Summary
Protokollen beskriver en rask, høy gjennomstrømning, pålitelig, billig og objektiv analyse for effektivt å bestemme cellulær levedyktighet. Denne analysen er spesielt nyttig når cellenes mitokondrier har blitt skadet, noe som forstyrrer andre analyser. Analysen bruker automatisert telling av celler farget med to kjernefysiske fargestoffer - Hoechst 33342 og propidiumjodid.
Abstract
Bidraget fra mitokondrier til onkogen transformasjon er gjenstand for bred interesse og aktiv studie. Etter hvert som feltet av kreftmetabolismen blir mer kompleks, blir målet om å målrette mitokondrier ved hjelp av ulike forbindelser som forårsaker mitokondrieskade (såkalte mitokaner) ganske populært. Dessverre krever mange eksisterende cytotoksisitetsanalyser, som de som er basert på tetrazoliumsalter eller resazurin funksjonelle mitokondrieenzymer for ytelsen. Skaden påført av forbindelser som retter seg mot mitokondrier, kompromitterer ofte nøyaktigheten av disse analysene. Her beskriver vi en modifisert protokoll basert på differensialfarging med to fluorescerende fargestoffer, hvorav den ene er cellepermeant (Hoechst 33342) og den andre som ikke er (propidiumjodid). Forskjellen i farging gjør at levende og døde celler kan diskrimineres. Analysen er mottagelig for automatisert mikroskopi og bildeanalyse, noe som øker gjennomstrømningen og reduserer skjevhet. Dette gjør det også mulig for analysen å bli brukt i høy gjennomstrømning mote ved hjelp av 96-brønnplater, noe som gjør det til et levedyktig alternativ for narkotika oppdagelse innsats, spesielt når de aktuelle stoffene har noen grad av mitotoxicity. Viktigere, resultatene oppnådd av Hoechst / PI farging analyse viser økt konsistens, både med trypan blå utelukkelse resultater og mellom biologiske replikere når analysen sammenlignes med andre metoder.
Introduction
Det første trinnet for å identifisere effektive kreftbehandlinger er valg av en robust, objektiv cytotoksisitetsanalyse som kan brukes til å undersøke effekten av behandlingen. Et vanlig valg for eksperimenter med lav gjennomstrømning er utelukkelse av trypan blå fargestoff fra levende celler. Denne metoden favoriseres fordi den tillater en relativt objektiv metode for å kvantifisere celleoverlevelse. trypan blå passivt sprer seg i celler hvis membraner er kompromittert, men det er effektivt blokkert fra å komme inn i friske celler1. Kvotienten til de levende cellene og de totale cellene representerer prosentleveligheten, noe som indikerer effekten av behandlingen. Den viktigste ulempen med trypan blå analyse er at den er dårlig egnet for høy gjennomstrømningsmetoder. Den har et relativt lavt signal-til-støy-forhold, og langvarig farging kan resultere i artefakter på grunn av farging av levedyktige celler. Følgelig er trypan blå ekskludering vanligvis, men ikkealltid 2, henvist til manuell telling. Dette gjør det for sakte og introduserer den sterke muligheten for skjevhet på grunn av subjektiv dom fra forskeren (med mindre blending eller uavhengige tellinger brukes, noe som ytterligere reduserer laboratoriegjennomstrømningen). Generelt er gjennomstrømningen av denne analysen utilstrekkelig for moderne narkotikaoppdagelse.
Levedyktighetsanalyser, som vanligvis har en mye høyere gjennomstrømning, tillater forskere å omgå denne begrensningen, men kommer med betydelige advarsler (se tabell 1). Disse metodene faller vanligvis inn i to grupper. En gruppe består av kolorimetriske analyser som er basert på funksjonen til cellulære redoksenzymer. Fargeløse eller ikke-fluorescerende substrater omdannes til levende produkter som kan kvantifiseres ved hjelp av et spektrofotometer. Klassiske eksempler inkluderer tetrazoliumsalter (MTT, WST-1, XTT osv.) og resazurin. Denne kategorien inkluderer også selvlysende analyser som bruker luciferin for å evaluere ATP-nivå. Analyser av denne typen har den underliggende begrensningen at de måler cellulær metabolisme, som ikke er cellulær levedyktighet per se. Det er ganske vanlig for celler å bli quiescent under ugunstige forhold, men fortsatt beholde evnen til ådele 3,4,5. For eksempel er kreft stamceller ofte relativt metabolsk quiescent6,7,8,9, og er sannsynlig å være vanskelig å analysere ved hjelp av disse teknikkene. Effektiviteten av behandlinger som skader mitokondriefunksjonen, som de fleste mitokaner, er også sannsynlig å bli betydelig overvurdert.
En alternativ metodikk utnytter de kjemiske egenskapene til ulike stoffer som tillater dem å enten krysse eller ikke krysse biologiske membraner. Et eksempel er kjernefysiske flekker som SYTOX eller propidiumjodid (PI). Denne kategorien inkluderer også analyser som er like i konseptet, men forskjellige i funksjon, for eksempel laktatdehydrogenase (LDH) analyse, som måler utgivelsen av LDH i det ekstracellulære miljøet som en indikator på cellulær nekrose (figur 1, tabell 1). Disse analysene er mer i stand til å skille mellom metabolsk inaktive og døde celler.
| Analyse/fargestoff | Type(er) av celledød oppdaget | Nødvendig utstyr | Viktige funksjoner |
| MTT, CKK-8, Alamar Blå (resazurin) | Apoptose/nekrose | Spektrofotometer | Billig, rask; endepunktanalyse; avhengig av enzymers aktivitet (utelukkende mitokondrie i tilfelle MTT) og diskriminerer ikke mellom moduser forcelledød 1,10 |
| LDH-utgivelse | Nekrose | Spektrofotometer | Rask, uavhengig av mitokondrieenzymers aktivitet; dyrt for høy gjennomstrømningstester; nekrotiske celler med kompromisert plasmamembran11,12 |
| Trypan Blå (TB) | Apoptose/nekrose | Mikroskop | Celle-impermeant; diskriminerer ikke mellom moduser for celledød; arbeidskrevende og ikke egnet for screening med høy gjennomstrømming; vanskeligere å bruke med tiltalende celler; utsatt for subjektiv vurdering av brukeren, men regnes som standard celle levedyktighetsmålingsmetode13 |
| Acridine oransje (AO) | Apoptose/nekrose/ | Fluorescensmikroskop | En nukleinsyre fargestoff med unike spektrale egenskaper, kan skille mellom apoptose og nekrose / necroptosis14 |
| Nekroptose | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Fluorescensmikroskop eller strømningscytometer | Cellegjennomtrengelig; upassende alene for å overvåke celledød; nyttig for co-farging; kan brukes til å vurdere kromatinkondensasjon og kjernefragmentering tidlig apoptose; kan pares med propidiumjodid for å skille apoptose fra nekrose15,16 |
| Propidiumjodid (PI) | Sen apoptose/nekrose | Fluorescensmikroskop eller strømningscytometer | Celleimpermeant intercalator; oppdager både sen apoptose og nekrose moduser av celledød17. Giftig og gjennomtrengelig etter lange inkubasjonstider18 |
Tabell 1. Liste over cytotoksisitetsanalyser. Cytotoksisitetsanalyser, hvorav noen ble brukt i denne studien, oppført sammen med den korte beskrivelsen av deres viktigste funksjoner.
Nyere studier har vist at mitokondriemetabolismen er endret hos noenkreftformer 19,20,21,22,23,24,25. For eksempel har akutt myelogen leukemi (AML) vist seg å oppregulere deres mitokondriemasse, mtDNA-innhold og mitokondrierespirasjon for å møte deres energibehov19,26,27. På den annen side er noen faste svulster preget av mitokondriedysfunksjon, eller rettere sagt "metabolsk omprogrammering", for eksempel nedregulering av mitokondrieproteiner involvert i OXPHOS eller redusert mtDNA-innhold, som har vært forbundet med tumorinvasivitet, metastatisk potensial og motstand mot apoptosefremkallendelegemidler 28,29. Videre har det nylig vært en økt interesse for å bruke mekanistisk forskjellige forbindelser som påvirker mitokondriefunksjonen (vanligvis kalt mitokaner30),som potensielle behandlinger for bestemte kreftformer. Disse stoffene retter seg mot ATP-syntese, mitokondrie-DNA, OXPHOS og ROS-produksjon, samt pro-apoptotiske og antipoptotiske proteiner forbundet med mitokondrier30,31. Flere studier har vist at denne tilnærmingen har betydelig løfte19,32,33,34. Imidlertid kan disse metabolske avvikene i kreftcellebiologi eller mitokondrier-målretting behandlinger betydelig påvirke konvensjonelle levedyktighetsanalyser som er basert på mitokondriefunksjonalitet.
Her er en optimalisert protokoll for en differensial kjernefysisk farging analyse beskrevet. Protokollen tillater rask og nøyaktig bestemmelse av cytotoksisitet av mitokaner eller deres kombinasjoner med andre forbindelser. Hoechst 33342 er en celle-permeant kjernefysisk fargestoff som lett krysser cellemembraner å flekke DNA, slik at den totale celleantallet kan oppnås. Ved å sameksiere med PI, som bare kommer inn i kjernene av døde celler, kan andelen levende (kun Hoechst) og døde (farget med begge) celler bestemmes nøyaktig. Denne protokollen foredler den publiserte analysen35 ved å legge til et trinn for optimalisering av fargekonsentrasjonen (ved å kryssreferere resultater med ortogonal trypan blå metode) og sentrifugering av platen før avbildning. Siden mange cellelinjer er semi-tilhenger eller suspendert, øker sentrifugering andelen celler som er avbildet og forbedrer nøyaktigheten sterkt. Analysen har flere fordeler, inkludert at farging ikke krever fjerning av media eller vasking. Fargestoffblandingen er også billig, enkel å tilberede og kompatibel med flerkanals /robotpipetteringssystemer.
Etter at cellene er farget, blir de avbildet med et automatisert mikroskop. Dette har den ekstra fordelen av å opprette en permanent oversikt over bildene som kan analyseres på nytt senere, og effekten av bestemte forbindelser kan evalueres på nytt ved visuell inspeksjon av tatt bilder. Når bilder er innhentet, kan celler telles enten manuelt eller ved å bruke noen av flere programvarepakker, inkludert både gratis (f.eks. ImageJ, CellProfiler, etc) og kommersiell programvare (f.eks. Metamorph, Gen5, etc). Automatisert celletelling er generelt å foretrekke siden riktig utviklede automatiserte celletellingsrørledninger er mer nøyaktige og mindre partisk enn manuelle tellinger. De ser også mer effektivt bort fra celleavfall eller uoppløselige komplekser. Utviklingen av disse rørledningene er generelt enkel og forenkles av effektiviteten av flekkene som brukes. Utdataene er kvantitative siden det faktiske antallet døde celler beregnes automatisk med hensyn til totalt cellenummer, og ulike terskler kan brukes til å øke eller redusere strengen avdeteksjon 35. For enkelhets skyld er optimaliserte parametere for å telle celler ved hjelp av Gen5 v. 3.00 programvarekompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inkludert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cytotoksisitet Analyse: Oppsett
- Forbered løsninger av interesseforbindelser ved ønskede konsentrasjoner i riktig medium (serumfri eller 1, 2,5 eller 5% FBS RPMI-1640).
- For å måle cytotoksisitet av en enkelt forbindelse (f.eks. for å bestemme effektive doser), forberede forbindelser ved 2x endelig konsentrasjon.
- For å måle cytotoksisitet av sammensatte kombinasjoner, forberede forbindelser ved 4x endelig konsentrasjon.
- Forbered løsemiddelkontroller ved å blande samme mengde løsningsmiddel med riktig medium. For eksempel, hvis testing forbindelser oppløst i DMSO og metanol, gjøre løsemiddel-bare kontroll for hvert løsemiddel.
- Samle celler fra kulturrett eller kolbe i et konisk rør på 15 ml.
- Overfør 10 μL cellefjæring til et mikrocentrifugerør og beis med 10 μL 0,4% trypan blå. Bruk et hemocytometer for å telle levedyktige og ikke-levedyktige celler for hver cellekilde.
- Pelletceller ved 200 g i 5 min. Aspirerer eller dekanterer overnaturlig.
- Resuspend cellepellet i analyse-passende medier (serumfri eller 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) med en celletetthet på 3 * 105 celler / ml.
MERK 1: Celletetthet på 3 * 105 celler / ml gir en såetetthet på 15.000 celler / brønn. Seeding tetthet er en viktig parameter og ideelt sett bør forhåndsdefineres før eksperimentet. Seeding tetthet bør ta hensyn til 1) cellestørrelse - vanligvis større celler seedes på en lavere tetthet; 2) behandlingsvarighet - celler er vanligvis seeded på en lavere tetthet for eksperimenter som vil vare lenger; og 3) celledelingshastighet - celler med høyere delingshastighet seedes med lavere tetthet. Spesifikke eksempler på optimaliserte såetettheter: K562-celler, større, 24 t varighet – 10 000 celler/brønn; MOLM-13 celler, moderat størrelse, 24 h behandling – 15.000/brønn; MOLM-13 celler, 48 h behandling – 8000/brønn; små friske, perifere blod mononukleære celler (PBMCs), 24 h behandling – 50.000/well; primære AML-celler, 24 h behandling – 15.000-20.000/brønn.
MERK 2: Tilstedeværelsen av FBS i media kan påvirke aktiviteten til forbindelsene. Redusere konsentrasjonen av FBS kan gjøre analyseresultater enklere å tolke, men det reduserer også fysiologisk nøyaktighet. - Frø 50 μL cellefjæring fra trinn 1,5 til hver brønn av en 96-brønns plate ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Legg til forbindelser som følger:
- For enkeltsammensatte analyser, tilsett 50 μL μL 2x sammensatt løsning i hver brønn. For løsemiddelkontrollbrønner, tilsett 50 μL testmedier som inneholder oppløsningsvæsken ved 2xkonsentrasjonen.
- For kombinasjonsanalyser, tilsett 25 μL av hver av forbindelsene (4x løsninger) i hver brønn. For enkeltforbindelser- kontroll brønner, tilsett 25 μL av 4x sammensatt løsning og 25 μL av testmedium. For løsningsmiddelkontrollbrønner, tilsett 50 μL av testmedium eller testmedium som inneholder oppløsningsvæsken.
MERK 1: Den endelige konsentrasjonen av DMSO bør ikke overstige 0,5 %.
MERK 2: Det anbefales å legge til mediet som inneholder forbindelsene med pipetten som berører veggen på hver brønn på grunn av lavt volum.
- Bank forsiktig på platen for å sikre blanding av innholdet i brønnene.
- Inkuber plater ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2-atmosfære i en passende tid, f.eks.
2. Cytotoksisitetsanalyse: farging med Hoechst 33342 og propidiumjodidid
- Forbered 10x farging løsning. Denne løsningen må tilberedes frisk før hvert eksperiment, den kan ikke lagres. Endelige fargekonsentrasjoner bør bestemmes før eksperimentet.
- For leukemicellelinjer og primære leukemiceller inneholder 1 ml 10x fargingsbuffer 10 μL på 20 mM Hoechst 33342 og 50 μL på 1 mg/ml propidiumjodid i steril PBS (endelige konsentrasjoner: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/ml).
- For sunne PBMCer inneholder 1 ml 10x fargingsbuffer 10 μL på 20 mM Hoechst 33342 og 10 μL 1 mg/ml propidiumjodid i steril PBS (endelige konsentrasjoner: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/ml).
MERK: Den endelige konsentrasjonen av propidiumjodid må bestemmes før forsøkene. Celler bør testes ved hjelp av en rekke PI-konsentrasjoner (1, 2,5, 5 μg/ml), og deretter bør Hoechst/PI-beregnet levedyktighet sammenlignes med levedyktighet målt via trypanblå. PI-konsentrasjonene nevnt ovenfor ble valgt basert på målcelle levedyktighet i media-kontroll brønner (over ~ 90% for leukemi cellelinjer, over ~ 70% for sunne PBMCer).
FORSIKTIG: Hoechst 33342 og propidiumjodid er potensielle kreftfremkallende stoffer. Bruk egnet personlig verneutstyr når du håndterer dem.
- Etter inkubasjon, bruk en flerkanals pipette til å legge til 10 μL 10x fargingsbuffer til hver brønn.
MERK: For å unngå krysskontaminering må du kontrollere at pipettespissene ikke berører mediet. - Bank forsiktig på platen for å blande og fjerne bobler. Beis ved 37 °C i 15 min.
- Sentrifuger platen ved 200 g i 4 min for å bringe alle cellene til bunnen av platen. Tørk forsiktig av bunnen av platen med en fuktig kimwipe for å fjerne fibre og / eller rusk som vil forstyrre avbildning.
MERK 1: Sentrifugering av platen sikrer de høyeste sjansene for at alle cellene fanges i bildet. Ofte vil døde celler løsne og flyte, noe som gir villedende verdier av cytotoksisitet. Sentrifugering reduserer denne effekten.
MERK 2: Platen skal avbildes så raskt som mulig etter sentrifugering, ideelt sett innen 15 min. Sentrifugering kan redusere selektiviteten av PI farging og kan tillate celler å sakte påløpe propidiumjodid. Forbedringen i nøyaktigheten oppnådd ved å visualisere de døde cellene oppveier den lille økningen i PI farging. Det anbefales å fullføre bildebehandling innen 1 time etter sentrifugering.
3. Cytotoksisitet Analyse: datainnsamling
- Sett programvaren for den automatiserte mikroskopet /platebilderen for å oppdage fluorescens for både Hoechst 33342 (eksitasjon maksimum 350 nm, utslipp maksimum 461 nm) og PI (eksitasjon maksimalt 493 nm, utslipp maksimum 636 nm). Skaff deg bilder for hver brønn i begge kanalene.
- Ved hjelp av programvaren (for eksempel CellProfiler, et gratis bildeanalysestudio basert på MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ eller proprietær programvare som Gen5) teller cellene i hver brønn i hver kanal.
MERK: Siden hver celle skal være farget med Hoechst 33342, og døde celler skal være farget med PI, representerer forholdet mellom døde til alle brøkdelen av celler som er døde. Hvis for eksempel det automatiserte antallet i ubehandlet prøve viser 467 celler farget med PI (døde celler) og 2335 celler farget med Hoechst 33342 (totalt antall celler), er brøken død 0,2 eller 20%. Denne verdien sammenlignes deretter med en identisk håndtert prøve der behandlingen ble brukt. - Detaljert beskrivelse av Hoechst / PI datainnsamling ved hjelp av Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader og Gen5 v. 3.00 programvare:
- Sett Cytation5 multimode plateleser / imager til bildeceller i flat bunn, 96-brønn, generiske svarte plastplater.
- Angi en bildeprotokoll for å bruke standard DAPI- og Texas Red-filtersett. Ta bilder på brønnsenteret ved hjelp av et 4x forstørrelsesmål. Bruk ingen forskyvning (X/Y eller Z). Bruk følgende bildeinnstillinger: DAPI – LED - 10, integrasjonstid - 99, gevinst - 0; Texas Red - LED - 8, integrasjon tid - 950, gevinst - 18. Utfør autofokus ved hjelp av DAPI-signalet; det bør ikke være noen forskyvning i fokus mellom kanaler.
- Utfør bildeanalyse ved hjelp av Gen5-programvare v 3.00. I programvareinnstillingene definerer du celler som former mellom 5 og 25 μm i størrelsen. Utelat primære kantobjekter og del berøringsobjekter ved å slå på spesialalternativet "Del berøringsobjekter". Deretter behandler du bildet for å fjerne bakgrunnen (undertraksjon i mørk bakgrunn), bruke en kjernefysisk maske (terskelverdi DAPI >= 6000 AU) og telle objekter. Utfør en underpopulasjonsanalyse basert på PI-farging (terskelverdi Texas Red >= 5000 AU), og tell objekter. Celle levedyktighet % er definert som (1 -
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nevnte protokollen er utviklet ved hjelp av OCI-AML2 celler, som ble tatt som en representativ akutt myelogen leukemi cellelinje. AML er preget av unormal spredning av udifferensierte og ikke-funksjonelle hematopoetiske celler i benmargen26. Til tross for den siste utviklingen i AML målrettet terapi, standarden på omsorg har vært uendret i flere tiår, og består av induksjonsbehandling (vanligvis består av tre dager med antracyklin, f.eks daunorubicin, idarubicin eller anthracenedione mitoxanthrone, og 7 dager med cytarabin) etterfulgt av konsolidering (vanligvis består av runder med cytarabinbehandling etterfulgt av perioder med utvinning)36.
Etter protokollen som er skissert i figur 1A,ble OCI-AML2-celler seeded i 96-brønnplater og behandlet med mitokondriefrikoperkarbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) eller den glykolytiske hemmeren 2-deoksy-D-glukose (2-DG) ved en rekke konsentrasjoner. Cellene ble behandlet i 24 timer ved 37 °C i serumfrie RPMI-1640-medier, og deretter ble levedyktigheten vurdert ved hjelp av trypan blå (TB) eksklusjon eller en av fire levedyktighetsanalyser (Hoechst/PI differensial kjernefysisk farging, LDH-utgivelsesanalyse, MTT eller alamarBlue). Representative bilder av celler farget med Hoechst/PI er vist i figur 2A. Flere viktige observasjoner kan gjøres umiddelbart. For det første er det totale antallet celler (Hoechst farging) rimelig høy og er markert større enn antall døde celler (PI farging). Dette tyder på at medieforholdene ikke utløser høye forekomster av celledød. For det andre, siden bare celler som merkes med både Hoechst og PI regnes som døde (lilla celler i det sammenslåtte bildet), er sannsynligheten for å telle rusk svært lav. Dette bildet viser et godt eksempel på riktig beisede celler.
Figur 1. Eksperimentell tidslinje og sammenligning av eksisterende cytotoksisitetsanalyser. (A) Flytskjema som oppsummerer tidslinjen for den eksperimentelle prosedyren, for eksempel Hoechst / PI farging. (B)Sammenligning av cytotoksisitetsanalyser, hvorav noen ble brukt i denne studien. Fargestoff eksklusjonsanalyser involverer ugjennomtrengelige kjernefysiske fargestoffer som flekker døde celler med kompromittert plasmamembran: TB – trypan blå, PI – propidiumjodid, EtBr – ethidiumbromid og SYTOX. Andre gruppe analyser avhenger av cellulær metabolisme, for eksempel tetrazoliumsalter MTT, XTT og CKK-8 (WST-8), resazurin-basert reagens alamarBlue, etc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Sammenligning av et panel av cytotoksisitetsanalyser med trypan blå eksklusjon. (A) Representative bilder av totalt (Hoechst 33342) og døde (propidiumjodid, PI) OCI-AML2 celler via Hoechst / PI farging. (B) Vurdering av levedyktigheten til OCI-AML2-celler ved hjelp av ulike metoder etter behandling med en gradient av CCCP (topp) eller 2-DG (bunn)konsentrasjoner. OCI-AML2 ble behandlet med CCCP eller 2-DG i serumfri RPMI-1640 i 24 timer før bestemmelse av celle levedyktighet. Vist er gjennomsnittlig, feilfelt representerer SEM. C. Forskjell i celle levedyktighet mellom cytotoksisitetsanalyser i (B) vs. trypan blå flekker (se Supplerende tabeller S1-2 for de eksakte tallene og median forskjellen). Stjerner indikerer betydelig forskjell vs. trypan blå flekker. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – ikke-signifikant. Gruppesammenligning ble gjort via t-testmed korreksjon for testing av flere hypoteser. Tre uavhengige biologiske repliker ble utført. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som vi nylig rapporterte19, leukemier er svært følsomme for mitotoxiske behandlinger, noe som indikerer at cellene allerede har underliggende mitokondrieskader. På denne bakgrunn spådde vi at MTT- og alamarBlue-analysene, som er basert på mitokondrieenzymaktivitet, ville unøyaktig måle cellulær levedyktighet. Som forventet viste disse analysene (spesielt alamarBlue) betydelig lavere levedyktighet sammenlignet med trypan blå eksklusjon, se figur 2B, C, supplerende tabeller S1-S2). Dette er i samsvar med det faktum at doser av disse forbindelsene som kreves for å indusere apoptose eller nekrose er høyere enn de som trengs for å kompromittere mitokondriefunksjon.
Blant analysene som ble testet, hadde dobbel farging med Hoechst 33342 og PI den beste kombinasjonen av robusthet, følsomhet og konsistens med TB-farging, med den minste medianavviket fra TB-ekskluderingsmetode etter CCCP eller 2-DG-behandling (Supplerende tabeller S1-2). Interessant, ved høyere doser av CCCP (50 og 100 μM) levedyktighet estimert med Hoechst / PI eller TB ble økt sammenlignet med lavere doser(figur 2B, topp). Dette skyldes sannsynligvis at CCCP har høyere doser på grunn av hydrofobiiteten, noe som reduserer den effektive konsentrasjonen og innvirkningen på cellene. Øke dosen av CCCP ytterligere redusert Hoechst / PI-estimert gjennomsnittlig levedyktighet av OCI-AML2 celler, men: 74% ved 150 μM, 62% ved 200 μM, 6% ved 300 μM (data ikke vist).
Hoechst/PI-analysen var også effektiv for å bestemme cellulær levedyktighet etter behandling med andre mitokondrier-målretting molekyler. Disse inkluderte rotenon, en gift som kompromitterer Kompleks I av mitokondrieelektrontransportkjeden37,og 3-bromopyruvate, en glykolytisk hemmer og alkylerende middel som svekker mitokondriegjenspirasjon og mitokondriemetabolisme38 (figur 3A-D, supplerende tabeller S3-4).
Figur 3. Validering av Hoechst/PI cytotoksisitet analyse i leukemi celler. (A,B)OCI-AML2 (AML) celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av rotenon (A) eller 3-bromopyruvat, 3-BP(B) i serumfrie RPMI-1640 media i 24 timer, ble levedyktighet bestemt. Vist er gjennomsnittlig med SEM. (C,D) Sammenligning av levedyktighetsforskjell mellom Hoechst/PI-analyse vs. trypanblå flekker (for cellene i A-B, se Supplerende tabeller S3-4 for kvantitet). Stjerner indikerer statistisk signifikans vs. trypan blå flekker. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – ikke-signifikant. Gruppesammenligning ble gjort via t-testmed korreksjon for testing av flere hypoteser. E. MOLM-13 (AML), primære AML-celler isolert fra en pasient, MOLT-4 (ALL) og K562 (KML) celler ble behandlet med de angitte konsentrasjonene av rotenon i serumfri RPMI-1640 media i 24 timer, før levedyktighetsbestemmelse ved hjelp av Hoechst / PI farging. Vist er gjennomsnittlig med SEM. Tre uavhengige biologiske repliker ble utført. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Hoechst/PI cytotoksisitetsanalysen ble ytterligere validert ved hjelp av et panel av leukemicellelinjer som representerer flere typer leukemi, samt primære celler. De inkluderte MOLM-13 (en AML cellelinje), primære AML-celler avledet fra en representativ pasientprøve, MOLT-4 (en akutt lymfoblastisk leukemicellelinje, ALL) og K562 (en kronisk myelogen leukemicellelinje, KML) (figur 3E, supplerende figur S1). Resultatene av Hoechst/PI-analysen viste at disse cellene hadde dype forskjeller i rotenonfølsomhet, alt fra svært følsomme (MOLT-4) til resistente (K562) celler.
For å demonstrere analysens robusthet ble OCI-AML2-celler behandlet med en konsentrasjonsgradient på 3-bromopyruvat, som beskrevet i protokollen ovenfor. Celletellinger ble samlet inn for 6 brønner ved hver konsentrasjon og er vist (figur 4A,B). Disse tellingene ble brukt til å beregne levedyktighet, og viste at så få som 4 brønner var tilstrekkelige til å nøyaktig fange opp analyseutfall (figur 4C). Den resulterende doseresponskurven vises (figur 4D).
Figur 4. Reproduserbarhet av Hoechst / PI farging. Levedyktighet av OCI-AML2 celler etter 24 timer behandling med ulike konsentrasjoner av 3-bromopyruvat (3-BP). (A)Totalt antall celler telles via Hoechst 33342 farging, (B) Antall døde celler telles via propidiumjodidfarging. (C) Levedyktighet (%) beregnet ved hjelp av (A-B). (D) Representativ doserespons graf. Vist er gjennomsnittlig med SEM. Tre uavhengige biologiske repliker ble utført. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Selv om analysen er relativt robust, må det fortsatt tas hensyn. Feil ytelse av analysen kan kompromittere nøyaktigheten. Flere kompromitterte resultater vises for feilsøkingsformål (figur 5). Det første settet med bilder viser konsekvensene av overfarging med PI, som kan oppstå fra følgende kilder: bruk av fargestoffet ved for høy konsentrasjon, farging for lenge eller bruk for høy LED-intensitet / integrasjonstid i den røde kanalen (figur 5A). Disse feilene vil generere kunstig oppblåst antall døde celler. Det andre problemet oppstår ved å forsømme sentrifugeringstrinnet. Ofte begynner døde celler å miste sitt vedlegg fra overflaten av parabolen. Følgelig vil de være underrepresentert under bildeoppkjøp, som vanligvis skjer nær bunnen av brønnen (figur 5B). Til slutt utvider overeksponering i Hoechst-kanalen kunstig størrelsen på cellene, noe som reduserer de totale tellingene per brønn betydelig og begrenser analysekraften (figur 5C).
Figur 5. Sammenligning av optimale og sub-optimale analyseparametere. Sammenligning av resultater anskaffet via optimaliserte parametere (venstre) eller sub-optimale parametere (høyre). (A)Friske PBMCer ble farget med propidiumjodid ved 1 μg/ml (venstre) eller 5 μg/ml (høyre) i 15 min før bildebehandling. (B) Bilder av OCI-AML2-celler tatt med (venstre) eller uten (høyre) plate sentrifugering. (C) Bilder av OCI-AML2-celler ervervet med optimal (venstre) eller overdreven (høyre) integrasjonstid for Hoechst-kanalen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Forskjell med trypan blå metode, % | ||||
| CCCP, μM | Hoechst/PI | LDH-analyse | Mtt | Alamar Blå |
| 3.1 | -1.19 | 33.00 | -31.05 | -59.04 |
| 6.3 | 6.99 | 41.90 | -11.03 | -59.34 |
| 12.5 | 0.71 | 41.60 | 4.31 | -52.52 |
| 25 | 30.73 | 66.33 | -3.68 | -51.85 |
| 50 | 47.38 | 50.71 | -17.71 | -60.27 |
| 100 | 13.81 | 17.12 | -45.31 | -67.25 |
| Median | 10.40 | 41.75 | -14.37 | -59.19 |
Tilleggstabell S1. Levedyktighetsforskjeller for et analysepanel i OCI-AML2-celler etter CCCP-behandling. Vurdering av levedyktighet ble utført etter 24 timer behandling med ulike konsentrasjoner av CCCP. Median levedyktighetsforskjell mellom testede analyser (Hoechst/PI, LDH, MTT eller alamarBlue) og trypanblå farging med automatisert telling ble beregnet basert på levedyktighetsforskjeller ved hver legemiddelkonsentrasjon.
| Forskjell med trypan blå metode, % | ||||
| 2-DG, mM | Hoechst/PI | LDH-analyse | Mtt | Alamar Blå |
| 3.1 | 16.16 | 20.77 | 5.82 | -20.27 |
| 6.3 | 22.93 | 31.96 | -11.13 | -31.11 |
| 12.5 | 30.85 | 45.07 | -34.27 | -36.29 |
| 25 | 13.81 | 42.39 | -55.79 | -52.29 |
| 50 | 16.96 | 81.12 | -29.38 | -47.68 |
| 100 | 7.79 | 149.16 | -19.37 | -28.67 |
| Median | 16.56 | 43.73 | -24.38 | -33.70 |
Tilleggstabell S2. Levedyktighetsforskjeller for et analysepanel i OCI-AML2-celler etter 2-DG-behandling. Vurdering av levedyktighet ble utført etter 24 timer behandling med ulike konsentrasjoner på 2-DG. Median levedyktighetsforskjell mellom testede analyser (Hoechst/PI, LDH, MTT eller alamarBlue) og trypanblå farging med automatisert telling ble beregnet basert på levedyktighetsforskjeller ved hver legemiddelkonsentrasjon.
| Rotenon, μM | Levedyktighetsforskjell, % (Hoechst/PI-trypan blå) |
| 10 | 4.45 |
| 25 | 7.61 |
| 50 | 17.70 |
| 100 | 7.74 |
| 150 | 56.38 |
| 200 | 16.57 |
| Median | 12.15 |
Tilleggstabell S3. Levedyktighetsforskjell mellom Hoechst/PI og TB-ekskluderingsmetode i OCI-AML2-celler etter rotenonbehandling. Vurdering av levedyktighet ble utført etter 24 timer behandling med ulike konsentrasjoner av rotenon. Median levedyktighetsforskjell mellom Hoechst/PI og trypanblå farging med automatisert telling ble beregnet basert på levedyktighetsforskjeller ved hver legemiddelkonsentrasjon.
| 3-BP, μM | Levedyktighetsforskjell, % (Hoechst/PI-trypan blå) |
| 5 | 5.73 |
| 10 | 9.00 |
| 25 | 7.72 |
| 50 | -1.90 |
| 100 | -28.23 |
| 200 | -20.77 |
| Median | 1.91 |
Tilleggstabell S4. Levedyktighetsforskjell mellom Hoechst/PI og TB-ekskluderingsmetode i OCI-AML2-celler etter behandling med 3 bromopyruvat (3-BP). Vurdering av levedyktighet ble utført etter 24 timer behandling med ulike konsentrasjoner på 3-BP. Median levedyktighetsforskjell mellom Hoechst/PI og trypanblå farging med automatisert telling ble beregnet basert på levedyktighetsforskjeller ved hver legemiddelkonsentrasjon.
Tilleggstall S1. Representative bilder av celler farget med Hoechst/PI, med eller uten rotenonbehandling ved indikerte konsentrasjoner i serumfrie RPMI-1640-medier i 24 timer: A-B. AML: MOLM-13 cellelinje (A) og primære AML-celler (B) avledet fra en representativ pasientprøve. C. ALLE: MOLT-4 cellelinje. D. KML: K562 cellelinje. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om protokollen for Hoechst/PI cytotoksisitetsanalyse er robust og krever relativt lite praktisk tid, er det flere eksperimentelle detaljer som er svært viktige for å sikre nøyaktige resultater. For det første er det viktig å sørge for at konsentrasjonen av DMSO forblir under 0,5% (v / v). Det er generelt avtalt at eksponering for selv lave doser av DMSO kan vesentlig endre morfologi og vedlegg av celler og betydelig forsinke celle syklusprogresjon 39,40.
For det andre bør fargingen utføres så snart som mulig etter behandling. Siden det ikke er noen vasketrinn, forblir forbindelsen i brønnene og kan fortsette å forårsake skade på cellene. Sammenlignet med den tidligereprotokollen 35ble cellene farget i bare 15 minutter. Dette begrenser muligheten for at levedyktige celler utilsiktet kan farges med propidiumjodid. Av denne grunn foreslår vi svimlende behandlinger og farging hvis mer enn to plater vil bli behandlet. Dette gir bildetid mellom plater og forbedrer reproduserbarheten.
For det tredje er passende fargekonsentrasjon avhengig av celletype. Det er viktig å empirisk bestemme den optimaliserte propidiumjodidkonsentrasjonen, som begynner med ubehandlede celler, ved hjelp av trypan blå flekker som en ortogonal referanse.
Til slutt er sentrifugeringstrinnet umiddelbart før visualisering også kritisk. Basert på denne protokollen registreres det et område på 500-4000 celler (avhengig av såetetthet). Dette er en bemerkelsesverdig forbedring over 100-400 celler per godt brukt tidligere35. Tatt i bruk variasjonen i populasjonen av kreftceller (spesielt primærceller), er det viktig å ha flere celler til analyse, og kan tillate mer robust dataanalyse.
På grunn av den relative enkelheten til metoden, kan et bredt utvalg av modifikasjoner enkelt utføres. For eksempel er mange andre celle-impermeant fargestoffer tilgjengelige fra en rekke leverandører og kan erstattes for propidiumjodid. Selv om denne substitusjonen har relativt liten verdi alene, betyr den økte fargepaletten at mer komplekse eksperimenter kan utføres. For eksempel vil tillegg av en tredje farge tillate differensial overlevelse å bli vurdert mellom underpopulasjoner av celler, som vanligvis utføres med strømningscytometri.
En mer betydelig endring av protokollen er foregående cellevisualisering og bruk av et spektrofotometer i stedet. Denne tilnærmingen har fordelen av å bruke et nesten allestedsnærværende utstyr (et standard spektrofotometer med en mikroplateleser) og er den raskeste metoden for å skaffe data. Denne metoden er imidlertid langt mindre nøyaktig. Fluorescensintensiteten er representativ for cellefarging, men stokastiske variasjoner i fargingsintensiteten, kombinert med det relativt mindre prøveområdet, introduserer betydelig variasjon. Mens ytterligere optimalisering (for eksempel inkludering av et fikserende middel, ytterligere vasketrinn eller et større antall prøver) kan løse disse problemene, fluorescensmikroskopi er generelt en overlegen tilnærming.
Til slutt er den modifiserte Hoechst / PI-protokollen en rask, nøyaktig, billig, høy gjennomstrømningscyttoksisitetsanalyse som er uavhengig av mitokondriefunksjon. Denne analysen har betydelig nytte for effektivt screening forbindelser eller sammensatte kombinasjoner som retter seg mot mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
NVK, en CPRIT forsker i kreftforskning, takker Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) for deres sjenerøse støtte, CPRIT-stipend RR150044. Dette arbeidet ble også støttet av Welch Foundation Research Grant C-1930, og av National Institutes of Health R35 GM129294 tildelt NVK. Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12.18 (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
