Kontinuerlig måling af biologisk støj i Escherichia Coli ved hjælp af time-lapse mikroskopi
Summary
Dette arbejde præsenterer en mikroskopi metode, der tillader levende billeddannelse af en enkelt celle af Escherichia coli til analyse og kvantificering af stokastisk adfærd syntetiske gen kredsløb.
Abstract
Protokollen udviklet her tilbyder et værktøj til at muliggøre computer sporing af Escherichia coli division og fluorescerende niveauer over flere timer. Processen starter med screening for kolonier, der overlever på minimale medier, idet det antages, at kun Escherichia coli huser den korrekte plasmid vil være i stand til at trives i de specifikke forhold. Da processen med at opbygge store genetiske kredsløb, der kræver samling af mange DNA-dele, er udfordrende, er kredsløbskomponenter ofte fordelt mellem flere plasmider ved forskellige kopinumre, der kræver brug af flere antibiotika. Mutationer i plasmid kan ødelægge transskription af antibiotikaresistens gener og indskyde med ressourcer forvaltning i cellen, der fører til nekrose. Den valgte koloni er sat på en glasbundet petriskål, og et par fokusplaner er udvalgt til mikroskopisporing i både lyse felt- og fluorescerende domæner. Protokollen opretholder billedfokus i mere end 12 timer under indledende forhold, der ikke kan reguleres, hvilket skaber nogle få vanskeligheder. For eksempel begynder døde celler at akkumulere i linsernes fokusområde efter et par timers billeddannelse, hvilket får toksiner til at opbygge og signalet til at sløre og forfalde. Udtømning af næringsstoffer introducerer nye metaboliske processer og hindrer kredsløbets ønskede respons. Eksperimentets temperatur sænker effektiviteten af inducere og antibiotika, hvilket yderligere kan skade signalets pålidelighed. Den minimale mediegel krymper og tørrer, og som følge heraf ændres det optiske fokus over tid. Vi udviklede denne metode til at overvinde disse udfordringer i Escherichia coli, svarende til tidligere værker, der udvikler analoge metoder til andre mikroorganismer. Derudover tilbyder denne metode en algoritme til at kvantificere den samlede stokastiske støj i uændrede og ændrede celler og finder ud af, at resultaterne er i overensstemmelse med flowanalysatorforudsigelser som vist ved en lignende variationskoefficient (CV).
Introduction
Syntetisk biologi er et tværfagligt område, der er opstået i det seneste årti og har til formål at omsætte tekniske designprincipper til rationelt biologisk design1,2,3, i et forsøg på at opnå multisignalintegration og behandling i levende celler til forståelse af grundforskningen4,5, diagnostiske, terapeutiske og bioteknologiske applikationer6,7,8,9,10. Vores evne til at kvantificere input-output respons syntetiske gen kredsløb er blevet revolutioneret af de seneste fremskridt inden for encellet teknologi, herunder flow analysator og levende celle billeddannelse ved hjælp af automatiseret time-lapse mikroskopi11. En flowanalysator bruges ofte til at måle reaktionen fra disse kredsløb i stabil tilstand1,12, og omvendt mikroskopi bruges til at måle den dynamiske respons fra syntetiske genkredsløb på niveau med en enkelt celle3. For eksempel involverede et af de tidlige værker i syntetisk biologi opførelsen af genetiske oscillatornetværk i levende celler ved hjælp af negative feedback-sløjfer med en forsinkelse3. Senere blev de genetiske oscillatorkredsløb anvendt til at forstå metabolisk kontrol i det dynamiske miljø i levende celler4. Automatiseret time-lapse mikroskopi er en metode til at karakterisere sådanne kredsløb. Vi hypotese, at værten celler, Escherichia coli, synkronisere, når der dannes mikrokolonier, så måling af signal og beregning af støj uden at spore nøjagtige mor-datter relationer.
Støj er et grundlæggende, iboende aspekt af biologiske systemer, der ofte stammer fra flere kilder. Overvej for eksempel biokemiske reaktioner, der involverer signaler, der stammer fra transport af diskrete tilfældige bærere som diffusion af proteiner13. Disse signaler spredes med tilfældige udsving14. Andre støjkilder er ressourcetilgængelighed, celledeling og variationer i miljøforhold som temperatur, fugtighed og tryk. Biologiske signaler, der spredes i syntetiske genkredsløb, har ofte et meget lavt signal til støjforhold (SNR), hvilket forstyrrer sådanne kredsløbs ydeevne. Derfor er genetisk kredsløbsdesign fortsat et af de mest udfordrende aspekter af genteknologi15. I modsætning til de fleste metoder, der kun beregner middelgenudtrykket (målt over hele cellepopulationen), overvejes variansen af det målte signal for at konstruere forudsigelig adfærd gennem syntetiske gennetværk12. Som sådan spiller variabilitets- eller støjniveauerne i proteinudtrykket en dominerende rolle i design og ydeevne af analoge og digitale genkredsløb1,16,17.
Der er udviklet mange metoder til at kvantificere celle-til-celle-variabilitet, herunder i Escherichia coli3,7,18. Disse metoder bruges ofte til at studere genaktivering og metaboliske veje, men med mindre fokus på studiet af stokastisk støjdynamik, som måling og disentangling specifikke støjkilder, især for genetiske kredsløb i levende celler, hvor dette er en grundlæggende udfordring19,20,21. Flere faktorer, både arvet til selve kredsløbet (iboende) og afledt af værtscellerne (ydre), kan forstyrre den kontinuerlige ydeevne af genetiske kredsløb. I dette papir udviklede vi en protokol, der har til formål at kvantificere den samlede støj i Escherichia coli-celler, herunder de iboende og ydre støjkilder6,22. Ved at kvantificere den samlede støj og derefter evaluere SNR23kan designet af genkredsløb forbedres. Denne metode kan ændres for at måle uafhængige støjkilder separat ved at overvåge flere fluorescerende proteiner6,20. For den protokol, der er beskrevet her, holder vi miljøforholdene godt kontrolleret og måler løbende cellernes aktivitet uden påvirkning af eksterne faktorer. Vi måler signalet fra fluorescerende proteiner i enkelte celler over tid og samtidig billede dem under en agarose substrat. De resulterende billeder analyseres ved hjælp af laboratoriets brugerdefinerede MATLAB.
Ideelt set vil kontinuerlig måling af realtidsaktiviteten af fluorescerende proteiner inde i en celle producere nøjagtige data gennem cellernes vækst og opdeling. Det er imidlertid en udfordring at erhverve sådanne data. Dette skyldes nedbrydning af fluorescerende proteiner, kendt som fotoblegning7, når de udsættes for stråling i excitationsprocessen. Desuden er Escherichia coli celler også følsomme for excitation, hvilket kan føre til fototoksicitet7. Begge problemer begrænser mængden af fotorammer, der kan erhverves, og tiden mellem erhvervelser. Det substrat og de mellemtyper (f.eks. lysogene bouillon), der bruges til at dyrke cellerne under billeddannelse, spiller også en afgørende rolle. Vi anbefaler på det kraftigste at bruge minimalt medium, hvilket minimerer ikke-fluorescerende baggrund og forlænger celledelingstiden.
Desuden skal prøven fremstilles under hensyntagen til følgende krav (1) Lav celledelingshastighed giver mulighed for mindre hyppige eksponeringer for nøje billeddannelse af opdelingscyklussen og reducerer sandsynligheden for fototoksicitet og fotobleaching. Vi indstiller erhvervelsestiden til omkring halvdelen af den forventede mitosetid (2) Lav celletæthed i begyndelsen af eksperimentet giver mulighed for bedre ensartethed og sporbarhed af division. Celletætheden påvirkes af fortyndingsforholdet for Escherichia coli-cellerne, som er en væsentlig parameter for denne protokols succes og skal bestemmes for hvert laboratorium. For at fastslå forholdet bør hver ny Escherichia coli-stamme eller de anvendte medier være forsynet med vækstratediagrammer (supplerende figur 1). Der er opnået et passende forhold, hvis cellerne kan vokse uden yderligere rysten efter en kort inkubation fra en indledende tæthed på ca. OD600nm = 0,1. Celler i denne fase vil opdeles i henhold til miljøtemperaturen kun (3) Begrænsning af cellebevægelse: cellebevægelse afhænger stærkt af substrat (agarose pad) fasthed. Substratet fasthed afhænger af mængden af total agarose og gel størkning tid. Geler kan ikke overlades til størkne natten over ved stuetemperatur, da Escherichia coli vil gennemgå mitose. Andre faktorer, der påvirker substratstabiliteten, omfatter mængden af vand i prøven og fugtigheden. Yderligere spørgsmål behandles i detaljer i de repræsentative resultater. Denne protokol indeholder mange detaljer og flytter gradvist fra et trin til et andet. Protokollen giver lang stabilitet til billedeksperimenter og giver et grundlæggende billedbehandlingsværktøj.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde udviklede vi en protokol, der muliggør computersporing af Escherichia coli levende celler efter division og fluorescerende niveauer over en periode på timer. Denne protokol giver os mulighed for at kvantificere den stokastiske dynamik i genetiske kredsløb i Escherichia coli ved at måle CV’et og SNR i realtid. I denne protokol sammenlignede vi den stokastiske adfærd i to forskellige kredsløb som vist i figur 10. Det har vist sig, at plasmider med lave kopinumre er m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mr. Gil Gelbert (Fakultetet for Elektroteknik, Technion) for at hjælpe med MATLAB-koden. Vi takker Dr. Ximing Li (Fakultetet for bio-medicinsk Engineering, Technion) for at hjælpe med proofing denne artikel. Denne forskning blev delvist støttet af Neubauer Family Foundation og Israel Ministry of Science, tilskud 2027345.
Materials
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD – Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD – Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD – Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B., Harwood, C., Jensen, G. . Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
- Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
- Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
- Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
- Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
- Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
- Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
- Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
- Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
- Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. . Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
- Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
- Van Der Ziel, A. . Noise in Measurements. , (1976).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
- Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. . SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells – Stylianidou – 2016 – Molecular Microbiology. , (2016).
- Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
- Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
- Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
- Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
- Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society – Biology Science. 207, 187-217 (1980).
- Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
- Soille, P. . Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
- Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
- Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
- Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).
