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Neuroscience

培养胚胎高级宫颈神经群中的大鼠交感神经元进行形态学和蛋白质学分析

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61283

Summary

本文描述了胚胎大鼠交感神经元从优越的宫颈神经的分离和培养。它还为免疫细胞化学染色和制备用于质谱分析的神经元提取物提供了详细的方案。

Abstract

来自胚胎大鼠高级宫颈节(SCG)的交感神经元已被用作周围神经元的体外模型系统,用于研究共培养系统中的突触生长、斧质贩运、突触、树突生长、树突增合和神经靶相互作用。该协议描述了神经元与E21大鼠胚胎的优越宫颈神经分离,随后在无血清培养中制备和维持纯神经元培养。由于神经元不粘附于未涂覆的塑料,神经元将在 12 mm 玻璃盖玻片或涂有聚 D-lysine 的 6 孔板上培养。在用抗米理剂(Ara-C,细胞素β-D-阿拉伯富拉诺赛德)治疗后,该协议产生健康神经元培养,非神经元细胞少于5%,可以在体外维持一个多月。虽然胚胎大鼠SCG神经元是多极的,体内有5-8个树突;在无血清条件下,这些神经元在培养中只延伸单个轴突,并在培养期间继续是单极的。然而,这些神经元可以诱导扩大树突在地下膜提取物,骨形态遗传蛋白(BPS),或10%胎儿小牛血清的存在。这些同质神经元培养物可用于免疫细胞化学染色和生化研究。本文还介绍了这些神经元中微管相关蛋白-2(MAP-2)的免疫细胞化学染色的优化方案,以及用于质谱学的神经元提取物的制备。

Introduction

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来自胚胎优越的宫颈神经群(SCG)的交感神经元已被广泛用作研究神经元发育的初级神经元培养系统,包括生长因子依赖、神经元靶向相互作用、神经递质信号、突克生长、树突发育和可塑性、突触发生和信号机制,其基础神经靶点/神经胶质相互作用,,,1,1、2、3、4、5、6、7、8、9。7,8,95,6,234尽管它们体积小(大约10000个神经元/神经),但有三个主要原因,发展和广泛使用这种文化系统是一)作为第一个神经群在同情链,他们更大,因此更容易隔离,比其余的同情神经10;ii) 与中央神经元不同,SCG 中的神经元相当均匀,所有神经元都来自神经峰,大小相似,依赖于神经生长因子,并且无肾上腺素。这使得它们成为形态学和基因组研究的宝贵模型10,11,11和iii)这些神经元可以保持在一个定义的无血清介质包含神经生长因子超过一个月10,12。10,12围产期SCG神经元已被广泛使用,用于研究树突2的启动和维持机制。这主要是因为,虽然SCG神经元在体内有广泛的树突状,但在缺乏血清的情况下,它们不在体外延伸树突,但在某些生长因子(如骨形态遗传蛋白,2、12、13),12的存在下,可以诱导树突生长树突。13

本文介绍了胚胎大鼠SCG神经元的隔离和培养方案。在过去50年中,SCG的原发神经元培养主要用于形态学研究,研究大规模基因组或蛋白质组变化的研究数量有限。这主要是由于组织体积小,导致低量的DNA或蛋白质的分离,这使得很难对这些神经元进行基因组和蛋白质组分析。然而,近年来,检测敏感性的提高使得在树突生长发育过程中,在SCG神经元中检查基因组、miRNome和蛋白质组的方法的发展已经能够发展14、15、16、17。,15,16,17本文还将描述利用免疫细胞化学和获取神经蛋白提取物进行质谱分析的神经元形态分析方法。

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Protocol

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加州圣玛丽学院的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准了有关动物研究的所有程序。圣玛丽学院的动物护理和使用指南是根据国家卫生研究所实验室动物福利办公室提供的准则(https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf和https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf) https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf。

1. 文化媒体的准备(也称为控制媒介)

  1. 将下列成分,按以下顺序添加到无菌的500 mL烧瓶中:190 mL的1x低葡萄糖DMEM,10 mL的20毫克/mL脂肪酸无牛血清白蛋白(FAF-BSA) 在DMEM, 2.8 mL 的 200 mM L-谷氨酰胺,4 mL 的 100 倍胰岛素-氦-转移素混合物,0.4 mL 的 125 μg/mL 神经生长因子(在 DMEM 中的 0.2% 惰性蛋白稳定剂中),以及 200 mL 的 Ham F-12 介质。
  2. 在添加含蛋白质溶液(如胰岛素-钚转移素和NGF)之前,确保用含有FAF-BSA的介质涂覆移液器,以防止蛋白质粘附在移液器上。
  3. 旋转烧瓶,每次添加后混合成分。加入 F-12 后,与 25 mL 移液器彻底混合。
  4. 在10 mL等分中对培养基进行等分,储存在-80°C。 等分可以储存六个月,而不会损失活动。

2. 培养神经元的板的准备

  1. 用无菌蒸馏水稀释1mg/mL的多D-Lysine(在0.5 M Tris缓冲液中制造,pH 8)至100μg/mL。
  2. 对于蛋白质组或基因组分析,解剖前一到两天,涂上约2 mL的无菌100g/mL聚D-lysine(PDL)。的6孔板。这是确保细胞附着力到井中所必需的。用保鲜膜包裹板,并在4°C下将盘子过夜。
  3. 对于形态分析和显微镜,将 12 mm2 预处理的德国玻璃盖玻片(可按前 18 条所述或购买的硝酸处理进行清洁)放入 24 孔板的每个孔中。
    1. 用 0.3 mL 的无菌 100 g/mL 聚 D-晶烯 (PDL) 涂覆唇。将盘子在4°C下过夜。
  4. 解剖当天,在解剖开始前,从井中去除多D-lysine溶液,用无菌蒸馏水冲洗井五次,然后用低血糖DMEM冲洗一次。
  5. 在刚体酶消化过程中(在电镀细胞前大约一小时),从板中吸出DMEM,用0.3 mL的控制介质进行更换。将板材以 35.5 °C 低于 5% CO2 的温度存放在加湿室中。

3. 解剖设置

  1. 制备 200 mL 的解剖介质(称为解剖介质)
    1. 在低葡萄糖DMEM(含1mg/mL葡萄糖)中加入8 mL 20mg/mL无脂肪酸牛血清白蛋白(含1mg/mL葡萄糖)和2 mL 100倍青霉素链霉素至193 mL的无菌Lebovitz的L-15介质(或任何空气缓冲介质)
  2. 在机罩中,设置以下用于解剖的项目:四个 50 mL 无菌锥形管,每个管中带约 20 mL 的解剖介质,四个无菌 35 mm 培养皿,1.5 mL 解剖介质,一个无菌 50 mL 锥形管与 20 mL 解剖介质进行离心,一个 15 mL 的无菌锥形管用于离心,以及一个无菌的10 mL管,用于收集分离的细胞。
  3. 使用干珠消毒器对一对细钳(4 号或 5 号钳子)进行消毒至少一分钟。

4. 将优越的颈椎与胚胎鼠幼崽隔离在一起

  1. 从怀孕大鼠中去除E21胚胎
    注:如果对周围区域进行彻底消毒,可以在发动机罩外进行子宫角的切除。
    1. 使用CO2吸入对怀孕大鼠实施安乐死 。从腹部区域剪下毛皮,用 70% 的酒精擦拭该区域的皮肤以消毒。
    2. 使用一套新的无菌剪刀和钳子,切开皮肤,然后肌肉层暴露含有胚胎的子宫角。用一套新的剪刀和钳子取出子宫角,注意不要在这个过程中损害肠道。
    3. 将子宫角与胚胎一起转移到150毫米2 无菌培养皿中,然后将其转移到机罩中。
    4. 使用一套新的钳子和剪刀,从子宫角取出胚胎,将胚胎从羊膜和胎盘分离。
    5. 要对胚胎进行安乐死,请沿着右臂下的中线切割胚胎的脊髓。这也将减少从胡萝卜动脉出血期间,去除SCG。
    6. 这些胚胎移植到准备好的含有解剖介质的50mL锥形管中。确保胚胎浸入介质中。每个管可以容纳多达3个胚胎。
  2. 将优越的宫颈从胚胎中分离
    1. 将一只小狗从解剖介质转移到无菌的 150 mm2 Petri 盘中,该培养皿半填充固体基材(石蜡或硅胶聚合物),其后面位于基材上。使用三根无菌的23G针,将幼崽固定在菜上,每根手臂下一根针,第三根针穿过嘴,小心地超伸长颈部。
    2. 用无菌细钳(No.4 或 No. 5 钳)切割颈部区域的皮肤,以暴露下面的唾液腺。使用细钳去除这些腺体。
    3. 分别找到锁骨和气管附近的胸腺肌和肌肽肌肉。首先切割横向胸肌肌肉,然后用细钳小心地切割细肌。一旦这些肌肉被移除,前端的胡萝卜动脉的分叉将在气管的两侧可见,SCG 位于这个叉下,位于胡萝卜动脉中。
    4. 使用闭合钳,轻轻抬起胡萝卜动脉以可视化 SCG。使用 SCG 两侧的一个钳子,拉出卡罗蒂德,将其转移到准备好的无菌 35 mm2 盘。这种组织将最有可能包含SCG与胡萝卜动脉,迷走神经与结节神经,以及在该地区的其他部分的肌肉或脂肪。
    5. 在另一侧重复解剖过程。在继续执行下面概述的其余解剖步骤之前,先从所有胚胎中去除 SCG。将分离的组织分配在 35 mm2 盘中的两 个盘之间,以便于组织样品的处理。
  3. SCG 的后期处理
    1. 要将SCG与解剖组织分离,首先使用细钳去除任何无关的组织,如脂肪或肌肉,注意避免肉皮分叉附近的区域。
    2. 一旦这些组织被移除,两个小将可见。结节更小,圆形,而SCG是杏仁形的。轻轻拉上迷走神经,将迷走神经和结点神经与胡萝卜状神经分离,然后将SCG与胡萝卜动脉分离。
    3. 使用精细钳子取出 SCG 周围的胶囊。将 SCG 转移到新的 35 毫米培养皿中。对所有解剖组织样本重复此过程。
    4. 用解剖介质涂上经过消毒的棉质玻璃移液器,以防止组织粘附在移液器壁上。使用移液器在不含钙和镁的HSS中用无菌2mL的胶原酶II型(1mg/mL)/dispaseII型(5mg/mL)代替解剖介质,并在37°C下孵育50分钟,帮助分解组织。
      注:孵育时间可能需要用不同批次的胶原蛋白酶/Dispase进行优化,通常从40分钟到1小时。
    5. 在孵育过程中,从板中吸出DMEM,代之以0.3 mL的控制介质。将板材以 35.5 °C 低于 5% CO2 的温度存放在加湿室中。
    6. 孵育后,将胶原酶/分离中的SCG转移到无菌的15 mL锥形管中。使用解剖介质冲洗板,将溶液转移到管中。添加足够的解剖介质,使体积达到约 10 mL。
    7. 在室温下以 200 x g (1000 - 1200 rpm) 离心 5 分钟,以对样品进行分粒。吸上一道,注意不要将颗粒分离。用 10 mL 解剖介质重新暂停颗粒。重复离心并丢弃上经剂。
    8. 替换为 1 - 2 mL 的培养介质。使用窄孔、弯头无菌巴氏移液器(预涂有培养基),通过轻轻三角 5-6 次,机械地分离团块。让较大的团块沉淀约一分钟。将上一功能细胞悬浮液转移到新的 10 mL 管中。
    9. 重复此过程 3 次,每次增加三分法力,以确保几乎完全分离 SCG。
    10. 添加足够的培养媒体,使音量达到 8 - 10 mL。轻轻地混合细胞悬浮液,用血细胞计量化细胞密度。
    11. 将细胞悬浮液以适当的细胞密度分配到孔中,用于实验。在电镀过程中连续混合细胞悬浮液,以确保细胞均匀分布到井中。
      注:对于形态学分析,将细胞在24个孔板中对大约8,000个细胞/孔进行板,对于基因组和蛋白质体方案,将细胞板高至30,000个细胞/孔。
    12. 将板转移到底部有无菌水的玻璃干燥器,以形成加湿室。在密封之前,注入足够的 CO2( 约 120 mL),在干燥器中获得 5% 的 CO2 环境。将板保持 35.5 °C。 这在协议中称为第 0 天。
      注:这些板也可以保持在一个正常的5%的CO2培养箱。上述方法可最大限度降低温度和pH值变化,还有助于防止交叉污染。

5. 维持培养的SCG神经元和治疗

  1. 在第1天(电镀后24小时),小心地取出一半的培养基,并更换为2μM Ara-C(细胞氨酸+-D-Arabinofuranoside,一种抗粒菌剂)。将治疗留在细胞上48小时。通常,这种治疗时间足以消除培养中的非神经元细胞。
  2. 第 3 天,轻轻吸气一半的介质,然后更换为控制介质。
  3. 第4天,细胞准备进行实验治疗。每隔一天用适当的培养物喂养一次,用新鲜的介质轻轻替换井中一半的培养物。
  4. 无血清介质中的培养SCG神经元仅延伸轴突。如果实验需要树突的存在,用10%的胎儿小牛血清、75-100μg/mL的基膜基质提取物或50纳克/mL的骨形态遗传蛋白-7治疗细胞。在治疗后48小时内观察到树突生长,在治疗后一周内观察到精心制作的树突状。

6. 免疫污染培养SCG神经元

  1. 在0.1 M磷酸盐缓冲液中用4%的甲醛,在烟罩中用pH7.2逐渐取代井中的细胞培养基。
    1. 取出井中一半的培养基,用4%的甲醛轻轻更换。然后,重复此过程至少两次,每次去除井中三分之二的介质,并用 4% 的甲醛替换。在这个过程结束时,井中的介质颜色应该从粉红色变成无色。
    2. 一旦所有介质被4%的甲醛所取代,在室温下孵育15-20分钟。
  2. 与上述类似工艺,逐渐用磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH7.2,逐渐取代4%的半成甲醛溶液。离开5分钟。用 PBS 再次冲洗两次,每次冲洗 5 分钟。
    1. 去除 4% 的半甲醛后,将板移动到台面进行进一步处理。此步骤是一个很好的停止点,板可以储存在4°C过夜。
  3. 卸下所有 PBS。在 PBS 中添加足够的 0.1% Triton X-100 体积,以覆盖细胞。在培养物上保留5分钟,使神经元渗透。此步骤的时机对于确保良好的染色,同时保持细胞的完整性至关重要。
  4. 小心地取出Triton X-100溶液,每次用PBS冲洗3次,冲洗5分钟。卸下 PBS 溶液。
  5. 在PBS中加入足够的5%BSA,覆盖细胞,并在室温下孵育20分钟,以减少非特异性抗体结合。
  6. 去除阻断溶液,代之以小鼠单克隆抗体,以对抗在PBS中稀释5%BSA中的 MAP-2 蛋白。将原抗体在4°C下在细胞上过夜。
  7. 取出并保存原抗体以重复使用。原抗体可至少重复使用两次,而不会损失检测强度。
  8. 用足够的 PBS 冲洗三次,以覆盖细胞。每次冲洗时在细胞上保留 PBS 10 分钟。
  9. 去除PBS溶液,在PBS中5%BSA中稀释1:1000,用荧光标签结合山羊抗小鼠IgG二次抗体进行更换。在室温下在黑暗中孵育2小时。
  10. 去除二级抗体,用PBS代替。每次冲洗用 PBS 冲洗井三次,每次冲洗 10 分钟。用水冲洗水一次,去除任何盐分。
  11. 将盖玻片安装到玻璃玻片上,玻璃幻灯片上装有一滴水性安装剂,适用于荧光标记样品。将幻灯片存放在 4°C,在幻灯片文件夹中,直到准备好进行成像。

7. 使用液相色谱和质谱法分析蛋白质组的分析样品制备

  1. 培养神经元的透析
    1. 轻轻去除井中的所有培养介质。用冷、无菌钙和无镁磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (PBS) pH 7.4 代替。快速取出并更换为 PBS,让它坐 5 分钟。此步骤是去除培养基中存在的任何蛋白质。
    2. 小心地从所有油井中去除所有 PBS,以进行特定处理。重复此过程一次。在融化细胞时,在冰上保持板,以尽量减少神经元损伤和蛋白细胞解。
    3. 将 100 - 150 μL 的 50 mM 碳酸氢铵,pH 7.5 (NH4HCO3)添加到其中一口,并使用无菌细胞刮刀刮取细胞。使用微管,转移液体,并重复刮擦过程与所有的井进行特定处理。刮擦后,在显微镜下检查孔,以确保大部分细胞已被移除。
      1. 神经元数量减少时,使用有限的体积对细胞进行解剖,以确保足够高的浓度用于蛋白质组分析。
    4. 将溶液在-80°C冷冻过夜,以帮助细胞解。在此阶段可以存储 lysates,直到准备进一步处理。
    5. 解冻后,用26G或28G针头将样品通过注射器喷出,以机械方式将细胞融化。
    6. 在声波水浴中对样品进行两次声波处理,时间为10分钟。在水浴中加入冰,防止蛋白质过热和变性。在 4 °C 下在 12,000 x g 下离心 5 分钟
    7. 测量蛋白质浓度。典型蛋白质浓度范围为 0.4 - 1 μg/μL
  2. 样品制备和蛋白酶消化用于蛋白质组分析
    1. 将最大60μL的利酸盐或50μg的蛋白质转移到DNase-、RNase-和蛋白酶1.5 mL管中。如果裂酸的体积小于 60 μL,则加入足够的 50 mM 碳酸氢铵以补充体积。
    2. 加入25μL的0.2%酸乳化表面活性剂和涡流。在80°C的块加热器中孵育管15分钟。将管以 12,000 x g 离心 30 s。
    3. 加入2.5μL的100 mM二次醇和涡流。这使得蛋白质更容易获得烷基化和消化。在60°C的块加热器中孵育管30分钟。冷却至室温和离心机。
    4. 向样品和涡流中加入 2.5 μL 的 300 mM 碘乙酰胺。这一步有助于使半胱氨酸化,并防止它们改革二硫化债券。在黑暗中的室温下孵育管子30分钟。
    5. 在三辛下向管中加入质谱级三辛(0.5 μg/μL):蛋白质比为1:10。在37°C下隔夜消化样品。
    6. 加入10微升5%三氟乙酸(TFA)和涡流。在37°C下孵育样品90分钟。此步骤是水解酸实验室表面活性剂,以防止在质谱过程中干扰所必需的。
    7. 在 4 °C 下以 12,000 x g 将样品离心 30 分钟,然后将清明转移到经过色谱认证的透明玻璃瓶中,并预切碎特氟龙/硅体隔膜盖。样品在质谱分析之前可以储存在-20°C。
    8. 将样品小瓶与高清晰度质谱法相结合,进行液相色谱。

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Representative Results

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隔离和维护胚胎SCG神经元的神经元培养
大鼠胚胎SCG分离的细胞被镀在多D-lysine涂层板或盖玻片中,并保留在含有b神经生长因子的血清自由培养基中。含有神经元和胶质细胞混合物的分离细胞在电镀时看起来是圆形的(图1A)。在电镀的24小时内,神经元扩展小轴突过程与胶质细胞扁平化,并在相位对比度显微镜下出现相暗(图1B)。在使用 Ara-C 治疗后,99% 的胶质细胞被消除,培养物包含以椭圆形细胞体、广泛轴突生长和无树突的神经元细胞为主(图1C)。

培养胚胎大鼠的免疫细胞化学染色优于宫颈神经神经元
先前的研究表明,在无血清介质中生长的培养交感神经元只延伸轴突,只在地下膜提取物、10%血清或50 ng/mL骨形态遗传蛋白-7(BMP-7)2、12的情况下延伸精心制作的树突2与在无血清控制介质中生长的神经元相比,相位对比显微镜显示,在BMP-7(50纳克/mL)存在的情况下生长5天的神经元具有扁平细胞体,具有多个厚锥形过程(图2)。这些过程作为树突的特性由 MAP-2 的存在得到证实,MAP-2是一种细胞骨骼蛋白,主要存在于细胞体和树突19、20,。在控制条件下,MAP-2的荧光染色在细胞质和近边轴内观察到,并被排除在原子核之外(与核染色共同标记以可视化原子核(图3A-3D)BMP-7在50纳克/mL下治疗5天后,MAP-2的免疫反应能力不仅在细胞质中,而且在树突中观察到(图3E-3H)。

在控制介质中培养的培养SCG神经元的蛋白质组分析样本
E21大鼠交感神经元在控制介质中培养6天体外,Lyslysed并接受LC-MS分析。该样品在质谱仪上以三个副本运行,蛋白质是根据每个样品观察到的零碎肽的数量进行鉴定的。根据每个蛋白质(从5-500)观察到的片段肽数量计算蛋白质 ID 的丰度(从 0 到 300000 个任意单位不等)和置信度得分。图4显示了在无血清控制介质中培养的SCG神经元中30μg蛋白蛋白质的质谱分析样本 数据集

样本中检测到13,134个肽,与1287种蛋白质相对应。其中,1100个存在于所有三个技术复制中,其规范化丰度值大于 500。这1100种蛋白质中,有90种蛋白质通过一种肽的命中而得到鉴定,这种肽只覆盖了蛋白质的一小部分。因此,很难确定鉴定是否正确,并且这些蛋白质的蛋白质置信度低(分数<10)。这些蛋白质从分析中消除,其余1010蛋白质使用基因本体论进一步分析,以确定该协议是否成功地检测具有不同定位和功能的蛋白质。

使用黑豹分类数据库(http://www.pantherdb.org/)对本体学进行基因本体分析,以确定该数据集是否包括具有不同细胞定位或分子和生物功能的蛋白质,并检查已识别的蛋白质与已知通路21之间是否有联系。分析表明,虽然超过700种蛋白质是细胞质的,但该数据集包含的蛋白质被局部化到细胞的其他区域,包括细胞核、膜、几个细胞细胞器和细胞结(图4A)。分析还显示,超过400种蛋白质具有催化活性,约300种蛋白质参与信号通路(图4B和图4C)。此外,该数据集包含各种信号通路中的蛋白质。表1显示了在G蛋白信号、细胞粘附、生长因子信号通路和突触囊泡贩运路径中的五种蛋白质,它们分别被识别在数据集中。

Figure 1
图1:随着时间的推移,培养的E21大鼠胚胎SCG神经元的形态变化。代表性相位对比显微镜图像,在电镀后(A),电镀后一天(B),在Ara-C处理后48小时(电镀后5天),E21B大鼠SCG分离细胞的10倍放大倍。注意胶质细胞(箭头)和轴突延伸(箭头)在(B)中的存在,以及没有胶质细胞和神经元,在(C)中显示广泛的轴突生长。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:使用BMP-7治疗后,E21大鼠SCG神经元神经元形态的变化。在消除非神经元细胞后,培养的SCG神经元在50纳克/mL(B)下用控制介质(A)或BMP-7治疗5天。代表性相差对比显微图(10倍放大倍率)显示使用BMP-7(箭头,B)治疗时具有控制神经元(A)的轴突的圆形神经元体和具有多个短树突状过程的神经元。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:培养胚胎大鼠交感神经元中 MAP-2 蛋白的免疫抑制。在消除非神经元细胞后,培养的SCG神经元在50纳克/mL (E-H) 使用控制介质(A-D)或BMP-7进行5天治疗,并使用小鼠单克隆抗体对 MAP-2 进行免疫处理,并结合核标记。代表性显微图显示具有微管相关蛋白-2(MAP-2)(C,G)、染色(D,H)和相对基显微图(B,F)和三个通道(A,E)合并的神经元的免疫细胞化学染色。控制神经元(C)的细胞体和近端轴突中存在微管相关蛋白-2的免疫细胞化学染色,BMP-7处理神经元中的细胞体和树突中的树突中存在 MAP-2 蛋白的染色请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:在培养的E21大鼠SCG神经元的蛋白质组分析中确定的蛋白质的分类和分布。对1100种蛋白质的蛋白质ID进行了黑豹分类系统的基因本体分析,以检查数据中蛋白质在细胞定位(A)、细胞功能和生物过程(B)和基于蛋白质结构的分子函数类(C)上的分布情况。 请单击此处查看此图的较大版本。

A) 生物粘附中的蛋白质
UniProt 加入 ID 基因名称 基因符号
Q9Z1Y3 卡德林-2 Cdh2
O35112 CD166 抗原 阿尔卡姆
P49134 Integrin beta-1 Itgb1
D3ZES7 普莱辛 A4 Plxna4
F1LP44 Integrin 亚单位 alpha L 伊特加尔
B) 参与生长因子信号的蛋白质
P35213 14-3-3蛋白β/阿尔法 伊瓦布
Q5BJ92 血清/三联因-蛋白质磷酸酶 4 催化亚单位 P4c
P47196 Rac = 阿尔法素/特龙氨酸蛋白激酶 阿克特1
P62994 生长因子受体结合蛋白2 Grb2
P21708 米可原活性蛋白激酶3 马普克3
C) 参与G蛋白耦合信号通路的蛋白质
P08753 瓜宁核苷酸结合蛋白G(k)亚基α 格奈3
D4ABV5 卡尔莫杜林-2 平静2
P18266 糖原合成酶激酶-3β Gsk3b
P09456 依赖型蛋白激酶类型 I-alpha 调节亚单位 Prkar1a
P53534 糖原磷酸酶 Pygb (大脑形式)
D) 参与突触囊泡贩运的蛋白质
P47861 Synaptotagmin-5 Syt5
电话63045 囊泡相关膜蛋白2 吸血鬼2
电话61265 语法-1B Stx1b
Q63537 突触素-2 Syn2
P60881 突触体相关蛋白 25 捕捉25

表1:从培养的大鼠胚胎SCG神经元的蛋白质组数据中识别的代表性蛋白质,按其生物功能分类。 使用黑豹分类系统对1100蛋白的蛋白质组数据进行基因本体分析。下面列出的是为四种生物途径确定的五大蛋白质。

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Discussion

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本文介绍了从胚胎大鼠幼崽的上颈神经群中培养交感神经元的规程。使用这个模型系统的优点是,有可能获得一个均匀的神经元群,提供类似的反应生长因子,并且由于这些神经元的生长因子要求已经很好地特征化,有可能在无血清条件下定义的介质中体外生长这些神经元。虽然该协议描述了从E21大鼠幼崽隔离SCG的过程,但该协议可用于从E17到E21的鼠幼幼解剖SCG,以及解剖胚胎小鼠SCG 10、22、23。10,22,23此解剖方案还可用于将 SCG 与产后大鼠隔离,对初始步骤进行轻微修改。这些修改包括消除剖腹产、使用二氧化碳对产后动物实施安乐死、将幼崽浸入70%酒精进行安乐死后绝育,然后将其转移到解剖介质10。这种神经元培养方案也可以适应研究斧头指导,斧头传输和突触形成使用坎佩诺特室和微流体室24,25。24,这些神经元也可以与来自后根神经群或脊髓运动神经元的神经元或心肌细胞共同培养,以研究神经元相互作用和神经元 - 周围神经系统,26、27、28、29中26,27,28的目标相互作用

使用培养的SCG神经元进行免疫细胞化学研究是有据可查的。本文中描述的协议为大多数抗体的处理提供了一个良好的起点。然而,有抗体,如检测核蛋白的抗体,可能需要修改固定协议和渗透协议。在磷-SMAD抗体的情况下,在-20°C下使用100%甲醇进行修复和渗透神经元30,31。30,

在这个模型系统中工作的主要局限性来自胚胎大鼠幼崽中SG的体积小,导致神经元数量少。这导致少量的核酸或蛋白质,可以从解剖一个幼崽的垃圾获得。这可能对基因组和蛋白质组分析有问题,尤其是在一次解剖中比较多种治疗时。此外,不可能从单个胚胎获得SCG神经元培养。因此,所有实验都是从SCG中采集的所有老鼠胚胎的集合样本上进行的。该系统的另一个限制是,SCG神经元具有较低的DNA转染效率(10-20%,未发表的观察)和更高的毒性后转染比中央神经元32。虽然这种转染效率对于单个神经元的形态学研究来说是好的,但很难进行分子或生化研究来检测/确认基因表达的变化。

然而,近年来,培养SCG神经元已被用于研究树突生长的基础机制,并用于转录组和miRNome分析14,15,33。14,15,33如前所述,由于蛋白质含量低,胚胎SCG培养的神经元以前没有用于蛋白质细胞分析。该协议和代表性的结果提供了证据,即使样品浓度低,目前的高清晰度质谱仪器也可用于这些神经元的蛋白质组学研究。虽然此处描述的样品制备协议用于 SCG 神经元,但此协议可用于制备任何蛋白质浓度低的样品,用于 LC-MS 分析。其中一个限制是,蛋白质浓度或尝试酶消化效率的小变化可能导致不完全的碎片和LC-MS检测到的蛋白质数量的急剧减少。因此,确保起始蛋白浓度接近 50 μg 与 10:1 的蛋白质比率:三普辛至关重要。此外,将质谱级 trypsin 等同,以防止多个冻结-解冻周期,也是一种好的做法。

该协议的另一个限制是,在蛋白质组中检测到的跨膜蛋白数量有限。虽然酸性实验室表面活性剂已被证明是质谱学的有效表面活性剂,但先前对培养细胞的研究发现,这些表面活性剂可以稍微增加细胞质蛋白质的数量,减少蛋白质表图图34中的膜蛋白。此外,有人建议,使用细菌内皮酶,如Lys-C,在尝试性消化之前,可以提高膜结合蛋白的三辛消化效率,并防止膜蛋白片段保留在LC柱35。

总之,本文为培养大鼠胚胎交感神经元以及这些神经元进行形态学和蛋白质学研究提供了详细的方案。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了加州圣玛丽学院的教师发展基金和暑期研究计划赠款的支持。作者还要感谢加州大学戴维斯分校的帕梅拉·莱因博士和加州大学伯克利分校质谱设施的安东尼·伊瓦龙博士在开发这些协议期间提供的建议。作者还要感谢加州圣玛丽学院传播办公室的海莉·纳尔逊在视频制作和编辑方面的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

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培养胚胎高级宫颈神经群中的大鼠交感神经元进行形态学和蛋白质学分析
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Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).More

Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

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