10.3791/61275 (2020).

View Video