Summary

Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen

Published: April 29, 2020
doi:

Summary

Präsentiert wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts zur effektiven Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen.

Abstract

Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine membranöse Vesikel, die in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt und im ganzen Körper zirkuliert. Da sie verschiedene elterzellabgeleitete Biomoleküle wie DNA, mRNA, miRNA, Proteine und Lipide enthalten, sind ihre Anreicherung und Isolierung entscheidende Schritte für ihre Ausnutzung als potenzielle Biomarker für klinische Anwendungen. Herkömmliche Isolationsmethoden (z. B. Ultrazentrifugation) verursachen jedoch signifikante Verluste und Schäden an Mikrovesikeln und Exosomen. Diese Methoden erfordern auch mehrere sich wiederholende Schritte der Ultrazentrifugation, Desagung und Verschwendung von Reagenzien. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Origami-Papier-basierten Geräts (Exo-PAD), das für die effektive Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen auf einfache Weise entwickelt wurde. Das einzigartige Design des Exo-PAD, bestehend aus akkordeonartigen mehrfaltigen Schichten mit konvergenten Probenbereichen, ist in die Ionenkonzentrationspolarisationstechnik integriert und ermöglicht so eine fünffache Anreicherung der Mikrovesiken und Exosomen auf bestimmte Schichten. Darüber hinaus werden die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen durch einfaches Entfalten des Exo-PAD isoliert.

Introduction

Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine Membranbläschen mit einer Größe von 0,2 x 1 m bzw. 30 bis 200 nm. Sie werden von mehreren verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5in die extrazelluläre Umgebung sezerniert. Sie enthalten elterliche Zellinformationen in Form von Teilmengen von DNA, mRNA, miRNA, Proteinen und Lipiden und zirkulieren im ganzen Körper über verschiedene Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser und Speichel6,7,8,9. So können Techniken zur effizienten Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten umfangreiche Möglichkeiten in den Bereichen Diagnose, Prognose und Echtzeitüberwachung von Krankheiten sowie bei der Entwicklung neuer Therapeutika bieten.

Die herkömmliche Isolationsmethode für Mikrovesikeln und Exosomen auf Basis der Ultrazentrifugation ist jedoch extrem zeitaufwändig und verursacht einen erheblichen Verlust und eine Kontamination der Probe. Dies liegt daran, es beinhaltet mehrere umständliche Pipettier- und Ladeschritte und das Wegwerfen verschiedener Reagenzien mit wiederholter Ultrazentrifugation5,6,10,11,12. Darüber hinaus kann die hohe Scherspannung, die durch Ultrazentrifugation induziert wird (100.000 x g), die physikalische Lyse von Mikrovesikeln und Exosomen verursachen und zu schlechten Rückgewinnungsraten (5-23%)6,13,14führen. Daher muss eine hocheffiziente, unauffällige Isolationstechnik für Mikrovesikeln und Exosomen entwickelt werden, um Schäden und Verluste zu reduzieren und so höhere Rückgewinnungsraten zu erzielen.

Ein Origami-Papier-basiertes Gerät (Exo-PAD) wurde für eine einfachere, schonendere und hocheffiziente Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen6entwickelt. Das Design des Exo-PAD ist ein mehrfaches Papier mit seriell verbundenen Probenbereichen, die allmählich im Durchmesser abnehmen. Die Ionkonzentrationspolarisationstechnik (ICP), ein nano-elektrokinetisches Phänomen, das geladene Biomoleküle vorkonzentriert, wurde in dieses einzigartige Design integriert. Der Einsatz des Exo-PAD führte zu einer fünffachen Anreicherung der Mikrovesikeln und Exosomen in bestimmten Schichten und deren Isolierung durch einfaches Entfalten des Geräts. Dieser Artikel beschreibt die Exo-PAD im Detail, von der gesamten Gerätefertigung und -bedienung bis zur Analyse ihrer Verwendung, um die Methode zu veranschaulichen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen6.

Protocol

1. Gerätefertigung Definieren Sie den Bereich, der auf Papier gedruckt werden soll, mit DerDruckersoftware (Tabelle der Materialien).HINWEIS: Das Design hat 12 wachsgemusterte Schichten, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von 5 mm bis 2 mm verengen(Abbildung 1A). Drucken Sie hydrophobes Wachs auf den ausgewiesenen Bereichen auf beiden Seiten des Zellulosepapiers (Materialtabelle) mit einem kom…

Representative Results

Die Betriebszeit muss optimiert werden, um die maximale Rückgewinnungsausbeute der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu erreichen. Unzureichende Zeit erlaubt keine ausreichende Migration der Mikrovesiken und Exosomen, was die Anreicherung verringert, während übermäßige Zeit die räumliche Fokussierung verschlechtert und somit die Mikrovesiken und Exosomen dispergiert. So kann durch den Zeitoptimierungsschritt der maximale Präkonzentrationsfaktor von Mikrovesikeln und Exosomen und der endgültige Ort, an dem …

Discussion

Obwohl der Exo-PAD erfolgreich zur Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen eingesetzt wurde, sollten mehrere kritische Punkte sorgfältig berücksichtigt werden: 1) die Inkubationszeit und -temperatur des Ofens während der Gerätevorbereitung, 2) Verarbeitungszeit, 3) Anwendung von Spannung mit unterschiedlichen Schichtzahlen und Probenflächendurchmessern und 4) Anwendbarkeit auf klinische Proben.

Die im Protokoll angegebene Inkubationszeit und -temperatur sind optimierte …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von der National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444 unterstützt. J. H. Lee wurde 2019 durch ein Forschungsstipendium der Kwangwoon University unterstützt. Hyerin Kim wurde vom “Competency Development Program for Industry Specialists” des koreanischen Ministeriums für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) unterstützt, das vom Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-Programm zur industriellen Konvergenz tragbarer Intelligenter Geräte).

Materials

Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

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Cite This Article
Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

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