Summary
Protokollet beskriver en snabb, hög genomströmning, tillförlitlig, billig och opartisk analys för att effektivt bestämma cellulär livskraft. Denna analys är särskilt användbar när cellernas mitokondrier har skadats, vilket stör andra analyser. Analysen använder automatiserad räkning av celler färgas med två nukleära färgämnen – Hoechst 33342 och propidium iodide.
Abstract
Mitokondriernas bidrag till onogen omvandling är ett ämne av stort intresse och aktiv studie. Eftersom området cancer metabolism blir mer komplex, målet att rikta mitokondrierna med hjälp av olika föreningar som orsakar mitokondriell skada (så kallade mitokaner) blir ganska populär. Tyvärr, många befintliga cytotoxicitet analyser, såsom de baserade på tetrazolium salter eller resazurin kräver funktionella mitokondriellt enzymer för deras prestanda. De skador som orsakas av föreningar som riktar mitokondrierna ofta äventyrar noggrannheten i dessa analyser. Här beskriver vi ett modifierat protokoll baserat på differentialfärgning med två fluorescerande färgämnen, varav en är cellpermeant (Hoechst 33342) och den andra av som inte är (propidium iodid). Skillnaden i färgning gör att levande och döda celler kan diskrimineras. Analysen är mottaglig för automatiserad mikroskopi och bildanalys, vilket ökar genomströmningen och minskar bias. Detta gör det också möjligt för analysen att användas i hög genomströmning mode med 96-brunns plattor, vilket gör det till ett lönsamt alternativ för drogupptäckt insatser, särskilt när drogerna i fråga har en viss nivå av mitotoxicitet. Viktigt, resultat som erhållits genom Hoechst /PI färgning analys visar ökad konsistens, både med trypan blå utslagning resultat och mellan biologiska replikat när analysen jämförs med andra metoder.
Introduction
Det första steget för att identifiera effektiva cancerbehandlingar är valet av en robust, opartisk cytotoxicitetsanalys som kan användas för att undersöka effekten av behandlingen. Ett vanligt val för låg-genomströmning experiment är uteslutandet av trypan blått färgämne från levande celler. Denna metod gynnas eftersom det tillåter en relativt opartisk metod för att kvantifiera cell överlevnad. trypan blå sprider passivt till celler vars membran äventyras, men det är effektivt blockeras från att komma in friska celler1. Kvoten av de levande cellerna och de totala cellerna representerar procentens livskraft, vilket indikerar effekten av behandlingen. Den mest betydande nackdelen med trypan blå analysen är att det är dåligt lämpad för hög-genomströmningsmetoder. Den har en relativt låg signal-brus-förhållande och långvarig färgning kan resultera i artefakter på grund av färgning av livskraftiga celler. Följaktligen trypan blå uteslutning är typiskt, men inte alltid2, förpassas till manuell räkning. Detta gör det för långsamt och inför den starka möjligheten till partiskhet på grund av subjektiva dom av forskaren (om inte bländande eller oberoende räknas, vilket ytterligare minskar laboratoriegenomströmningen). I allmänhet är genomströmningen av denna analys otillräcklig för modern läkemedelsupptäckt.
Lönsamhetsanalyser, som i allmänhet har en mycket högre genomströmning, gör det möjligt för forskare att kringgå denna begränsning, men kommer med betydande förbehåll (se tabell 1). Dessa metoder faller i allmänhet i två grupper. En grupp består av koloritiska analyser som är baserade på funktionen av cellulära redoxenzymer. Färglösa eller icke-fluorescerande substrat omvandlas till livfulla produkter som kan kvantifieras med hjälp av en spektrofotometer. Klassiska exempel är tetrazoliumsalter (MTT, WST-1, XTT, etc.) och resazurin. Denna kategori innehåller också självlysande analyser som utnyttjar luciferin för att utvärdera ATP-nivå. Assays av denna typ har den underliggande begränsningen att de mäter cellulär metabolism, som inte är cellulär viability per se. Det är ganska vanligt att celler blir quiescent under ogynnsamma förhållanden, men ändå behålla förmågan att dela3,4,5. Till exempel, cancer stamceller är ofta relativt metaboliskt quiescent6,7,8,9, och kommer sannolikt att vara svårt att assay med hjälp av dessa tekniker. Effektiviteten av behandlingar som skadar mitokondriell funktion, såsom de flesta mitokaner, är också sannolikt att vara betydligt överskattad.
En alternativ metodik utnyttjar de kemiska egenskaperna hos olika ämnen som gör det möjligt för dem att antingen korsa eller inte korsa biologiska membran. Ett exempel är nukleära fläckar som SYTOX eller propidium iodide (PI). Denna kategori omfattar även analyser som är liknande i begreppet men olika i funktion, såsom laktatdehydrogenas (LDH) analys, som mäter utsläpp av LDH i den extracellulära miljön som en indikator på cellulär nekros (Figur 1, Tabell 1). Dessa analyser är mer kapabla att skilja mellan metaboliskt inaktiva och döda celler.
| Analys/färgämne | Typ(er) av celldöden upptäckt | Nödvändig utrustning | Viktiga funktioner |
| MTT, CKK-8, Alamar Blå (resazurin) | Apoptos/Nekros | Spektrofotometer | Billigt, snabbt; endpoint-analys; beroende av enzymernas aktivitet (uteslutande mitokondriellt vid MTT) och inte diskriminerar mellan celldödslägen1,10 |
| LDH-utgåva | Nekros | Spektrofotometer | Snabb, oberoende av mitokondriellt enzymers aktivitet; dyrt för tester med hög genomströmning, upptäcker nekrotiska celler med kompenserat plasmamembran11,12 |
| Trypan Blå (TB) | Apoptos/Nekros | Mikroskop | Cell-impermeant; inte diskriminerar mellan celldödslägena, laborous och inte lämplig för hög genomströmning screening; svårare att använda med anhängare celler; benägna att subjektivt omdöme av användaren, men anses vara standard cellens livskraft mätmetod13 |
| Acridine orange (AO) | Apoptos/Nekros/ | Fluorescensmikroskop | En nukleinsyra färgämne med unika spektrala egenskaper, kan skilja mellan apoptos och nekros / necroptosis14 |
| Necroptosis | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptos | Fluorescensmikroskop eller flödescytometer | Cell-genomsläpplig; olämpligt på egen hand för att övervaka celldöden; användbart för co-färgning; kan användas för att bedöma kromatinkondensering och nukleifragmentering i tidig apoptos; kan paras ihop med propidium-iodid för att skilja apoptos från nekros15,16 |
| Propidium iodid (PI) | Sen apoptos/Nekros | Fluorescensmikroskop eller flödescytometer | Cell-impermeant intercalator; upptäcker både sen apoptos och nekros lägen för celldöd17. Giftigt och genomsläppligt efter långa inkubationstider18 |
Tabell 1. Lista över cytotoxicitetsanalyser. Cytotoxicitet assays, av vilka några användes i denna studie, anges tillsammans med kort beskrivning av deras nyckelfunktioner.
Nyligen genomförda studier har visat att mitokondriell metabolism ändras i vissacancerformer 19,20,21,22,23,24,25. Till exempel har akut myeloisk leukemier (AML) visats upregulate deras mitokondriell massa, mtDNA innehåll, och mitokondriell andning för att möta deras energi krav19,26,27. Å andra sidan, vissa solida tumörer kännetecknas av mitokondriell dysfunktion, eller snarare "metabolisk omprogrammering", såsom nedreglering av mitokondriellt proteiner som deltar i OXPHOS eller minskad mtDNA innehåll, som har associerats med tumörinvasivitet, metastaserande potential och resistens mot apoptos-inducerandeläkemedel 28,29. Dessutom, nyligen, Det har varit ett ökat intresse för att använda mekanistiskt olika föreningar som påverkar mitokondriell funktion (allmänt kallas mitokaner30), som potentiella terapier för särskilda cancerformer. Dessa läkemedel mål ATP syntes, mitokondriellt DNA, OXPHOS, och ROS produktion, samt pro-apoptotiska och anti-apoptotiska proteiner i samband med mitokondrierna30,31. Flera studier har visat att detta tillvägagångssätt har betydandelöfte 19,32,33,34. Dessa metaboliska avvikelser i cancer cellbiologi eller mitokondrier-inriktning behandlingar kan dock avsevärt påverka konventionella lönsamhet assays som är baserade på mitokondriell funktionalitet.
Här beskrivs ett optimerat protokoll för en differentiell kärnfärgningsanalys. Protokollet tillåter snabb och noggrann bestämning av cytotoxicitet av mitokaner eller deras kombinationer med andra föreningar. Hoechst 33342 är ett cellpermeant kärnämne som lätt korsar cellmembran för att fläcka DNA, vilket gör att det totala celltalet kan erhållas. Genom co-färgning med PI, som bara kommer in i kärnorna av döda celler, kan andelen levande (Endast Hoechst) och döda (färgas med båda) celler exakt fastställas. Detta protokoll förfinar den publicerade analysen35 genom att lägga till ett steg för optimering av färgämnet koncentration (genom korsreferering resultat med ortogonal trypan blå metod) och centrifugeringen av plattan före bildbehandling. Eftersom många cellinjer är halvhäftande eller upphängda ökar centrifugeringen andelen celler som avbildas och förbättrar starkt noggrannheten. Analysen har flera fördelar, bland annat att färgning inte kräver borttagning av media eller tvättning. Färgämnet blandningen är också billig, lätt att förbereda, och kompatibel med flerkanals -/robotpittersystem.
Efter celler har färgats, de avbildas med ett automatiserat mikroskop. Detta har den extra fördelen att skapa en permanent post av de bilder som kan analyseras på nytt senare och effekterna av särskilda föreningar kan omvärderas genom visuell inspektion av tagna bilder. När bilder har erhållits kan celler räknas antingen manuellt eller genom att använda något av flera programvarupaket, inklusive både gratis (t.ex. ImageJ, CellProfiler, etc) och kommersiell programvara (t.ex. Metamorph, Gen5, etc). Automatiserad cellräkning är i allmänhet att föredra eftersom korrekt utvecklade automatiserade cellräkningspipelines är mer exakta och mindre partiska än manuella räkningar. De också mer effektivt bortse cell skräp eller olösliga komplex. Utvecklingen av dessa rörledningar är i allmänhet okomplicerad och förenklas genom effektiviteten hos de fläckar som används. Utdata är kvantitativa eftersom det faktiska antalet döda celler beräknas automatiskt med avseende på totalt celltal, och olika tröskelvärden kan tillämpas för att öka eller minska strängheten för detektering35. För enkelhetens skull ingår optimerade parametrar för att räkna celler med hjälp av Gen5 v. 3.00-programkompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cytotoxicitet analys: Setup
- Bered lösningar av föreningar av intresse vid önskade koncentrationer i lämpligt medium (serumfri eller 1, 2, 5, eller 5% FBS RPMI-1640).
- För att mäta cytotoxicitet av en enda förening (t.ex., för att bestämma effektiva doser), förbereda föreningar vid 2x slutlig koncentration.
- För att mäta cytotoxicitet av sammansatta kombinationer, förbereda föreningar vid 4x slutlig koncentration.
- Förbered kontroller med enbart lösningsmedel genom att blanda samma mängd lösningsmedel med lämpligt medium. Om till exempel testföreningar lösta i DMSO och metanol, gör kontroll med enbart lösningsmedel för varje lösningsmedel.
- Samla celler från odlingsfat eller kolv i ett 15 mL koniskt rör.
- Överför 10 μL cell suspension till ett mikrocentrifugrör och fläck med 10 μL 0,4% trypan blå. Använd en hemocytometer för att räkna livskraftiga och icke-viable celler för varje cell källa.
- Pelletsceller på 200 g i 5 min. Aspirera eller dekantera supernatant.
- Resuspend cell pellet i assay-lämpliga medier (serum-fri eller 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) vid en celltäthet av 3 * 105 celler/ mL.
ANMÄRKNING 1: Celltätheten på 3*105 celler/mL ger en sådddensitet på 15 000 celler/brunn. Sådddensitet är en viktig parameter och helst bör vara fördefinierade före försöket. Seeding densitet bör ta hänsyn till 1) cellstorlek – vanligtvis större celler är seedade vid en lägre densitet; 2) behandling varaktighet – celler är typiskt seedade vid en lägre densitet för experiment som kommer att pågå längre; och 3) celldelningshastighet – celler med högre delningshastighet sås med en lägre densitet. Specifika exempel på optimerad såddtäthet: K562 celler, större, 24 h varaktighet – 10.000 celler / väl; MOLM-13 celler, måttlig storlek, 24 h behandling – 15.000/brunn; MOLM-13 celler, 48 h behandling – 8 000/brunn; små friska perifert blod mononukleära celler (PBMCs), 24 h behandling – 50,000/well; primära AML-celler, 24 h behandling – 15 000-20 000/brunn.
NOT 2: Förekomsten av FBS i media kan påverka föreningarnas aktivitet. Minska koncentrationen av FBS kan göra analysresultat enklare att tolka, men det minskar också den fysiologiska noggrannheten. - Frö 50 μL cellfjädring från steg 1,5 in i varje brunn av en 96-brunnsplatta med hjälp av en flerkanalig pipett.
- Lägg till föreningar enligt följande:
- För enstaka sammansatta analyser, tillsätt 50 μL av 2x sammansatt lösning i varje brunn. För lösningsmedelsstyrnings brunnar, tillsätt 50 μL testmedia som innehåller lösningsmedlet vid 2x-koncentrationen.
- För kombinationsanalyser, tillsätt 25 μL av var och en av föreningen (4x lösningar) i varje brunn. För enstaka sammansatta-kontroll brunnar, tillsätt 25 μL av 4x sammansatt lösning och 25 μL av testmedium. För lösningsmedels-kontroll brunnar, tillsätt 50 μL testmedium eller testmedium som innehåller lösningsmedlet.
NOT 1: Den slutliga koncentrationen av DMSO bör inte överstiga 0,5%.
OBS 2: Det rekommenderas att lägga till de medier som innehåller föreningarna med pipetten vidrör väggen i varje brunn på grund av låg volym.
- Knacka försiktigt på plattan för att säkerställa blandning av brunnarnas innehåll.
- Inkubera plattor vid 37 °C i en fuktad 5% CO2 atmosfär för en lämplig tid, t.ex.
2. Cytotoxicitetsanalys: färgning med Hoechst 33342 och propidium Iodide
- Förbered 10x färgningslösning. Denna lösning måste förberedas färska före varje experiment, det kan inte lagras. Slutliga färgämneskoncentrationer bör fastställas före försöket.
- För leukemi cellinjer och primära leukemiceller, 1 mL av 10x färgning buffert innehåller 10 μL av 20 mM Hoechst 33342 och 50 μL av 1 mg/mL propidiumjodid i steril PBS (slutliga koncentrationer: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- För friska PBMC innehåller 1 mL 10x infärgningsbuffert 10 μL på 20 mM Hoechst 33342 och 10 μL av 1 mg/mL propidid i steril PBS (slutkoncentrationer: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
OBS: Den slutliga koncentrationen av propidium-iodid måste bestämmas före experimenten. Celler bör testas med hjälp av ett intervall av PI-koncentrationer (1, 2,5, 5 μg/mL), och därefter bör Hoechst/PI-beräknad viabilitet jämföras med via trypanblått. De PI koncentrationer som anges ovan valdes baserat på mål cellens livskraft i media-kontroll brunnar (ovan ~ 90% för leukemi cellinjer, över ~ 70% för friska PBMCs).
FÖRSIKTIGHET: Hoechst 33342 och propidiummid är potentiella cancerframkallande ämnen. Använd lämplig personlig skyddsutrustning när du hanterar dem.
- Efter inkubationen, använd en flerkanalig pipett för att lägga till 10 μL av 10x infärgningsbuffert till varje brunn.
OBS: För att förhindra korskontaminering, se till att pipettens spetsar inte vidrör media. - Knacka försiktigt på plattan för att blanda och rensa bubblor. Fläck i 37 °C i 15 min.
- Centrifugera plattan vid 200 g i 4 min för att få alla celler till botten av plattan. Torka försiktigt botten av plattan med en fuktig kimwipe för att ta bort fibrer och / eller skräp som kommer att störa bildbehandling.
NOT 1: Centrifugeringen av plattan säkerställer de högsta chanserna för alla de celler som ska fångas i bilden. Ofta döda celler kommer att lossna och flyta, vilket ger vilseledande värden av cytotoxicitet. Centrifugeringen mildrar denna effekt.
OBS 2: Plattan ska avbildas så snabbt som möjligt efter centrifugeringen, helst, inom 15 min. Centrifugeringen kan minska selektiviteten vid PI-färgning och kan tillåta celler att långsamt tillfalla propidium-iodid. Förbättringen i noggrannhet vunnits genom visualisera de döda cellerna överväger den lilla ökningen av PI färgning. Det rekommenderas att avsluta bildbehandling inom 1 h av centrifugeringen.
3. Cytotoxicitetsanalys: datainsamling
- Ställ in programvaran för den automatiserade mikroskop/plattbildaren för att detektera fluorescens för både Hoechst 33342 (excitation maximum 350 nm, utsläpps högst 461 nm) och PI (excitation maximum 493 nm, utsläpps maximalt 636 nm). Skaffa bilder för varje brunn i båda kanalerna.
- Använda programvaran (till exempel CellProfiler, en fri bild analys studio baserad på MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ, eller egenutvecklade programvara såsom Gen5) räkna cellerna i varje brunn i varje kanal.
OBS: Eftersom varje cell ska färgas med Hoechst 33342, och döda celler bör färgas med PI, förhållandet mellan döda till alla representerar den del av celler som är döda. Om det automatiserade antalet i obehandlat prov till exempel visar 467 celler som färgats med PI (döda celler) och 2335 celler som färgats med Hoechst 33342 (totalt antal celler), är fraktionen död 0,2 eller 20%. Detta värde jämförs sedan med ett identiskt hanterat prov där behandling användes. - Detaljerad beskrivning av Hoechst/PI datainsamling med hjälp av Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader och Gen5 v. 3.00 programvara:
- Ställ cytation5 multimode plattan läsare / imager till bildceller i plan botten, 96-väl, generiska svart plast plattor.
- Ställ in ett bildhanteringsprotokoll för att utnyttja standard-DAPI- och Texas Red-filteruppsättningarna. Ta bilder vid brunnen centrum med hjälp av en 4x förstoring mål. Använd ingen förskjutning (X/Y eller Z). Använd följande bildframställningsinställningar: DAPI – LED - 10, integrationstid - 99, förstärkning - 0; Texas Röd – LED - 8, integrationstid - 950, vinst - 18. Utför autofokusering med dapi-signalen; bör det inte finnas någon förskjutning i fokusering mellan kanaler.
- Utför bildanalys med hjälp av Gen5-programvara v 3.00. I programinställningarna definierar du celler som former mellan 5 och 25 μm i sin storlek. Uteslut primära kantobjekt och dela vidrör objekt genom att slå på specialalternativ "Dela vidrör objekt". Därefter bearbetar du bilden för att ta bort bakgrunden (subtraktion med mörk bakgrund), tillämpa en kärnmask (tröskelvärde DAPI >= 6000 AU) och räkna objekt. Utför en subpopulationsanalys baserad på PI-infärgning (tröskelvärde Texas Red >= 5000 AU) och räkna objekt. Cellens livskraft % definieras som (1 -
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det tidigare nämnda protokollet har utvecklats med hjälp av OCI-AML2 celler, som togs som en representativ akut myeloisk leukemi cellinje. AML kännetecknas av onormal proliferation av odifferentierade och icke-funktionella hematopoitiska celler i benmärgen26. Trots den senaste tidens utveckling inom AML riktad terapi, standarden på vården har varit oförändrad i flera decennier, och består av induktionsbehandling (vanligtvis består av tre dagar av antracyklin, t.ex., daunorubicin, idarubicin, eller antracenedione mitoxanthrone, och 7 dagar av cytarabin) följt av konsolidering (typiskt består av rundor av cytarabine behandling följt av perioder av återhämtning)36.
Efter det protokoll som beskrivs i figur 1A,såddes OCI-AML2-celler i 96-brunnsplattor och behandlades med den mitokondriella uncoupler kolyl cyanid m-klorofenylhydrazone (CCCP) eller den glykolytiska hämmaren 2-deoxy-D-glukos (2-DG) vid en rad koncentrationer. Celler behandlades för 24 h vid 37 °C i serum-free RPMI-1640 media, och sedan viabilitet bedömdes med hjälp av trypan blå (TB) uteslutning eller en av fyra lönsamhet analyser (Hoechst/PI differential nukleära färgning, LDH release assay, MTT eller alamarBlue). Representativa bilder av celler som färgats med Hoechst/PI visas i figur 2A. Flera viktiga observationer kan göras omedelbart. För det första är det totala antalet celler (Hoechst-färgning) någorlunda hög och är markant större än antalet döda celler (PI-färgning). Detta tyder på att medieförhållandena inte utlöser höga celldödstal. Andra, eftersom endast celler som är märkta med både Hoechst och PI räknas som döda (lila celler i den sammanslagna bilden), sannolikheten för att räkna skräp är mycket låg. Den här bilden visar ett bra exempel på korrekt färgade celler.
Bild 1. Experimentell tidslinje och jämförelse av befintliga cytotoxicitet analyser. (A) Flödesschema som sammanfattar tidslinjen för försöksförfarandet, t ex Hoechst/PI-infärgning. (B) Jämförelse av cytotoxicitetsanalyser, av vilka några användes i denna studie. Dye uteslutning assays innebär impermeant nukleära färgämnen som fläck döda celler med äventyras plasmamembran: TB – trypan blå, PI – propidium iodide, EtBr – ethidiumbromid, och SYTOX. Andra gruppen av analyser beror på cellulär metabolism, till exempel, tetrazoliumsalter MTT, XTT, och CKK-8 (WST-8), resazurin-baserade reagens alamarBlue, etc. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2. Jämförelse av en panel av cytotoxicitet analyser med trypan blå uteslutning. (A) Representativa bilder av totalt (Hoechst 33342) och döda (propidium iodid, PI) OCI-AML2-celler via Hoechst/PI-färgning. (B) Bedömning av viabiliteten hos OCI-AML2-celler med olika metoder efter behandling med en gradient av CCCP (överst) eller 2-DG (botten) koncentrationer. OCI-AML2 behandlades med CCCP eller 2-DG i serum-free RPMI-1640 för 24 h före bestämning av cellens livskraft. Visas är medelvärde, fel barer representerar SEM. C. Skillnad i cellens livskraft mellan cytotoxicitet analyser i (B) vs. trypan blå färgning (se Tilläggstabeller S1-2 för de exakta siffrorna och medianskillnaden). Stjärnor indikerar betydande skillnad vs. trypan blå färgning. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – icke-signifikant. Gruppjämförelse gjordes via t-test med korrigering för multipel hypotestestning. Tre oberoende biologiska replikat utfördes. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Som vi nyligen rapporterade19, leukemier är mycket känsliga för mitotoxiska behandlingar, vilket tyder på att cellerna redan har underliggande mitokondriell skada. På grundval av detta förutspådde vi att MTT och alamarBlue analyser, som är baserade på mitokondriell enzymaktivitet, skulle felaktigt mäta cellulär livskraft. Som väntat, dessa analyser (särskilt alamarBlue) visade betydligt lägre lönsamhet jämfört med trypan blå utestängning, se figur 2B,C, tilläggstabeller S1-S2). Detta är förenligt med det faktum att doser av dessa föreningar som krävs för att inducera apoptos eller nekros är högre än de som behövs för att äventyra mitokondriell funktion.
Bland de analyser som testades, hade dubbel färgning med Hoechst 33342 och PI den bästa kombinationen av robusthet, känslighet och konsekvens med TB-färgning, med den minsta medianavvikelsen från TB-uteslutningsmetod efter CCCP eller 2-DG-behandling (Tilläggstabeller S1-2). Intressant nog ökades vid högre doser av CCCP (50 och 100 μM) lönsamheten som uppskattades med Hoechst/PI eller TB jämfört med lägre doser (Figur 2B, överst). Detta beror sannolikt på att utfällningen av CCCP vid högre doser på grund av dess hydrofobiska, minska dess effektiva koncentration och påverkan på celler. Ökning av dosen av CCCP minskade ytterligare Hoechst/PI-uppskattade medelabiliteten hos OCI-AML2-celler, dock: 74% vid 150 μM, 62% vid 200 μM, 6% vid 300 μM (data som inte visas).
Den Hoechst/PI analysen var också effektivt vid bestämning av cellulär livskraft efter behandling med andra mitokondrier-inriktning molekyler. Dessa inkluderade rotenon, ett gift som kompromissar Komplex I av den mitokondriella elektrontransportkedjan37, och 3-bromopyruvat, en glykolytisk hämmare och alkylerande medel som försämrar mitokondriell respiration och mitokondriell metabolism38 (Figur 3A-D, Tilläggstabeller S3-4).
Bild 3. Validering av Hoechst/PI cytotoxicitet analys i leukemiceller. (A,B) OCI-AML2 (AML) celler behandlades med olika koncentrationer av rotenon (A) eller 3-bromopyruvate, 3-BP (B) i serum-fria RPMI-1640 media för 24 h, då lönsamheten fastställdes. Visas är medelvärde med SEM. (C,D) Jämförelse av lönsamhetsskillnad mellan Hoechst/PI-analys vs. trypan blå färgning (för cellerna i A-B, se Tilläggstabeller S3-4 för kvantitation). Stjärnor indikerar statistisk signifikans kontra trypan blå färgning. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – icke-signifikant. Gruppjämförelse gjordes via t-test med korrigering för multipel hypotestestning. E.MOLM-13 (AML), primära AML-celler som isolerats från en patient, MOLT-4 (ALL), och K562 (CML) celler behandlades med de angivna koncentrationerna av rotenon i serumfria RPMI-1640 media för 24 h, före viabilitetsbestämning med hjälp av Hoechst/PI-färgning. Visas är medelvärde med SEM. Tre oberoende biologiska replikat utfördes. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Den Hoechst/PI cytotoxicitet analysen validerades ytterligare med hjälp av en panel av leukemi cellinjer som representerar flera typer av leukemi, samt primära celler. De inkluderade MOLM-13 (en AML cellinje), primära AML-celler som härrör från ett representativt patientprov, MOLT-4 (en akut lymfatisk leukemi cellinje, ALLA), och K562 (en kronisk myeloisk leukemi cellinje, CML) (Figur 3E, Kompletterande Figur S1). Resultaten av Hoechst/PI-analysen visade att dessa celler hade djupgående skillnader i rotenonkänslighet, alltifrån mycket känsliga (MOLT-4) till resistenta (K562) celler.
För att visa analysens robusthet behandlades OCI-AML2-celler med en koncentrationsgradient på 3-bromopyruvate, som beskrivs i protokollet ovan. Cellantal samlades in för 6 brunnar vid varje koncentration och visas (Figur 4A,B). Dessa räknas användes för att beräkna lönsamheten, och visade att så få som 4 brunnar var tillräckliga för att exakt fånga assay utfall (Figur 4C). Den resulterande dos-responskurvan visas (Figur 4D).
Bild 4. Reproducerbarhet av Hoechst/PI-färgning. Genomgärning av OCI-AML2 celler efter 24 h av behandling med olika koncentrationer av 3-bromopyruvate (3-BP). (A) Totalt antal celler som räknats via Hoechst 33342 färgning, (B) Antal döda celler som räknats via propidium iodidfärgning. (C) Bärkraft (%) beräknas med hjälp av (A-B). (D) Representativt dos-respons graf. Visas är medelvärde med SEM. Tre oberoende biologiska replikat utfördes. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Även om analysen är relativt robust, måste försiktighet fortfarande tas. Felaktig prestanda av analysen kan äventyra dess noggrannhet. Flera komprometterade utfall visas i felsökningssyfte (figur 5). Den första uppsättningen bilder visar konsekvenserna av överfärgning med PI, som kan uppstå från följande källor: använda färgämnet vid för hög koncentration, färgning för länge, eller använda för hög LED-intensitet/integrationstid i den röda kanalen (Bild 5A). Dessa fel kommer att generera artificiellt uppblåsta antalet döda celler. Den andra frågan uppstår från att försumma centrifugeringen steg. Ofta börjar döda celler att förlora sin fastsättning från ytan av skålen. Följaktligen kommer de att vara underrepresenterade under bild förvärv, som i allmänhet sker nära botten av brunnen (Figur 5B). Slutligen utökar överexponering i Hoechst-kanalen på konstgjord väg cellernas storlek, vilket avsevärt minskar de totala antalet per brunn och begränsar analyseffekten (Figur 5C).
Bild 5. Jämförelse av optimala och suboptimala assayparametrar. Jämförelse av resultat som förvärvats via optimerade parametrar (vänster) eller suboptimala parametrar (höger). (A) Friska PBMC var färgas med propidium iodid vid 1 μg/mL (vänster) eller 5 μg/mL (höger) för 15 min före bildframställning. (B) Bilder av OCI-AML2-celler tagna med (vänster) eller utan (höger) plattcentrifugering. (C) Bilder av OCI-AML2 celler som förvärvats med optimal (vänster) eller överdriven (höger) integrationstid för Hoechst kanalen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Skillnad med metoden trypan blå, % | ||||
| CCCP, μM | Hoechst/PI | LDH-analys | Mtt | Alamar Blå |
| 3.1 | -1.19 | 33.00 | -31.05 | -59.04 |
| 6.3 | 6.99 | 41.90 | -11.03 | -59.34 |
| 12.5 | 0.71 | 41.60 | 4.31 | -52.52 |
| 25 | 30.73 | 66.33 | -3.68 | -51.85 |
| 50 | 47.38 | 50.71 | -17.71 | -60.27 |
| 100 | 13.81 | 17.12 | -45.31 | -67.25 |
| Median | 10.40 | 41.75 | -14.37 | -59.19 |
Kompletterande tabell S1. Viability skillnader för en panel av assays i OCI-AML2 celler efter CCCP behandling. Bedömning av lönsamhet utfördes efter 24 h behandling med olika koncentrationer av CCCP. Medianens viabilitetsskillnader mellan testade analyser (Hoechst/PI, LDH, MTT eller alamarBlue) och trypanblåfärgning med automatiserad räkning beräknades baserat på viabilitetsskillnader vid varje läkemedelskoncentration.
| Skillnad med metoden trypan blå, % | ||||
| 2-GD, mM | Hoechst/PI | LDH-analys | Mtt | Alamar Blå |
| 3.1 | 16.16 | 20.77 | 5.82 | -20.27 |
| 6.3 | 22.93 | 31.96 | -11.13 | -31.11 |
| 12.5 | 30.85 | 45.07 | -34.27 | -36.29 |
| 25 | 13.81 | 42.39 | -55.79 | -52.29 |
| 50 | 16.96 | 81.12 | -29.38 | -47.68 |
| 100 | 7.79 | 149.16 | -19.37 | -28.67 |
| Median | 16.56 | 43.73 | -24.38 | -33.70 |
Kompletterande tabell S2. Viability skillnader för en panel av assays i OCI-AML2 celler efter 2-DG behandling. Bedömning av livsduglighet utfördes efter 24 h behandling med olika koncentrationer av 2-DG. Medianens viabilitetsskillnader mellan testade analyser (Hoechst/PI, LDH, MTT eller alamarBlue) och trypanblåfärgning med automatiserad räkning beräknades baserat på viabilitetsskillnader vid varje läkemedelskoncentration.
| Rotenon, μM | Lönsamhetsskillnad, % (Hoechst/PI-trypan blå) |
| 10 | 4.45 |
| 25 | 7.61 |
| 50 | 17.70 |
| 100 | 7.74 |
| 150 | 56.38 |
| 200 | 16.57 |
| Median | 12.15 |
Kompletterande tabell S3. Lönsamhetsskillnad mellan Hoechst/PI och TB-uteslutningsmetod i OCI-AML2-celler efter rotenonbehandling. Bedömning av livsduglighet utfördes efter 24 h behandling med olika koncentrationer av rotenon. Medianens viabilitetsskillnad mellan Hoechst/PI och trypan blå färgning med automatiserad räkning beräknades baserat på viabilitetsskillnader vid varje läkemedelskoncentration.
| 3-BP, μM | Lönsamhetsskillnad, % (Hoechst/PI-trypan blå) |
| 5 | 5.73 |
| 10 | 9.00 |
| 25 | 7.72 |
| 50 | -1.90 |
| 100 | -28.23 |
| 200 | -20.77 |
| Mediska | 1.91 |
Kompletterande tabell S4. Genombilitetsskillnad mellan Hoechst/PI och TB-uteslutningsmetod i OCI-AML2-celler efter behandling med 3-bromopyruvat (3-BP). Bedömning av viabiliteten utfördes efter 24 h behandling med olika koncentrationer av 3- BP. Medianens viabilitetsskillnad mellan Hoechst/PI och trypan blåfärgning med automatiserad räkning beräknades baserat på viabilitetsskillnader vid varje läkemedelskoncentration.
Kompletterande figur S1. Representativa bilder av celler som färgats med Hoechst/PI, med eller utan rotenonbehandling vid indikerade koncentrationer i serumfritt RPMI-1640-media för 24 h: A-B. AML: MOLM-13 cellinje (A), och primära AML-celler (B) som härrör från ett representativt patientprov. C. ALLA: MOLT-4 cellinje. D. KML: K562 cellinje. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om protokollet för Hoechst/PI cytotoxicitet analys är robust och kräver jämförelsevis lite hands-on tid, det finns flera experimentella detaljer som är mycket viktiga för att säkerställa korrekta resultat. För det första är det väsentligt att se till att koncentrationen av DMSO förblir under 0,5% (v/v). Det är allmänt överens om att exponering för även låga doser av DMSO väsentligt kan förändra morfologi och fastsättning av celler och avsevärt fördröja cellcykelprogression39,40.
För det andra ska färgningen utföras så snart som möjligt efter behandlingen. Eftersom det inte finns några tvättsteg, förblir föreningen i brunnarna och kan fortsätta att tillfoga skada på cellerna. I jämförelse med det tidigare protokollet35, var cellerna färgas för endast 15 minuter. Detta begränsar möjligheten att livskraftiga celler oavsiktligt kan färgas med propidium iodid. Av denna anledning föreslår vi häpnadsväckande behandlingar och färgning om mer än två plattor kommer att behandlas. Detta möjliggör bildtagningstid mellan plattorna och förbättrar reproducerbarheten.
För det tredje är lämplig färgämneskoncentration beroende av celltyp. Det är viktigt att empiriskt bestämma den optimerade propidium iodidkoncentrationen, som börjar med obehandlade celler, med hjälp av trypan blå färgning som en ortogonal referens.
Slutligen är centrifugeringssteget omedelbart före visualisering också kritiskt. Baserat på detta protokoll registreras en räckvidd på 500-4 000 celler (beroende på sådddensitet). Detta är en anmärkningsvärd förbättring jämfört med 100-400 celler per väl använt tidigare35. Med tanke på variationen i populationen av cancerceller (särskilt primära celler), med fler celler för analys är viktigt, och kan tillåta mer robust dataanalys.
På grund av metodens relativa enkelhet kan en stor variation av modifieringar enkelt utföras. Till exempel, många andra cell-impermeant färgämnen finns från ett antal leverantörer och kan ersättas med propidium iodide. Medan denna ersättning har relativt lite värde på egen hand, den ökade paletten av färger innebär att mer komplexa experiment kan utföras. Till exempel kommer tillägg av en tredje färg att göra det möjligt att bedöma differentiell överlevnad mellan subpopulationer av celler, vilket vanligen utförs med flödescytometri.
En mer väsentlig ändring av protokollet är föregående cellvisualisering och användning av en spektrofotometer istället. Detta tillvägagångssätt har fördelen att utnyttja en nästan allestädes närvarande utrustning (en standard spektrofotometer med en mikroplattläsare) och är den snabbaste metoden för att förvärva data. Denna metod är dock långt mindre exakt. Fluorescensintensitet är representativ för cellfärgning, men stokastiska variationer i färgningsintensiteten, kombinerat med det relativt mindre provområdet, inför signifikant variabilitet. Medan ytterligare optimering (såsom införandet av en fixativ, ytterligare tvättsteg, eller ett större antal prover) kan ta itu med dessa problem, fluorescens mikroskopi är i allmänhet en överlägsen strategi.
Sammanfattningsvis är den modifierade Hoechst/PI protokollet en snabb, exakt, billig, hög genomströmning cytotoxicitet analys som är oberoende av mitokondriell funktion. Denna analys har betydande nytta för effektivt screening föreningar eller sammansatta kombinationer som riktar mitokondrierna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
NVK, en CPRIT forskare i cancerforskning, tack cancerförebyggande och Research Institute of Texas (CPRIT) för deras generösa stöd, CPRIT bevilja RR150044. Detta arbete stöddes också av Welch Foundation Research Grant C-1930, och av National Institutes of Health R35 GM129294 tilldelas NVK. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller utarbetande av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12.18 (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
