Dette papiret beskriver isolasjon og dyrking av embryonale rotte sympatiske nevroner fra de overlegne cervical ganglia. Det gir også detaljerte protokoller for immunocytokjemisk farging og for å forberede nevronale ekstrakter for massespektrometrisk analyse.
Sympatiske nevroner fra embryonale rotte overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt brukt som et in vitro-modellsystem for perifere nevroner for å studere aksonal vekst, aksonal smugling, synaptogenesis, dendrittisk vekst, dendrittisk plastisitet og nervemålinteraksjoner i co-kultursystemer. Denne protokollen beskriver isolasjon og dissosiasjon av nevroner fra de overlegne livmorhalsgangene til E21 rotteembryoer, etterfulgt av preparat og vedlikehold av rene nevronale kulturer i serumfritt medium. Siden nevroner ikke holder seg til ubestrøket plast, vil nevroner bli dyrket på enten 12 mm glassdeksler eller 6-brønns plater belagt med poly-D-lysin. Etter behandling med et antimitotisk middel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside), genererer denne protokollen sunne nevronale kulturer med mindre enn 5% ikke-nevronale celler, som kan opprettholdes i over en måned in vitro. Selv om embryonale rotte SCG nevroner er multipolar med 5-8 dendritt in vivo; under serumfrie forhold strekker disse nevronene bare en enkelt axon i kultur og fortsetter å være unipolar i løpet av kulturen. Imidlertid kan disse nevronene induseres til å utvide dendrittene i nærvær av kjellermembranekstrakt, beinmorfogenetiske proteiner (BMPs), eller 10% føtal kalveserum. Disse homogene nevronale kulturene kan brukes til immunocytokjemisk farging og til biokjemiske studier. Dette papiret beskriver også optimalisert protokoll for immunocytokjemisk farging for mikrotubuli assosiert protein-2 (MAP-2) i disse nevronene og for fremstilling av nevronale ekstrakter for massespektrometri.
Sympatiske nevroner avledet fra embryonale overlegne cervical ganglia (SCG) har blitt mye brukt som et primært nevronalt kultursystem for å studere mange aspekter av nevronal utvikling, inkludert vekstfaktoravhengighet, neuron-mål interaksjoner, nevrotransmitter signalering, aksonal vekst, dendritt utvikling og plastisitet, synaptogenesis og signalmekanismer underliggende nerve-mål/ neuron-glia interaksjoner1,2,3,4,5,6,7,8,9. Til tross for sin lille størrelse (rundt 10000 nevroner / ganglia), er det tre hovedgrunner til utvikling og utstrakt bruk av dette kultursystemet er i) å være de første gangliaene i den sympatiske kjeden, de er større, og derfor lettere å isolere, enn resten av de sympatiske ganglia10; ii) i motsetning til sentrale nevroner, nevronene i SCG er ganske homogene med alle nevronene blir avledet fra nevrale crest, har en lignende størrelse, avhengighet av nerve vekstfaktor og være nor-adrenerge. Dette gjør dem til en verdifull modell for morfologiske og genomiskestudier 10,,11 og iii) disse nevronene kan opprettholdes i et definert serumfritt medium som inneholder nervevekstfaktor i over en måned10,12. Perinatal SCG nevroner har blitt mye brukt til å studere mekanismene som ligger til grunn for initiering og vedlikehold av dendritt2. Dette skyldes hovedsakelig, selv om SCG-nevroner har en omfattende dendrittisk arbor in vivo, utvider de ikke dendritt in vitro i fravær avserum,men kan induseres til å vokse dendritter i nærvær av visse vekstfaktorer som beinmorfogenetiske proteiner2,12,,13.
Dette papiret beskriver protokollen for å isolere og kultivere embryonale rotte SCG nevroner. I løpet av de siste 50 årene har primære nevronale kulturer fra SCG hovedsakelig blitt brukt til morfologiske studier med et begrenset antall studier som undersøker de store genomiske eller proteomiske endringene. Dette skyldes hovedsakelig liten vevstørrelse som resulterer i isolering av lave mengder DNA eller protein, noe som gjør det vanskelig å utføre genomiske og proteomiske analyser på disse nevronene. Men de siste årene har økt deteksjonsfølsomhet gjort det mulig å utvikle metoder for å undersøke genomet, miRNome og proteome i SCG-nevronene under dendrittisk vekstutvikling14,,15,,16,,17. Dette papiret vil også beskrive metoden for morfologisk analyse av disse nevronene ved hjelp av immunocytochemistry og en protokoll for å oppnå nevronale proteinekstrakter for massespektrologisk analyse.
Dette papiret beskriver protokollene for å dyrke sympatiske nevroner fra overlegne cervical ganglia av embryonale rottevalper. Fordelene ved å bruke dette modellsystemet er at det er mulig å oppnå en homogen populasjon av nevroner som gir en lignende respons på vekstfaktorer, og siden vekstfaktorkravene for disse nevronene har blitt godt karakterisert, er det mulig å vokse disse nevronene in vitro i definerte medier, under serumfrie forhold10. Selv om protokollen beskriver prosessen for å i…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Faculty Development Fund og Summer Research Program stipend ved Saint Mary’s College of California. Forfatterne vil også takke Dr. Pamela Lein ved University of California ved Davis og Dr. Anthony Iavarone ved UC Berkeley Mass spektrometri anlegget for deres råd under utviklingen av disse protokollene. Forfatterne vil også takke Haley Nelson i Office of College Communications ved Saint Mary’s College of California for hennes hjelp med videoproduksjon og redigering.
2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |