Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

doi: 10.3791/61295 Published: May 12, 2020
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

Abstract

미토콘드리아가 온코겐성 변화에 기여하는 것은 광범위한 관심과 적극적인 연구의 대상입니다. 암 대사 분야가 더욱 복잡해짐에 따라 미토콘드리아 손상(소위 미토칸)을 가하는 다양한 화합물을 이용한 미토콘드리아를 표적으로 하는 것이 매우 인기를 끌고 있습니다. 불행히도, 테트라졸륨 염이나 레사쥐린을 기반으로 하는 것과 같은 많은 기존 세포 독성 작용제는 그들의 성능을 위해 기능적인 미토콘드리아 효소가 필요합니다. 미토콘드리아를 표적으로 하는 화합물에 의해 가해진 손상은 수시로 이 심세의 정확도를 손상합니다. 여기서는 두 개의 형광 염료를 가진 차동 염색에 기초하여 변형된 프로토콜을 설명하고, 그 중 하나는 세포 분산(Hoechst 33342)이고 다른 하나는 그렇지 않다(예의 요오드). 염색의 차이는 살아있는 세포와 죽은 세포를 차별할 수 있게 합니다. 분석법은 처리량을 증가시키고 편견을 감소시키는 자동화된 현미경 검사법과 이미지 분석에 사용가능합니다. 이것은 또한 96 웰 플레이트를 사용하여 고처리량 방식으로 분석방법을 사용할 수 있게 해주며, 특히 문제의 약물이 어느 정도의 미토독성을 가지고 있을 때 약물 발견 노력을 위한 실행 가능한 옵션입니다. 중요하게도, Hoechst/PI 염색 분석체에 의해 얻은 결과는 분석이 다른 방법에 비교될 때 트라이판 블루 배제 결과 및 생물학적 복제 사이에 모두 증가된 일관성을 보여줍니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

효과적인 암 치료를 확인하는 첫 번째 단계는 치료의 효과를 검사하는 데 사용할 수있는 강력하고 편견없는 세포 독성 분석의 선택입니다. 낮은 처리량 실험에 대 한 일반적인 선택은 살아있는 세포에서 trypan 블루 염료의 제외. 이 방법은 세포 생존을 정량화하는 비교적 편견없는 방법을 허용하기 때문에 선호된다. trypan blue는 막이 손상된 세포로 수동적으로 확산되지만 건강한 세포1을입력하는 것이 효과적으로 차단됩니다. 살아있는 세포와 총 세포의 몫은 치료의 효험을 나타내는 백분율 생존력을 나타냅니다. trypan 파란색 분석의 가장 중요한 단점은 높은 처리량 방법론에 적합하지 않다는 것입니다. 그것은 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지고 있으며, 장기간 염색으로 인해 실행 가능한 세포의 얼룩으로 인해 아티팩트를 초래할 수 있습니다. 따라서 trypan 파란색 제외는 일반적으로2이며수동 계수로 강등됩니다. 이것은 너무 느리게 하고 연구원의 주관적인 판단으로 인한 편견의 강한 가능성을 소개합니다 (눈부신 또는 독립적 인 카운트가 사용되지 않는 한 실험실 처리량을 더 줄입니다). 일반적으로, 이 분석의 처리량은 현대 약 발견을 위해 불충분합니다.

일반적으로 훨씬 더 높은 처리량을 가진 생존 가능성 분석은 연구원이 이 한계를 우회할 수 있게 하지만 중요한 주의 사항(표 1참조). 이러한 메서드는 일반적으로 두 그룹으로 나뉩니다. 한 그룹은 세포 레독스 효소의 기능에 기초한 착색 분석으로 구성됩니다. 무색 또는 비형광 기판은 분광광계를 사용하여 정량화 할 수있는 생생한 제품으로 변환됩니다. 테트라졸륨 염(MTT, WST-1, XTT 등)과 레사쥐린등이 대표적인 예입니다. 이 범주에는 또한 ATP 수준을 평가하기 위해 루시페린을 활용하는 발광 성 소사도 포함됩니다. 이 모형의 분석은 세포 대사를 측정하는 근본적인 한계가 있습니다, 이는 세포 생존성이 아닙니다. 세포가 불리한 조건하에서 정지되는 것은 매우 일반적이지만, 여전히3,4,5를분할하는 능력을 유지합니다. 예를 들어, 암줄기세포는 종종 비교적 대사적으로정지6,7,8,9,이러한 기술을 사용하여 분석하기 어려울 가능성이 있다. 대부분의 미토칸과 같은 미토콘드리아 기능을 손상시키는 치료의 효과또한 상당히 과대 평가될 가능성이 높습니다.

다른 방법론은 생물학적 막을 교차하거나 교차하지 않도록 허용하는 다양한 물질의 화학적 특성을 활용합니다. 한 가지 예는 SYTOX 또는 프로피듐 요오드 (PI)와 같은 핵 얼룩입니다. 이 범주에는 또한 개념상 유사하지만 기능상 다른 분석(LDH) 분석, 세포 괴사의 지표로서 세포외 밀리유로LDH의 방출을 측정하는분석(도 1,표 1). 이 소는 신진 대사비활성 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있습니다.

분석/염료 세포 사멸의 유형(들) 검출 필요한 장비 주요 기능
MTT, CKK-8, 알라마 블루 (레사쥐린) 아포토시스/괴사증 분 광 광도 계 저렴, 빠른; 끝점 분석; 효소의 활성 (MTT의 경우 독점적으로 미토콘드리아)에 의존하고 세포 사멸 의 모드를 구별하지 않습니다1,10
LDH 릴리스 괴 사 분 광 광도 계 급속한, 미토콘드리아 효소의 활성과 무관; 높은 처리량 테스트에 대 한 비싼; 결합된 혈장 막11,12를 가진 괴사 세포를 검출합니다
트라이판 블루 (TB) 아포토시스/괴사증 현미경 세포 불굴의; 세포 사멸의 모드를 구별하지 않습니다; 고처리량 스크리닝에 적합하지 않은 고공처리량 스크리닝; 부착 셀과 함께 사용하기가 더 어렵다; 사용자의 주관적인 판단에 취약하지만 표준 셀 생존성 측정방법(13)으로 간주됩니다.
아크리딘 오렌지 (AO) 아포토시스/괴사/ 형광 현미경 독특한 스펙트럼 특성을 가진 핵산 염료는 세포석증과 괴사/necroptosis14를 구별할 수 있습니다.
네크로토시스
호흐트스트 33342, DAPI Apoptosis 형광 현미경 또는 유동 세포계 세포 투과성; 세포 사멸을 모니터링하는 것은 그 자체로 부적절합니다. 공동 염색에 유용합니다. 초기 세포사멸에서 크로마틴 응축 및 핵 단편화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 요오드제와 페어링하여 사멸을 괴사15,16과 구별할 수 있습니다.
프로피듐 이오드 (PI) 늦은 자멸/괴사 형광 현미경 또는 유동 세포계 세포 불굴의 인터칼레이터; 세포사멸의 후기 세포사멸 및 괴사 모드를 모두검출한다(17). 긴 잠복 시간18 후 독성 및 투과성

표 1. 세포 독성 검사 목록. 세포 독성 연구, 일부는이 연구에서 사용 되었다, 그들의 주요 기능에 대 한 간단한 설명과 함께 나열.

최근 연구에 따르면 미토콘드리아 대사가 일부 암19,20,21,22,23,24,25에서변경된다는 것을입증했습니다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)은 그들의 에너지 요구를 충족시키기 위하여 그들의 미토콘드리아 질량, mtDNA 함량 및 미토콘드리아 호흡을 강화시키는 것으로 나타났습니다19,26,27. 한편, 일부 고형종양은 OXPHOS에 관여하는 미토콘드리아 단백질의 다운조절또는 mtDNA 함량 감소와 같은 미토콘드리아 기능 장애 또는 오히려 "대사 재프로그래밍"을 특징으로 하며, 이는 종양 침습성, 전이성 전위 및 세포멸 유발 약물에 대한 내성과 관련이 있다28,29. 더욱이, 최근에는 특정 암에 대한 잠재적 치료법으로 미토콘드리아 기능(일반적으로 미토칸30이라고함)에 영향을 미치는 기계적으로 다양한 화합물을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다. 이들 약물은 ATP 합성, 미토콘드리아 DNA, OXPHOS 및 ROS 생산을 대상으로 하며, 미토콘드리아(30,31)와관련된 세포세포 및 세포세포 단백질을 표적으로 한다. 몇몇 연구 결과는 이 접근이 중요한 약속19,32,33,34가있다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 암 세포 생물학 또는 미토콘드리아 표적화 처리에 있는 이 신진 대사 편차는 미토콘드리아 기능에 근거를 둔 전통적인 생존가능성 소사에 현저하게 영향을 미칠 수 있습니다.

여기서, 차동 핵 염색 분석에 대한 최적화된 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 미토칸의 세포 독성 또는 다른 화합물과의 조합의 빠르고 정확한 측정을 허용합니다. Hoechst 33342는 세포막을 쉽게 교차시켜 DNA를 얼룩지게 하는 세포 침투 핵 염료로, 총 세포 수를 얻을 수 있게 한다. 죽은 세포의 핵만으로 들어가는 PI와 공동 염색함으로써, 살아있는 비율(Hoechst 만) 및 죽은(둘 다염색) 세포가 정확하게 결정될 수 있다. 이 프로토콜은 공표된분석법(35)을 단계별 염료 농도 최적화를 위한 단계(직교 트라이팬 블루 방법을 이용한 교차 참조 결과)와 이미징 전에 플레이트의 원심분리를 정제한다. 많은 세포주반 부착 또는 일시 중단되기 때문에 원심분리는 이미지화되어 정확도를 강하게 향상시키는 세포의 비율을 증가시킵니다. 분석법은 스테인링이 미디어 또는 세척을 제거할 필요가 없다는 것을 포함하여 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 혼합물은 또한 저렴하고, 준비하기 쉬우며, 멀티채널/로봇 파이펫팅 시스템과 호환됩니다.

세포가 염색된 후에, 그(것)들은 자동화한 현미경으로 심상입니다. 이는 나중에 다시 분석할 수 있는 이미지의 영구 기록을 만드는 장점이 있으며, 특정 화합물의 효과는 캡처된 이미지의 육안 검사에 의해 재평가될 수 있다. 이미지를 획득하면 셀을 수동으로 또는 무료(예: ImageJ, CellProfiler 등) 및 상용 소프트웨어(예: 변형, Gen5 등)를 포함한 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 셀을 계산할 수 있습니다. 자동화된 셀 카운팅은 일반적으로 수동 셀 계산보다 더 정확하고 편향이 적기 때문에 일반적으로 바람직합니다. 또한 세포 파편이나 용해성 복합체를 보다 효과적으로 무시합니다. 이러한 파이프라인의 개발은 일반적으로 간단하며 사용되는 얼룩의 효율성에 의해 단순화됩니다. 출력은 실제 죽은 세포의 수가 총 세포 수에 대하여 자동으로 계산되기 때문에 정량적이며, 다른 임계값은검출(35)의스트링성을 증가 또는 감소시키기 위하여 적용될 수 있다. 편의를 위해 Gen5 대 3.00 소프트웨어 호환 Cytation 5 셀 이미징 멀티 모드 리더를 사용하여 셀 을 계산하기 위한 최적화된 매개 변수가 포함되어 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 세포 독성 분석: 설정

  1. 적절한 매체에서 원하는 농도로 관심 있는 화합물의 솔루션을 준비한다(혈청 프리 또는 1, 2.5 또는 5% FBS RPMI-1640).
    1. 단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면 (예를 들어, 효과적인 복용량을 결정하기 위해), 2 배 최종 농도에서 화합물을 준비.
    2. 화합물 조합의 세포 독성을 측정하려면 4배 의 최종 농도에서 화합물을 준비하십시오.
    3. 동일한 양의 용매를 적절한 배지와 혼합하여 용매 전용 컨트롤을 준비합니다. 예를 들어, DMSO 및 메탄올에 용해된 화합물을 테스트하는 경우 각 용매에 대한 용매 전용 제어를 합니다.
  2. 배양 접시에서 세포를 수집하거나 15 mL 원추형 튜브로 플라스크합니다.
  3. 10 μL 0.4% 트라이팬 블루로 셀 서스펜션 10μL을 마이크로센심분리기 튜브와 얼룩으로 옮기다. 혈종계를 사용하여 각 세포 소스에 대해 실행 가능한 셀과 실행 불가능한 세포를 계산합니다.
  4. 펠릿 셀은 200 g에서 5 분 동안. 흡인 또는 열상.
  5. 3*105 세포/mL의 세포 밀도에서 분석에 적합한 매체(혈청 프리 또는 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640)에서 세포 펠릿을 재중단합니다.
    참고 1: 3*105 셀/mL의 세포 밀도는 15,000개의 세포/웰의 파종 밀도를 제공합니다. 시드 밀도는 중요한 매개 변수이며 이상적으로 실험 전에 미리 정의되어야합니다. 종자 밀도는 1) 세포 크기를 고려해야합니다 - 일반적으로 더 큰 세포는 낮은 밀도로 시드됩니다; 2) 처리 기간 - 세포는 일반적으로 더 오래 지속될 실험을 위한 더 낮은 밀도에서 시드됩니다; 및 3) 세포 분열 속도 - 분열의 더 높은 비율을 가진 세포는 더 낮은 밀도로 시드됩니다. 최적화된 파종 밀도의 특정 예: K562 셀, 더 큰, 24 시간 지속 시간 – 10,000 세포/웰; MOLM-13 세포, 적당한 크기, 24 시간 처리 – 15,000/well; MOLM-13 세포, 48 h 치료 – 8,000/웰; 작은 건강한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 24 시간 치료 – 50,000/웰; 1 차적인 AML 세포, 24 시간 처리 – 15,000-20,000/well.
    참고 2: 미디어에 FBS의 존재화합물의 활동에 영향을 미칠 수 있습니다. FBS의 농도를 감소시키는 것은 분석 결과를 해석하는 것을 더 간단하게 만들 수 있습니다, 그러나 또한 생리적 정확도를 감소시킵니다.
  6. 종자 50 μL의 세포 현탁액은 멀티 채널 파이펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰로 1.5 단계에서.
  7. 다음과 같이 화합물을 추가하십시오.
    1. 단일 화합물 스터디의 경우 각 웰에 2배 화합물 용액50 μL을 추가합니다. 용매 제어 우물의 경우 2배 농도에서 용매를 포함하는 50 μL의 테스트 미디어를 추가합니다.
    2. 조합 된 소의의 경우 각 화합물 (4x 용액)의 25 μL을 각 우물에 추가하십시오. 단일 복합 제어 우물의 경우 4배 화합물 용액 25μL과 25μL의 테스트 배지를 추가합니다. 용매 제어 우물의 경우 용매를 포함하는 테스트 배지 또는 테스트 배지의 50 μL을 추가합니다.
      참고 1: DMSO의 최종 농도는 0.5%를 초과해서는 안 됩니다.
      참고 2: 피펫이 각 웰의 벽을 터치하여 낮은 부피로 인해 화합물을 포함하는 미디어를 추가하는 것이 좋습니다.
  8. 접시를 부드럽게 탭하여 우물의 내용물을 혼합하십시오.
  9. 예를 들어, 24h에 적합한 시간 동안 가습 된 5 % CO2 분위기에서 37 °C에서 플레이트를 배양합니다.

2. 세포 독성 분석: Hoechst 33342 및 프로피듐 이오디드와 염색

  1. 10배 염색 용액을 준비합니다. 이 솔루션은 각 실험 전에 새로 준비해야하며 저장할 수 없습니다. 최종 염료 농도는 실험 전에 결정되어야 한다.
    1. 백혈병 세포주 및 1차 백혈병 세포의 경우, 1mL의 1mL의 1mL의 10mMHoechst 33342 및 멸균 PBS의 1 mg/mL 프로피듐 요오드의 50 μL(최종 농도: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL)이 함유되어 있습니다.
    2. 건강한 PBMC의 경우 1mL의 1mL의 10mML는 멸균 PBS의 20m Hoechst 33342 및 1mg/mL 프로피듐 요오드의 10 μL을 함유하고 있습니다(최종 농도: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μM/mL).
      참고: 요오드의 최종 농도는 실험 전에 결정되어야 합니다. 세포는 PI 농도 범위(1, 2.5, 5 μg/mL)를 사용하여 테스트해야 하며, Hoechst/PI 계산된 생존가능성은 트라이팬 블루를 통해 측정된 생존가능성과 비교되어야 합니다. 위에 나열된 PI 농도는 미디어 제어 우물에서 표적 세포 생존가능성을 기준으로 선택되었다(백혈병 세포주 경우 ~90%, 건강한 PBMC의 경우 ~70% 이상).
      주의: Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드는 잠재적인 발암 물질입니다. 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  2. 인큐베이션 후 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 10배 염색 버퍼의 10μL을 추가합니다.
    참고: 교차 오염을 방지하려면 파이펫 팁이 미디어에 닿지 않도록 하십시오.
  3. 접시를 부드럽게 탭하여 거품을 섞고 치웁립니다. 15 분 동안 37 °C에서 얼룩.
  4. 플레이트의 바닥에 모든 세포를 가져오는 4 분 동안 200g의 플레이트원심분리기. 젖은 김와이프로 플레이트 바닥을 조심스럽게 닦아 섬유 및/또는 이미징을 방해하는 이물질을 제거합니다.
    참고 1: 플레이트의 원심 분리는 모든 세포가 이미지에서 캡처될 확률이 가장 높습니다. 종종 죽은 세포는 분리하고 부유하여 세포 독성의 오해의 소지가있는 값을 제공합니다. 원심 분리는 이 효과를 완화합니다.
    참고 2: 원심 분리 후 15분 이내에 플레이트를 가능한 한 빨리 이미지화해야 합니다. 원심분리는 PI 염색의 선택성을 감소시킬 수 있으며 세포가 천천히 요오드를 발생시킬 수 있다. 죽은 세포를 시각화하여 얻은 정확도의 개선은 PI 염색의 약간의 증가보다 큽니다. 원심분리의 1 시간 이내에 이미징을 완료하는 것이 좋습니다.

3. 세포 독성 분석: 데이터 수집

  1. 자동 현미경/플레이트 이미저용 소프트웨어를 설정하여 Hoechst 33342(발아 최대 350nm, 방출 최대 461nm) 및 PI(발아 최대 493nm, 방출 최대 636nm)에 대한 형광을 감지합니다. 두 채널 모두에서 각 웰에 대한 이미지를 수집합니다.
  2. 소프트웨어(예: CellProfiler, MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ 또는 Gen5와 같은 독점 소프트웨어를 기반으로 하는 무료 이미지 분석 스튜디오)를 사용하여 각 채널의 각 웰의 셀을 계산합니다.
    참고: 모든 세포는 Hoechst 33342로 염색되어야 하고, 죽은 세포는 PI로 염색되어야 하기 때문에, 죽은 세포의 비율은 모두 죽은 세포의 분획을 나타냅니다. 예를 들어, 처리되지 않은 샘플에서 자동 수에 PI(죽은 세포)로 염색된 467개의 세포와 Hoechst 33342(총 세포)로 염색된 2335개의 세포를 나타내면, 분수는 0.2 또는 20%이다. 이 값은 치료가 사용된 동일한 처리된 샘플과 비교됩니다.
  3. Cytation5 셀 이미징 멀티 모드 리더 및 Gen5 대 3.00 소프트웨어를 사용하여 Hoechst/ PI 데이터 수집에 대한 자세한 설명:
    1. Cytation5 멀티 모드 플레이트 리더 /이미저를 평평한 바닥, 96 웰, 일반 검은 색 플라스틱 플레이트의 이미지 셀로 설정합니다.
    2. 표준 DAPI 및 텍사스 레드 필터 세트를 활용하도록 이미징 프로토콜을 설정합니다. 4배 배율 목표를 사용하여 웰 센터에서 이미지를 가져 가라. 오프셋(X/Y 또는 Z)을 사용하지 않습니다. DAPI – LED - 10, 통합 시간 - 99, 게인 - 0; 텍사스 레드 – LED - 8, 통합 시간 - 950, 이득 - 18. DAPI 신호를 사용하여 자동 초점 작업을 수행합니다. 채널 간에 초점을 맞추는 데 오프셋이 없어야 합니다.
    3. Gen5 소프트웨어 v 3.00을 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 소프트웨어 설정에서 셀을 크기가 5~25μm 사이의 모양으로 정의합니다. 특수 옵션 "분할 터치 오브젝트"를 켜서 기본 모서리 개체를 제외하고 터치 오브젝트를 분할합니다.  다음으로 이미지를 처리하여 배경(어두운 배경 빼기)을 제거하고, 핵 마스크(임계값 DAPI >= 6000 AU)를 적용하고 객체를 계산합니다. PI 염색(임계값 텍사스 레드 >= 5000 AU)을 기반으로 하위 인구 분석을 수행하고 개체수를 계산합니다. 셀 생존율 %는 (1 - Equation 1 로 정의된다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

전술한 프로토콜은 대표적인 급성 골수성 백혈병 세포주로서 취해진 OCI-AML2 세포를 사용하여 개발되었다. AML은골수(26)에서미분화 및 비기능성 조혈 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 한다. AML 표적 치료의 최근 발달에도 불구하고, 배려의 표준은 수십 년 동안 변경되지 않은 남아 있고, 유도 치료로 구성됩니다 (전형적으로 탄트라시클라인의 3 일, 예를 들면, daunorubicin, 이다루비신, 또는 탄트라네디온 미톡산 왕좌, 그리고 7 일간의 사이타라빈 의 다음) 그 다음에 통합 (전형적으로 사이타라빈 의 라운드의 라운드로구성)다음 통합 (전형적으로 사이타라빈 의 라운드의 라운드로 구성) 다음 .

도 1A에설명된 프로토콜에 따라, OCI-AML2 세포는 96웰 플레이트에서 종자되어 미토콘드리아 단자 탄산마그네닐 시안화 m-클로로페닐 히드라존(CCCP) 또는 글리코리틱 억제제 2-디옥시-디글루(2-D-글루코)로 처리하였다. 세포는 혈청이 없는 RPMI-1640 미디어에서 37°C에서 24시간 동안 처리된 다음 트라이판 블루(TB) 배제 또는 4개의 생존가능성 분석(Hoechst/PI 차동 핵 염색, LDH 방출 분석, MTT 또는 alamarBlue)을 사용하여 평가하였다. Hoechst/PI로 염색된 세포의 대표적인 이미지는 도 2A에도시된다. 몇 가지 중요한 관찰을 즉시 할 수 있습니다. 첫째, 총 세포 수(Hoechst 염색)는 합리적으로 높으며 죽은 세포의 수(PI 염색)보다 현저히 큽니다. 이것은 미디어 조건이 세포 죽음의 높은 비율을 트리거하지 않다는 것을 건의합니다. 둘째, Hoechst와 PI로 표지되는 세포만 죽은 것으로 계산되기 때문에(병합된 이미지의 보라색 세포), 이물질을 계산할 확률은 매우 낮습니다. 이 이미지는 제대로 염색 된 세포의 좋은 예를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1. 실험적 타임 라인 과 기존 세포 독성 연구의 비교. (A)실험 절차의 타임라인을 요약한 순서도(예: Hoechst/PI 염색) (B)세포 독성 의 비교, 일부는이 연구에서 사용 되었다. 염료 배제 분석에는 손상된 플라즈마 멤브레인으로 죽은 세포를 얼룩지게 하는 불변의 핵 염료를 포함합니다: TB – 트라이판 블루, PI – 프로피듐 요오드, EtBr – 에티듐 브로마이드 및 SYTOX. 제2기 아세약은 셀룰러 대사에 의존하며, 예를 들어 테트라졸륨 염 MTT, XTT 및 CKK-8(WST-8), 레사쥐린 기반 시약 알라마르블루 등은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. 트라이판 블루 제외와 세포 독성 분석의 패널의 비교. (A)총(Hoechst 33342) 및 죽은(프로피듐 요오드, PI) OCI-AML2 세포의 대표적인 이미지 (Hoechst/PI 염색을 통해) (B)CCCP(위) 또는 2-DG(아래) 농도의 그라데이션을이용한 치료 후 다른방법을 이용한 OCI-AML2 세포의 생존 가능성에 대한 평가. OCI-AML2는 세포 생존가능성을 결정하기 전에 24시간 동안 혈청이 없는 RPMI-1640에서 CCCP 또는 2-DG로 처리하였다. 표시된 의미, 오류 막대는 세포 독성분석(B) 트라이판 블루 염색 사이의 세포 생존능력의 차이를 나타낸다(정확한 숫자 및 중간 차이에 대한 보충표 S1-2 참조). 별은 차이를 나타냅니다. 트라이판 블루 스테인링. ** p < 0.01, *** p & 0.001, ns – 중요하지 않습니다. 그룹 비교는 여러 가설 테스트에 대한 수정과 t-테스트를통해 수행되었다. 3개의 독립적인 생물학 복제가 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리가 최근에19를보고했기 때문에, 백혈병은 세포가 이미 근본적인 미토콘드리아 손상을 가지고 있다는 것을 나타내는 미토독성 처리에 아주 민감합니다. 이를 토대로 미토콘드리아 효소 활성을 기반으로 하는 MTT와 알라마르블루 어설션이 세포 생존가능성을 부정확하게 측정할 것으로 예상했습니다. 예상대로, 이러한 분석 (특히 alamarBlue) trypan 블루 제외에 비해 상당히 낮은 생존력을 보였다, 그림 2B, C, 보충 테이블 S1-S2참조). 이것은 세포사멸 또는 괴사를 유도하는 데 필요한 이러한 화합물의 복용량이 미토콘드리아 기능을 손상시키는 데 필요한 것보다 높다는 사실과 일치합니다.

테스트된 소약 중, Hoechst 33342 및 PI를 이용한 이중 염색은 CCCP 또는 2-DG처리(보충 표 S1-2)에서TB 배제 방법에서 가장 작은 중간 편차로 결핵 염색과 견고성, 감도 및 일관성의 최상의 조합을 가졌다. 흥미롭게도, 더 높은 용량의 CCCP(50 및 100 μM)에서 Hoechst/PI 또는 TB로 추정된 생존력은 더 낮은용량(그림 2B,상단)에 비해 증가하였다. 이것은 그것의 소수성 때문에 더 높은 복용량에 CCCP의 강수량 때문일 가능성이 높습니다, 그것의 효과적인 농도 및 세포에 미치는 영향을 감소. CCCP의 투여량을 증가시켜 OCI-AML2 세포의 Hoechst/PI 추정 평균 생존가능성을 더욱 감소시켰지만, 150 μM에서 74%, 200 μM에서 62%, 30μM에서 6%(데이터가표시되지 않음).

Hoechst/PI 분석은 또한 그밖 미토콘드리아 표적분자를 가진 처리 후에 세포 생존가능성을 결정하는 데 효과적이었습니다. 여기에는 미토콘드리아 전자 수송사슬(37)의복합 I를 손상시키는 독인 로테네네와 미토콘드리아 호흡과 미토콘드리아 대사를 손상시키는 글리코리틱 억제제 및 알킬라기제38(그림 3A-D, 보충표 S3-4)이포함되었다.

Figure 3
그림 3. 백혈병 세포에서 Hoechst/PI 세포 독성 분석의 유효성 검사. (A,B)OCI-AML2(AML) 세포는 24시간 동안 혈청이 없는 RPMI-1640 미디어에서 로테네(A) 또는 3-브로모피로피아테, 3-BP(B)의 상이한 농도로 처리된 후 생존가능성이 결정되었다. 표시된 SEM.(C,D)Hoechst/PI 분석대 트라이판 블루 스테인링 간의 생존 가능성 차이의 비교(A-B의 셀의 경우, 수량에 대한 보충 표 S3-4 참조). 별은 통계적 유의와 트라이판 블루 염색을 나타냅니다. ** p < 0.01, *** p & 0.001, ns – 중요하지 않습니다. 그룹 비교는 여러 가설 테스트에 대한 수정과 t-테스트를통해 수행되었다. E.MOLM-13 (AML), 환자로부터 분리된 1차 AML 세포, MOLT-4(ALL), 및 K562(CML) 세포는 Hoechst/PI 염색을 사용하여 생존성 결정 전에 24시간 동안 혈청이 없는 RPMI-1640 매체에서 로테네의 표시 농도로 처리되었다. 표시된 것은 SEM을 의미합니다. 3개의 독립적인 생물학 복제가 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Hoechst/PI 세포 독성 분석은 백혈병의 다중 모형을 나타내는 백혈병 세포주 패널을 사용하여 추가로 검증되었습니다, 뿐만 아니라 1 차적인 세포. 그(것)들은 MOLM-13 (AML 세포주), 대표적인 참을성 있는 견본에서 파생된 1차 AML 세포, MOLT-4 (급성 림프구성 백혈병 세포주, ALL), 및 K562 (만성 골수성 백혈병 세포주, CML)(도 3E, 보충 피규어 S1)를포함했다. Hoechst/PI 분석의 결과는 이 세포가 매우 민감한 (MOLT-4)에서 내성 (K562) 세포에 이르기까지 로테네 감도에 깊은 차이가 있음을 보여주었습니다.

분석법의 견고성을 입증하기 위해 OCI-AML2 세포는 위의 프로토콜에 설명된 바와 같이 3-브로모피라바테의 농도 그라데이션으로 처리되었다. 세포 수는 각 농도에서 6개의 우물을 수집하여 도시하였다(그림4A, B). 이러한 카운트는 생존 가능성을 계산하는 데 사용되었으며, 4개의 우물이 분석결과(그림 4C)를정확하게 캡처하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 결과 용량 반응 곡선이도시된다(도 4D).

Figure 4
그림 4. Hoechst/PI 염색의 재현성. OCI-AML2 세포의 생존가능성 은 3-브로노피로바테(3-BP)의 다른 농도로 24h의 치료 후. (A)Hoechst 33342 염색을 통해 계산된 총 세포 수(B)공화요오드 염색을 통해 계산된 죽은 세포의 수. (C)생존가능성(%) (A-B)를사용하여 계산합니다. (D)대표적인 용량 반응 그래프. 표시된 것은 SEM을 의미합니다. 3개의 독립적인 생물학 복제가 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분석이 비교적 강력하지만 여전히 주의를 기울여야 합니다. 분석의 부적절한 성능은 정확도를 손상시킬 수 있습니다. 몇 가지 손상된 결과가 문제 해결 목적으로표시됩니다(그림 5). 첫 번째 이미지 세트는 PI와 과도하게 염색의 결과를 보여 주며, 이는 다음 소스에서 발생할 수 있습니다: 너무 높은 농도에서 염료를 사용하거나, 너무 오래 염색하거나, 빨간색 채널에서 너무 높은 LED 강도/통합 시간을사용(그림 5A). 이러한 오류는 죽은 세포의 인위적으로 팽창 된 수를 생성합니다. 두 번째 문제는 원심 분리 단계를 무시에서 발생합니다. 종종 죽은 세포는 접시 표면에서 부착물을 잃기 시작합니다. 따라서 이미지 수집 중에 과소 대표되며 일반적으로 우물 의 바닥 근처에서 발생합니다(그림5B). 마지막으로, Hoechst 채널의 과다 노출은 인위적으로 세포의 크기를 확장하여 우물당 총 수를 현저히 감소시키고 분석전력(도 5C)을제한합니다.

Figure 5
그림 5. 최적 및 최적 분석 매개 변수의 비교. 최적화된 매개 변수(왼쪽) 또는 최적 이하 매개변수(오른쪽)를 통해 획득한 결과를 비교합니다. (A)건강한 PBMC는 이미징 전에 15분 동안 1 μg/mL(왼쪽) 또는 5 μg/mL(오른쪽)에서 프로피듐 요오드로 염색하였다. (B)OCI-AML2 세포의 이미지 (왼쪽) 또는 (오른쪽) 플레이트 원심분리없이 촬영. (C)OCI-AML2 세포의 이미지는 Hoechst 채널에 대한 최적의(왼쪽) 또는 과도한(오른쪽) 통합 시간으로 획득하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

트라이판 블루 방법과의 차이, %
CCCP, μM 호흐트/PI LDH 분석 Mtt 알라마르 블루
3.1 -1.19 33.00 -31.05 -59.04
6.3 6.99 41.90 -11.03 -59.34
12.5 0.71 41.60 4.31 -52.52
25 30.73 66.33 -3.68 -51.85
50 47.38 50.71 -17.71 -60.27
100 13.81 17.12 -45.31 -67.25
중간 10.40 41.75 -14.37 -59.19

보충 표 S1. CCCP 치료 후 OCI-AML2 세포에서 의 실험 패널에 대한 생존 력 차이. 생존가능성에 대한 평가는 CCCP의 다양한 농도로 24시간 동안 치료한 후 수행되었다. 테스트된 분석(Hoechst/PI, LDH, MTT 또는 alamarBlue) 및 자동 계수가 있는 트라이판 블루 염색 사이의 평균 생존가능성 차이는 각 약물 농도의 생존 가능성 차이를 기준으로 계산되었다.

트라이판 블루 방법과의 차이, %
2-DG, mM 호흐트/PI LDH 분석 Mtt 알라마르 블루
3.1 16.16 20.77 5.82 -20.27
6.3 22.93 31.96 -11.13 -31.11
12.5 30.85 45.07 -34.27 -36.29
25 13.81 42.39 -55.79 -52.29
50 16.96 81.12 -29.38 -47.68
100 7.79 149.16 -19.37 -28.67
중간 16.56 43.73 -24.38 -33.70

보충 표 S2. 2-DG 치료 후 OCI-AML2 세포에서 의 실험 패널에 대한 생존 력 차이. 생존가능성평가는 2-DG의 다양한 농도로 24시간 치료 후 수행되었다. 테스트된 분석(Hoechst/PI, LDH, MTT 또는 alamarBlue) 및 자동 계수가 있는 트라이판 블루 염색 사이의 평균 생존가능성 차이는 각 약물 농도의 생존 가능성 차이를 기준으로 계산되었다.

로테네네, μM 생존력 차이, % (호흐트스트/피-트라이판 블루)
10 4.45
25 7.61
50 17.70
100 7.74
150 56.38
200 16.57
중간 12.15

보충 표 S3. 로테네 치료 후 OCI-AML2 세포에서 Hoechst/PI 및 결핵 배제 방법의 생존성 차이. 생존력의 평가는 로테네론의 다른 농도로 24 시간 치료 후에 수행되었다. Hoechst/PI와 자동 계수가 있는 트라이판 블루 염색 사이의 평균 생존력 차이는 각 약물 농도의 생존 가능성 차이를 기준으로 계산되었다.

3-BP, μM 생존력 차이, % (호흐트스트/피-트라이판 블루)
5 5.73
10 9.00
25 7.72
50 -1.90
100 -28.23
200 -20.77
M에디안 1.91

보충 표 S4. 3-브로모피로바테(3-BP) 치료 후 OCI-AML2 세포에서 Hoechst/PI 및 TB 배제 방법 간의 생존성 차이. 생존가능성 평가는 3-BP의 상이한 농도로 24시간 후 수행되었다.

보충 도면 S1. Hoechst/PI로 염색된 세포의 대표적인 이미지, 24시간 동안 혈청 이없는 RPMI-1640 매체에서 표시된 농도에서 로테네 처리 유무에 관계없이 A-B. AML: 대표적인 환자 샘플로부터 유래된 MOLM-13세포주(A)및 1차 AML세포(B). C. 모두: MOLT-4 세포주. D. CML: K562 셀라인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hoechst/PI 세포 독성 분석에 대한 프로토콜은 견고하고 비교적 작은 실습 시간이 필요하지만 정확한 결과를 보장하는 데 매우 중요한 몇 가지 실험 적 세부 사항이 있습니다. 첫째, DMSO의 농도가 0.5%(v/v) 이하로 유지되도록 하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 DMSO의 저용량에도 노출되면 세포의 형태와 부착을 실질적으로 변화시키고 세포 주기 진행을 크게 지연시킬 수 있다는 데동의된다39,40.

둘째, 염색은 치료 후 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 세척 단계가 없기 때문에 화합물은 우물에 남아 있으며 세포에 손상을 계속 가할 수 있습니다. 이전프로토콜(35)에비해, 세포는 단지 15분 동안 염색되었다. 이것은 실행 가능한 세포가 프로피듐 요오드로 실수로 얼룩질 수 있다는 가능성을 제한합니다. 이러한 이유로, 우리는 두 개 이상의 플레이트가 치료될 경우 엄청난 치료와 염색을 제안합니다. 이것은 플레이트 사이의 이미징 시간을 허용하고 재현성을 향상시킵니다.

셋째, 적절한 염료 농도는 세포 유형에 의존한다. 피스트팬 블루 스테닝을 직교 참조로 사용하여 치료되지 않은 세포로 시작하여 최적화된 프로피듐 요오드 농도를 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다.

마지막으로 시각화 직전에 원심분리 단계도 중요합니다. 이 프로토콜에 기초하여, 500-4,000 세포의 범위가 기록됩니다 (파종 밀도에 따라 다름). 이것은 이전에 잘 사용 된 100-400 세포당 주목할만한개선이다 35. 암세포의 인구(특히 1차 세포)의 변이를 고려할 때, 분석을 위해 더 많은 세포를 갖는 것이 중요하며, 더 강력한 데이터 분석을 허용할 수 있다.

방법의 상대적 단순성으로 인해 다양한 수정을 쉽게 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 다른 세포 불굴의 염료는 여러 공급 업체에서 사용할 수 있으며 프로디듐 요오드로 대체 될 수 있습니다. 이 대체값은 그 자체로 상대적으로 적은 값을 가지고 있지만, 색상의 팔레트가 증가하면 더 복잡한 실험을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 제3색을 첨가하면 일반적으로 유동 세포측정을 통해 수행되는 바와 같이 세포의 하위 집단 간에 차동 생존을 평가할 수 있습니다.

프로토콜을 보다 실질적으로 수정하면 셀 시각화를 예측하고 대신 분광계를 사용하는 것입니다. 이 방법은 거의 유비쿼터스 한 장비 (마이크로 플레이트 판독기가있는 표준 분광측계)를 활용하는 장점이 있으며 데이터를 획득하는 가장 빠른 방법입니다. 그러나 이 방법은 훨씬 덜 정확합니다. 형광 강도는 세포 염색을 대표하지만, 염색 강도의 금욕적 변화는 상대적으로 작은 샘플 영역과 결합되어 상당한 가변성을 유발합니다. 추가 최적화(예: 고정, 추가 세척 단계 또는 더 많은 수의 샘플 포함)가 이러한 문제를 해결할 수 있지만 형광 현미경 검사는 일반적으로 우수한 접근법입니다.

결론적으로, 수정된 Hoechst/PI 프로토콜은 미토콘드리아 기능과 무관한 빠르고 정확하며 저렴한 고처리량 세포 독성 분석입니다. 이 분석은 미토콘드리아를 대상으로 화합물 또는 화합물 조합을 효율적으로 선별하기위한 상당한 유틸리티를 가지고 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

NVK, 암 연구에 있는 CPRIT 학자, 그들의 관대 한 지원에 대 한 텍사스의 암 예방 및 연구 연구소 (CPRIT) 감사, CPRIT 부여 RR150044. 이 작품은 또한 웰치 재단 연구 보조금 C-1930에 의해 지원되었다, 건강 R35 GM129294 NVK에 수여 국립 연구소에 의해. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose/2-DG Chem-Impex 50-519-067
3-bromo-pyruvate Alfa Aesar 1113-59-3
96-Well plates Greiner Bio-One 655090 Black or clear flat-bottomed 96-well plates
Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)  Thermo Fisher A50101
Countess II automated cell counter Thermo Fisher
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek
Hoechst 33342 Thermo Fisher 62249 20 mM solution; final concentration 1:1,000
HyClone fetal bovine serum GE Healthcare #25-514
m-chlorophenylhydrazone/CCCP Sigma Aldrich C2759
PBS tablets Thermo Fisher BP2944100 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Gibco 10378016
Pierce LDH assay kit Thermo Fisher 50-103-5952
Propidium Iodide Thermo Fisher 50-596-072 Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs)
Rotenone Ark Pharm AK115691
RPMI-1640 Medium
With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Sigma Aldrich R8758-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide ACROS Organics AC158990010
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Cell lines
K562 ATCC CCL-243 CML cell line
MOLM-13 ATCC AML cell line
MOLT-4 ATCC CRL-1582 ALL cell line
OCI-AML2 ATCC AML cell line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, (3), 223-233 (2010).
  2. Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38, (6), 857-863 (2016).
  3. Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17, (4), 377-387 (2016).
  4. Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
  5. Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36, (10), 1180-1192 (2015).
  6. Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117, (17), 4092-4099 (2011).
  7. Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2, (3), 136-150 (2013).
  8. Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33, (1), 116-128 (2014).
  9. Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116, (9), 1186-1194 (2017).
  10. McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88, (1), 125-131 (2003).
  11. Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
  12. Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
  13. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
  14. Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216, (4), 1163-1181 (2017).
  15. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16, (8), 1093-1107 (2009).
  16. Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 12, Unit 12.18 (2004).
  17. Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
  18. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12, (4), 219-228 (2014).
  19. Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10, (8), 617 (2019).
  20. Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22, (4), 547-560 (2012).
  21. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12, (3), 329-341 (2013).
  22. Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
  23. Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23, (3), 287-301 (2013).
  24. Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14, (20), 3242-3247 (2015).
  25. Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31, (2), 145-170 (2010).
  26. Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8, (8), (2019).
  27. Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125, (13), 2120-2130 (2015).
  28. Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
  29. Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858, (8), 686-699 (2017).
  30. Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13, (3), 199-208 (2013).
  31. Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20, (2), 201-222 (2014).
  32. Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6, (9), 24102 (2011).
  33. Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14, (3), 357-376 (2013).
  34. Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
  35. Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1, (1), 1-14 (2011).
  36. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115, (3), 453-474 (2010).
  37. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
  38. Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11, (3), (2019).
  39. Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86, (4), 651-661 (2012).
  40. Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8, (1), 14828 (2018).
미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pei, J., Panina, S. B., Kirienko, N. V. An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (159), e61295, doi:10.3791/61295 (2020).More

Pei, J., Panina, S. B., Kirienko, N. V. An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (159), e61295, doi:10.3791/61295 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter