Un ensayo automatizado de tinción nuclear diferencial para la determinación precisa de la citotoxicidad mitoca
Summary
El protocolo describe un ensayo rápido, de alto rendimiento, confiable, económico e imparcial para determinar eficientemente la viabilidad celular. Este ensayo es particularmente útil cuando las mitocondrias de las células han sido dañadas, lo que interfiere con otros ensayos. El ensayo utiliza el conteo automatizado de células manchadas con dos tintes nucleares: Hoechst 33342 y yoduro de propidium.
Abstract
La contribución de las mitocondrias a la transformación oncogénica es un tema de amplio interés y estudio activo. A medida que el campo del metabolismo del cáncer se vuelve más complejo, el objetivo de apuntar a las mitocondrias utilizando varios compuestos que infligen daño mitocondrial (los llamados mitocanes) se está volviendo bastante popular. Desafortunadamente, muchos ensayos de citotoxicidad existentes, como los basados en sales de tetrazolium o resazurin requieren enzimas mitocondriales funcionales para su rendimiento. El daño infligido por los compuestos que apuntan a las mitocondrias a menudo compromete la precisión de estos ensayos. Aquí, describimos un protocolo modificado basado en la tinción diferencial con dos tintes fluorescentes, uno de los cuales es permeante de células (Hoechst 33342) y el otro de los cuales no es (yoduro de propidium). La diferencia en la tinción permite discriminar las células vivas y muertas. El ensayo es susceptible de microscopía automatizada y análisis de imágenes, lo que aumenta el rendimiento y reduce el sesgo. Esto también permite que el ensayo se utilice de manera de alto rendimiento utilizando placas de 96 pozos, por lo que es una opción viable para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos, particularmente cuando los fármacos en cuestión tienen algún nivel de mitotoxicidad. Es importante destacar que los resultados obtenidos por el ensayo de tinción Hoechst/PI muestran una mayor consistencia, tanto con los resultados de exclusión azul tripano como entre réplicas biológicas cuando el ensayo se compara con otros métodos.
Introduction
El primer paso para identificar tratamientos eficaces contra el cáncer es la selección de un ensayo de citotoxicidad robusto e imparcial que se puede utilizar para examinar el efecto del tratamiento. Una opción común para experimentos de bajo rendimiento es la exclusión del tinte azul trypan de las células vivas. Este método se ve favorecido porque permite un método relativamente imparcial para cuantificar la supervivencia celular. el azul de tripano se difunde pasivamente en las células cuyas membranas están comprometidas, pero está efectivamente bloqueado para entrar en las células sanas1. El cociente de las células vivas y las células totales representa el porcentaje de viabilidad, lo que indica la eficacia del tratamiento. La desventaja más significativa del ensayo azul tripano es que es poco adecuado para metodologías de alto rendimiento. Tiene una relación señal-ruido relativamente baja y la tinción prolongada puede resultar en artefactos debido a la tinción de células viables. Por lo tanto, la exclusión azul de trypan suele ser, pero no siempre2,relegada al recuento manual. Esto hace que sea demasiado lento e introduce la fuerte posibilidad de sesgo debido al juicio subjetivo del investigador (a menos que se utilicen recuentos cegados o independientes, lo que reduce aún más el rendimiento del laboratorio). En general, el rendimiento de este ensayo es insuficiente para el descubrimiento de fármacos modernos.
Los ensayos de viabilidad, que generalmente tienen un rendimiento mucho mayor, permiten a los investigadores eludir esta limitación, pero vienen con advertencias significativas (véase el Cuadro 1). Estos métodos generalmente se dividen en dos grupos. Un grupo se compone de ensayos colorimétricos que se basan en la función de las enzimas redox celulares. Los sustratos incoloros o no fluorescentes se convierten en productos vibrantes que se pueden cuantificar mediante un espectrofotómetro. Ejemplos clásicos incluyen sales de tetrazolium (MTT, WST-1, XTT, etc.) y resazurin. Esta categoría también incluye ensayos luminiscentes que utilizan luciferina para evaluar el nivel de ATP. Los ensayos de este tipo tienen la limitación subyacente de que están midiendo el metabolismo celular, que no es la viabilidad celular per se. Es bastante común que las células se vuelvan en reposo en condiciones adversas, pero aún así conservan la capacidad de dividir3,4,5. Por ejemplo, las células madre cancerosas son a menudo relativamente metabólicamente en reposo6,7,8,9, y es probable que sean difíciles de ensayar utilizando estas técnicas. También es probable que la eficacia de los tratamientos que dañan la función mitocondrial, como la mayoría de los mitocanos, se sobreestime significativamente.
Una metodología alternativa aprovecha las propiedades químicas de varias sustancias que les permiten cruzar o no cruzar membranas biológicas. Un ejemplo son las manchas nucleares como SYTOX o yoduro propidium (PI). Esta categoría también incluye ensayos que son similares en concepto pero diferentes en función, como el ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH), que mide la liberación de LDH en el ambiente extracelular como indicador de necrosis celular (Figura 1, Tabla 1). Estos ensayos son más capaces de distinguir entre células metabólicamente inactivas y células muertas.
| Ensayo/teñido | Tipo(s) de muerte celular detectada | Equipo necesario | Características clave |
| MTT, CKK-8, Azul Alamar (resazurin) | Apoptosis/Necrosis | Espectrofotómetro | Barato, rápido; ensayo de punto final; actividad de las enzimas (exclusivamente mitocondrial en caso de MTT) y no discrimina entre los modos de muerte celular1,10 |
| Versión de LDH | Necrosis | Espectrofotómetro | Rápido, independiente de la actividad de las enzimas mitocondriales; costoso para pruebas de alto rendimiento; detecta células necróticas con membrana plasmáticacompromizada 11,12 |
| Azul Trypan (TB) | Apoptosis/Necrosis | Microscopio | Celda-impermeante; no discrimina entre los modos de muerte celular; laborioso y no adecuado para el cribado de alto rendimiento; más difícil de usar con células adherentes; propensa al juicio subjetivo del usuario, pero se considera el método estándar de medición de la viabilidad celular13 |
| Naranja acridina (AO) | Apoptosis/Necrosis/ | Microscopio de fluorescencia | Un tinte de ácido nucleico con propiedades espectrales únicas, puede distinguir entre apoptosis y necrosis/necroptosis14 |
| Necroptosis | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptosis | Microscopio de fluorescencia o citómetro de flujo | Permeable a la célula; inapropiado por sí solo para monitorear la muerte celular; útil para la co-tinción; se puede utilizar para evaluar la condensación de cromatina y la fragmentación de los núcleos en la apoptosis temprana; puede ser emparejado con yoduro propidium para distinguir la apoptosis de la necrosis15,16 |
| Yoduro de propidium (PI) | Apoptosis/Necrosis tardía | Microscopio de fluorescencia o citómetro de flujo | Intercalador de células impermeant; detecta tanto la apoptosis tardía como los modos de necrosis de la muerte celular17. Tóxico y permeable después de largos tiempos de incubación18 |
Tabla 1. Lista de ensayos de citotoxicidad. Los ensayos de citotoxicidad, algunos de los cuales se utilizaron en este estudio, enumeraron junto con la breve descripción de sus características clave.
Estudios recientes han demostrado que el metabolismo mitocondrial se altera en algunos tipos de cáncer19,20,21,22,23,24,25. Por ejemplo, se ha demostrado que las leucemias mieloides agudas (LMA) regulan su masa mitocondrial, su contenido en ADNnm y la respiración mitocondrial para satisfacer sus demandas energéticas19,26,27. Por otro lado, algunos tumores sólidos se caracterizan por una disfunción mitocondrial, o más bien “reprogramación metabólica”, como la regulación descendente de las proteínas mitocondriales implicadas en OXPHOS o la disminución del contenido de ADNm, que se ha asociado con la invasividad tumoral, el potencial metastásico y la resistencia a los medicamentos inductores de apoptosis28,29. Además, recientemente, ha habido un mayor interés en el uso de compuestos mecanicísticamente diversos que afectan la función mitocondrial (generalmente llamados mitocanes30), como terapias potenciales para cánceres particulares. Estos fármacos se dirigen a la síntesis de ATP, ADN mitocondrial, OXPHOS, y la producción de ROS, así como proteínas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas asociadas con las mitocondrias30,31. Varios estudios han demostrado que este enfoque tiene una promesa significativa19,32,33,34. Sin embargo, estas desviaciones metabólicas en la biología de las células cancerosas o los tratamientos dirigidos a las mitocondrias pueden afectar significativamente a los ensayos de viabilidad convencionales que se basan en la funcionalidad mitocondrial.
Aquí se describe un protocolo optimizado para un ensayo diferencial de tinción nuclear. El protocolo permite una determinación rápida y precisa de la citotoxicidad de los mitocanes o sus combinaciones con otros compuestos. Hoechst 33342 es un tinte nuclear permeante de células que cruza fácilmente las membranas celulares para manchar el ADN, lo que permite obtener el recuento total de células. Al co-tinción con PI, que sólo entra en los núcleos de las células muertas, la proporción de células vivas (solo Hoechst) y muertas (manchadas con ambas) se puede determinar con precisión. Este protocolo refina el ensayo publicado35 añadiendo un paso para la optimización de la concentración de tinte (mediante la referencia cruzada de resultados con el método ortogonal trypan blue) y la centrifugación de la placa antes de la toma de imágenes. Dado que muchas líneas celulares son semiadheridas o suspendidas, la centrifugación aumenta la proporción de células que se utilizan y mejora fuertemente la precisión. El ensayo tiene varias ventajas, incluyendo que la tinción no requiere la eliminación de medios o lavado. La mezcla de tinte también es económica, fácil de preparar y compatible con sistemas de pipeteo multicanal/robótico.
Después de que las células han sido manchadas, se toman imágenes con un microscopio automatizado. Esto tiene la ventaja añadida de crear un registro permanente de las imágenes que se pueden volver a analizar más adelante y los efectos de determinados compuestos se pueden reevaluar mediante la inspección visual de las imágenes capturadas. Una vez obtenidas las imágenes, las celdas se pueden contar manualmente o mediante cualquiera de los varios paquetes de software, incluyendo tanto software gratuito (por ejemplo, ImageJ, CellProfiler, etc.) como software comercial (por ejemplo, Metamorph, Gen5, etc.). El recuento automatizado de células es generalmente preferible, ya que las tuberías de recuento de células automatizadas desarrolladas correctamente son más precisas y menos sesgadas que los recuentos manuales. También ignoran de manera más efectiva los desechos celulares o los complejos insolubles. El desarrollo de estas tuberías es generalmente sencillo y se simplifica por la eficiencia de las manchas utilizadas. La salida es cuantitativa ya que el número real de celdas muertas se calcula automáticamente con respecto al número de celda total, y se pueden aplicar diferentes umbrales para aumentar o disminuir la rigurosidad de la detección35. Para mayor comodidad, se incluyen parámetros optimizados para contar celdas mediante el lector multimodo Cytation 5 Cell Imaging compatible con el software Gen5 v. 3.00.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el protocolo para el ensayo de citotoxicidad Hoechst/PI es robusto y requiere relativamente poco tiempo práctico, hay varios detalles experimentales que son muy importantes para garantizar resultados precisos. En primer lugar, es esencial asegurarse de que la concentración de DMSO se mantenga por debajo del 0,5% (v/v). Generalmente se acuerda que la exposición a dosis incluso bajas de DMSO puede alterar sustancialmente la morfología y la unión de las células y retrasar significativamente la progresión del c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, un estudiante de CPRIT en Investigación del Cáncer, agradece al Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (CPRIT) por su generoso apoyo, la subvención CPRIT RR150044. Este trabajo también fue apoyado por la Beca de Investigación C-1930 de la Fundación Welch, y por los Institutos Nacionales de Salud R35 GM129294 otorgados a NVK. Los financiadores no tenían ningún papel en el diseño de estudios, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
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