Summary
Le protocole décrit un essai rapide, à haut débit, fiable, peu coûteux et impartial pour déterminer efficacement la viabilité cellulaire. Cet essai est particulièrement utile lorsque les mitochondries des cellules ont été endommagées, ce qui interfère avec d’autres analyses. L’essai utilise le comptage automatisé des cellules tachées de deux teintures nucléaires – Hoechst 33342 et iodure de propidium.
Abstract
La contribution des mitochondries à la transformation oncogène fait l’objet d’un grand intérêt et d’une étude active. Comme le domaine du métabolisme du cancer devient plus complexe, l’objectif de cibler les mitochondries à l’aide de divers composés qui infligent des dommages mitochondriaux (soi-disant mitocans) devient très populaire. Malheureusement, de nombreux tests de cytotoxicité existants, tels que ceux à base de sels de tétrazolium ou de résazurine nécessitent des enzymes mitochondriques fonctionnelles pour leur performance. Les dommages infligés par les composés qui ciblent les mitochondries compromettent souvent l’exactitude de ces analyses. Ici, nous décrivons un protocole modifié basé sur la coloration différentielle avec deux colorants fluorescents, dont l’un est perméant de cellules (Hoechst 33342) et l’autre n’est pas (iodure de propidium). La différence dans la coloration permet de discriminer les cellules vivantes et mortes. L’analyse est appropriée à la microscopie automatisée et à l’analyse d’image, qui augmente le débit et réduit le biais. Cela permet également d’utiliser l’essai de façon à haut débit à l’aide de plaques de 96 puits, ce qui en fait une option viable pour les efforts de découverte de médicaments, en particulier lorsque les médicaments en question ont un certain niveau de mitotoxicité. Fait important, les résultats obtenus par Hoechst/PI colorant l’analyse montrent une cohérence accrue, à la fois avec des résultats d’exclusion bleu trypan et entre les répliques biologiques lorsque l’essai est comparé à d’autres méthodes.
Introduction
La première étape pour identifier des traitements efficaces contre le cancer est la sélection d’un essai robuste et impartial de cytotoxicité qui peut être utilisé pour examiner l’effet du traitement. Un choix commun pour les expériences à faible débit est l’exclusion du colorant bleu trypan des cellules vivantes. Cette méthode est favorisée parce qu’elle permet une méthode relativement impartiale pour quantifier la survie cellulaire. trypan bleu diffuse passivement dans les cellules dont les membranes sont compromises, mais il est effectivement bloqué d’entrer dans les cellules saines1. Le quotient des cellules vivantes et des cellules totales représente la viabilité en pourcentage, ce qui indique l’efficacité du traitement. L’inconvénient le plus important de l’essai bleu trypan est qu’il est mal adapté pour les méthodologies à haut débit. Il a un rapport signal-bruit relativement faible et une coloration prolongée peut entraîner des artefacts en raison de la coloration de cellules viables. Par conséquent, trypan exclusion bleue est généralement, mais pas toujours2, relégué au comptage manuel. Cela le rend trop lent et introduit la forte possibilité de partialité due au jugement subjectif du chercheur (à moins que des dénombrements aveuglants ou indépendants ne soient utilisés, ce qui réduit encore le débit du laboratoire). En général, le débit de cet essai est insuffisant pour la découverte moderne de médicaments.
Les analyses de viabilité, qui ont généralement un débit beaucoup plus élevé, permettent aux chercheurs de contourner cette limitation, mais viennent avec des mises en garde importantes (voir le tableau 1). Ces méthodes se regroupent généralement en deux groupes. Un groupe est composé d’analyses colorimétriques qui sont basées sur la fonction des enzymes redox cellulaires. Les substrats incolores ou non fluorescents sont convertis en produits vibrants qui peuvent être quantifiés à l’aide d’un spectrophotomètre. Les sels de tétrazolium (MTT, WST-1, XTT, etc.) et la resazurine en sont des exemples classiques. Cette catégorie comprend également des analyses luminescentes qui utilisent la luciferine pour évaluer le niveau ATP. Les analyses de ce type ont la limitation sous-jacente qu’ils mesurent le métabolisme cellulaire, qui n’est pas la viabilité cellulaire en soi. Il est assez fréquent pour les cellules de devenir quiescent dans des conditions défavorables, mais conservent encore la capacité dediviser 3,4,5. Par exemple, les cellules souches cancéreuses sont souvent relativement métaboliquement quiescent6,7,8,9, et sont susceptibles d’être difficiles à faire des analyses en utilisant ces techniques. L’efficacité des traitements qui endommagent la fonction mitochondriale, comme la plupart des mitocans, est également susceptible d’être surestimée de manière significative.
Une méthodologie alternative tire parti des propriétés chimiques de diverses substances qui leur permettent de traverser ou non des membranes biologiques croisées. Un exemple sont les taches nucléaires telles que SYTOX ou propidium iodure (PI). Cette catégorie comprend également des analyses de concept similaires mais de fonction différente, comme l’essai de déshydrogénase lactate (LDH), qui mesure la libération de LDH dans le milieu extracellulaire comme indicateur de nécrose cellulaire (figure 1, tableau 1). Ces analyses sont plus capables de faire la distinction entre les cellules métaboliquement inactives et les cellules mortes.
| Analyse/colorant | Type (s) de mort cellulaire détecté | Équipement nécessaire | Caractéristiques clés |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin) | Apoptose/Nécrose | Spectrophotomètre | Peu coûteux, rapide; analyse du point de terminaison; dépend de l’activité des enzymes (exclusivement mitochondriale en cas de MTT) et ne fait pas de distinction entre les modes de mort cellulaire1,10 |
| Libération de la LDH | Nécrose | Spectrophotomètre | Rapide, indépendant de l’activité des enzymes mitochondriques; coûteux pour les tests à haut débit; détecte les cellules nécrotiques avec membrane plasmatique compromisée11,12 |
| Trypan Blue (TB) | Apoptose/Nécrose | Microscope | Imperméant cellulaire; ne fait pas de distinction entre les modes de mort cellulaire; laborieux et ne convient pas au criblage à haut débit; plus difficile à utiliser avec les cellules adhérentes; sujettes au jugement subjectif de l’utilisateur, mais est considéré comme la méthode standard de mesure de la viabilité cellulaire13 |
| Orange acridine (AO) | Apoptose/Nécrose/ | Microscope à fluorescence | Un colorant d’acide nucléique avec des propriétés spectrales uniques, peut distinguer entre l’apoptose et la nécrose/nécroptose14 |
| Nécroptose | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Microscope à fluorescence ou cytomètre d’écoulement | Perméable aux cellules; inappropriée à elle seule pour surveiller la mort cellulaire; utile pour la co-coloration; peut être utilisé pour évaluer la condensation de chromatine et la fragmentation des noyaux dans l’apoptose précoce; peut être jumelé avec de l’iodure de propidium pour distinguer l’apoptose de lanécrose 15,16 |
| Propidium Iodide (IP) | Apoptose/nécrose tardive | Microscope à fluorescence ou cytomètre d’écoulement | Intercalateur de cellule-imperméant ; détecte à la fois l’apoptose tardive et les modes de nécrose de la mortcellulaire 17. Toxique et perméable après de longues périodes d’incubation18 |
Tableau 1. Liste des analyses de cytotoxicité. Les analyses de cytotoxicité, dont certaines ont été utilisées dans cette étude, énumérées avec la brève description de leurs caractéristiques clés.
Des études récentes ont démontré que le métabolisme mitochondrial est modifié dans certains cancers19,20,21,22,23,24,25. Par exemple, il a été démontré que les leucémies myéloïdes aiguës (LAM) reréglementent leur masse mitochondriale, leur teneur en MTDNA et leur respiration mitochondriale pour répondre à leursbesoins énergétiques 19,26,27. D’autre part, quelques tumeurs pleines sont caractérisées par le dysfonctionnement mitochondrique, ou plutôt la « reprogrammation métabolique », telle que la downregulation des protéines mitochondriques impliquées dans OXPHOS ou la teneur diminuée de mtDNA, qui a été associée à l’invasiveness de tumeur, au potentiel métastatique et à la résistance aux drogues apoptose-induisant28,29. En outre, récemment, il y a eu un intérêt accru en utilisant les composés mécanistes divers qui affectent la fonction mitochondrique (généralement appelée mitocans30),comme thérapies potentielles pour des cancers particuliers. Ces médicaments ciblent la synthèse ATP, l’ADN mitochondrial, oxphos, et la production de ROS, aussi bien que les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques liées aux mitochondries30,31. Plusieurs études ont montré que cette approche a une promessesignificative 19,32,33,34. Cependant, ces déviations métaboliques dans la biologie de cellules cancéreuses ou les traitements de mitochondries-ciblage peuvent affecter de manière significative des analyses conventionnelles de viabilité qui sont basées sur la fonctionnalité mitochondrique.
Ici, un protocole optimisé pour un essai différentiel de coloration nucléaire est décrit. Le protocole permet une détermination rapide et précise de la cytotoxicité des mitocans ou de leurs combinaisons avec d’autres composés. Hoechst 33342 est un colorant nucléaire perméant pour les cellules qui traverse facilement les membranes cellulaires pour tacher l’ADN, ce qui permet d’obtenir le nombre total de cellules. En co-souillant avec pi, qui n’entre que dans les noyaux des cellules mortes, la proportion de cellules vivantes (Hoechst seulement) et mortes (tachées avec les deux) cellules peut être déterminée avec précision. Ce protocole affine l’analysepubliée 35 en ajoutant une étape pour l’optimisation de la concentration de colorant (en recoupant les résultats avec la méthode orthogonale trypan bleu) et centrifugation de la plaque avant l’imagerie. Étant donné que de nombreuses lignées cellulaires sont semi-adhérentes ou suspendues, la centrifugation augmente la proportion de cellules qui sont photographiées et améliore fortement la précision. L’essai a plusieurs avantages, y compris que la coloration ne nécessite pas l’enlèvement des médias ou le lavage. Le mélange de colorant est également peu coûteux, facile à préparer et compatible avec les systèmes de pipetage multicanaux/robotiques.
Une fois que les cellules ont été tachées, elles sont photographiées à l’aide d’un microscope automatisé. Cela a l’avantage supplémentaire de créer un enregistrement permanent des images qui peuvent être ré-analysées plus tard et les effets de composés particuliers peuvent être réévalués par inspection visuelle des images capturées. Une fois que les images ont été obtenues, les cellules peuvent être comptées manuellement ou en utilisant l’un ou l’autre de plusieurs proxèmes logiciels, y compris les logiciels gratuits (p. ex., ImageJ, CellProfiler, etc.) et les logiciels commerciaux (p. ex., Metamorph, Gen5, etc.). Le comptage automatisé des cellules est généralement préférable puisque les pipelines automatisés de comptage cellulaire correctement développés sont plus précis et moins biaisés que les comptages manuels. Ils ignorent également plus efficacement les débris cellulaires ou les complexes insolubles. Le développement de ces pipelines est généralement simple et simplifié par l’efficacité des taches utilisées. La sortie est quantitative puisque le nombre réel de cellules mortes est automatiquement calculé en fonction du nombre total de cellules, et différents seuils peuvent être appliqués pour augmenter ou diminuer la rigueur de la détection35. Pour plus de commodité, des paramètres optimisés pour compter les cellules utilisant gen5 v. 3.00 logiciel compatible Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader sont inclus.
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Protocol
1. Cytotoxicity Assay: Configuration
- Préparer des solutions de composés d’intérêt aux concentrations désirées dans les médias appropriés (sans sérum ou 1, 2,5 ou 5 % FBS RPMI-1640).
- Pour mesurer la cytotoxicité d’un seul composé (p. ex., pour déterminer des doses efficaces), préparez des composés à une concentration finale de 2 x.
- Pour mesurer la cytotoxicité des combinaisons composées, préparer les composés à la concentration finale 4x.
- Préparez des commandes uniquement sur solvant en mélangeant la même quantité de solvant avec le milieu approprié. Par exemple, si les composés d’essai sont dissous dans le DMSO et le méthanol, faites un contrôle solvant uniquement pour chaque solvant.
- Recueillir les cellules du plat de culture ou du flacon dans un tube conique de 15 mL.
- Transférer 10 μL de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse et tacher avec 10 μL 0,4% de trypan bleu. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules viables et non viables pour chaque source cellulaire.
- Cellules de granulés à 200 g pendant 5 min. Aspirer ou décanter supernatant.
- Resuspendez la pastille cellulaire dans un média approprié au test (sans sérum ou 1, 2,5, 5 % FBS RPMI-1640) à une densité cellulaire de 3*105 cellules/mL.
NOTE 1 : La densité cellulaire de 3*105 cellules/mL fournit une densité d’ensemencement de 15 000 cellules/puits. La densité d’ensemencement est un paramètre important et devrait idéalement être prédéfinie avant l’expérience. La densité d’ensemencement devrait tenir compte de 1) la taille des cellules – habituellement de plus grandes cellules sont ensemencées à une densité inférieure; 2) durée du traitement – les cellules sont généralement ensemencées à une densité inférieure pour des expériences qui dureront plus longtemps; et 3) taux de division cellulaire – les cellules ayant un taux de division plus élevé sont ensemencées à une densité inférieure. Exemples spécifiques de densités d’ensemencement optimisées : cellules K562, plus grandes, durée de 24 h – 10 000 cellules/puits; Cellules MOLM-13, taille modérée, traitement à 24 h – 15 000/puits; Cellules MOLM-13, traitement à 48 h – 8 000/puits; petites cellules mononucléaires périphériques saines de sang (PBMCs), traitement de 24 h - 50.000/puits ; cellules primaires de la LAM, traitement à 24 h – 15 000 à 20 000/puits.
NOTE 2 : La présence de FBS dans les médias peut affecter l’activité des composés. La réduction de la concentration de FBS peut rendre les résultats d’analyse plus simples à interpréter, mais il réduit également la précision physiologique. - Graine 50 μL de suspension cellulaire de l’étape 1.5 dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal.
- Ajoutez des composés comme suit :
- Pour les analyses composées simples, ajouter 50 μL de solution composée 2x dans chaque puits. Pour les puits de contrôle des solvants, ajouter 50 μL de supports d’essai contenant le solvant à la concentration de 2 x.
- Pour les analyses combinées, ajouter 25 μL de chacun des composés (solutions 4x) dans chaque puits. Pour les puits à commande composée unique, ajouter 25 μL de solution composée 4x et 25 μL de milieu d’essai. Pour les puits de contrôle des solvants, ajouter 50 μL de milieu d’essai ou de milieu d’essai contenant le solvant.
NOTE 1 : La concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,5 %.
NOTE 2 : Il est recommandé d’ajouter le média contenant les composés avec la pipette touchant le mur de chaque puits en raison du faible volume.
- Appuyez doucement sur la plaque pour assurer le mélange du contenu des puits.
- Incuber les plaques à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5 % pendant un temps approprié, par exemple, 24 h.
2. Cytotoxicity Assay: coloration avec Hoechst 33342 et propidium Iodide
- Préparez la solution de coloration 10x. Cette solution doit être préparée fraîchement avant chaque expérience, elle ne peut pas être stockée. Les concentrations finales de colorant doivent être déterminées avant l’expérience.
- Pour les lignées de cellules leucémiques et les cellules leucémiques primaires, 1 mL de tampon de coloration de 10 x contient 10 μL de Hoechst 33342 mM et 50 μL d’iodure propidium de 1 mg/mL en PBS stérile (concentrations finales : Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- Pour les PBMCs sains, 1 mL de tampon de coloration de 10x contient 10 μL de 20 mM Hoechst 33342 et 10 μL de 1 mg/mL d’iodure de propidium en PBS stérile (concentrations finales : Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
REMARQUE : La concentration finale d’iodure de propidium doit être déterminée avant les expériences. Les cellules doivent être testées à l’aide d’une gamme de concentrations d’IP (1, 2,5, 5 μg/mL), puis la viabilité calculée par Hoechst/PI doit être comparée à la viabilité mesurée par le bleu trypan. Les concentrations d’IP énumérées ci-dessus ont été choisies en fonction de la viabilité des cellules cibles dans les puits de contrôle des médias (au-dessus de ~90 % pour les lignées de cellules leucémiques, au-dessus de ~70 % pour les PBMCs en bonne santé).
AVERTISSEMENT : Hoechst 33342 et iodure de propidium sont des carcinogènes potentiels. Portez l’équipement de protection individuelle approprié lors de leur manipulation.
- Après l’incubation, utiliser une pipette multicanal pour ajouter 10 μL de tampon de coloration 10x à chaque puits.
REMARQUE : Pour éviter la contamination croisée, assurez-vous que les pointes de pipette ne touchent pas le média. - Appuyez doucement sur la plaque pour mélanger et dégager les bulles. Tache à 37 °C pendant 15 min.
- Centrifuger la plaque à 200 g pendant 4 min pour amener toutes les cellules au fond de la plaque. Essuyez soigneusement le fond de la plaque à l’aide d’un kimwipe humide pour enlever les fibres et/ou les débris qui interfèrent avec l’imagerie.
NOTE 1 : La centrifugation de la plaque garantit les chances les plus élevées pour toutes les cellules d’être capturées dans l’image. Souvent, les cellules mortes se détachent et flottent, fournissant des valeurs trompeuses de cytotoxicité. La centrifugation atténue cet effet.
NOTE 2 : La plaque doit être photographiée le plus rapidement possible après centrifugation, idéalement, dans les 15 minutes. Centrifugation peut réduire la sélectivité de la coloration pi et peut permettre aux cellules d’accumuler lentement iodure de propidium. L’amélioration de la précision obtenue en visualisant les cellules mortes l’emporte sur la légère augmentation de la coloration ip. Il est recommandé de terminer l’imagerie dans les 1 h de centrifugation.
3. Cytotoxicity Assay: acquisition de données
- Réglez le logiciel pour l’imageur automatisé microscope/plaque pour détecter la fluorescence pour hoechst 33342 (excitation maximale 350 nm, maximum d’émission 461 nm) et PI (excitation maximale 493 nm, maximum d’émission 636 nm). Acquérir des images pour chaque puits dans les deux canaux.
- En utilisant le logiciel (comme CellProfiler, un studio d’analyse d’image gratuit basé sur MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ, ou des logiciels propriétaires tels que Gen5) compter les cellules dans chaque puits dans chaque canal.
REMARQUE : Puisque chaque cellule doit être tachée de Hoechst 33342, et que les cellules mortes doivent être tachées d’IP, le rapport entre les morts et tous représente la fraction des cellules mortes. Par exemple, si le nombre automatisé dans l’échantillon non traité montre 467 cellules tachées de PI (cellules mortes) et 2335 cellules tachées de Hoechst 33342 (cellules totales), la fraction morte est de 0,2 ou 20%. Cette valeur est ensuite comparée à un échantillon manipulé à l’identique où le traitement a été utilisé. - Description détaillée de l’acquisition de données Hoechst/PI à l’aide du logiciel Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader et du logiciel Gen5 v. 3.00 :
- Réglez le lecteur/imageur de plaque multimode Cytation5 sur des cellules d’image dans des plaques en plastique noir génériques à fond plat, de 96 puits.
- Définissez un protocole d’imagerie pour utiliser les ensembles de filtres DAPI et Texas Red standard. Prenez des images au centre du puits à l’aide d’un objectif de grossissement 4x. N’utilisez aucun décalage (X/Y ou Z). Utilisez les paramètres d’imagerie suivants : DAPI – LED - 10, temps d’intégration - 99, gain - 0; Texas Red - LED - 8, temps d’intégration - 950, gain - 18. Effectuer un autofocus à l’aide du signal DAPI; il ne devrait pas y avoir de compensation dans la focalisation entre les canaux.
- Effectuez l’analyse d’image à l’aide du logiciel Gen5 v 3.00. Dans les paramètres logiciels, définissez les cellules comme des formes comprises entre 5 et 25 μm dans leur taille. Exclure les objets à bord primaire et diviser les objets touchants en tournant l’option spéciale « Split toucher les objets ». Ensuite, traiter l’image pour supprimer l’arrière-plan (soustraction de fond sombre), appliquer un masque nucléaire (valeur seuil DAPI >= 6000 AU), et compter les objets. Effectuez une analyse de sous-population basée sur la coloration PI (valeur seuil Texas Red >= 5000 UA), et comptez les objets. La viabilité cellulaire % est définie comme (1 -
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Representative Results
Le protocole susmentionné a été développé à l’aide de cellules OCI-AML2, qui ont été prises comme une lignée de cellules myéloïdes myéloïdes aiguës représentatives. La LAM se caractérise par une prolifération anormale de cellules hématopoïétiques indifférenciées et non fonctionnelles dans la moelleosseuse 26. Malgré les développements récents de la thérapie ciblée contre la LAM, la norme de soins est demeurée inchangée pendant plusieurs décennies et consiste en une thérapie par induction (généralement composée de trois jours d’anthracycline, p. ex., daunorubicine, idarubicine ou anthracenedione mitoxanthrone, et 7 jours de cytarabine) suivie d’une consolidation (généralement composée de cycles de traitement de la cytarabine suivis de périodes de rétablissement)36.
Suivant le protocole décrit dans la figure 1A,les cellules OCI-AML2 ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits et traitées avec la cyanure mitochondriale de cyanure de carbonyle m-chlorophényle hydrazone (CCCP) ou l’inhibiteur glycolytique 2-deoxy-D-glucose (2-DG) à une gamme de concentrations. Les cellules ont été traitées pendant 24 h à 37 °C dans les médias RPMI-1640 sans sérum, puis la viabilité a été évaluée à l’aide de l’exclusion du bleu trypan (TB) ou de l’un des quatre essais de viabilité (coloration nucléaire différentielle Hoechst/PI, essai de libération de LDH, MTT, ou alamarBlue). Des images représentatives de cellules tachées de Hoechst/PI sont affichées dans la figure 2A. Plusieurs observations importantes peuvent être faites immédiatement. Tout d’abord, le nombre total de cellules (taches Hoechst) est raisonnablement élevé et est nettement supérieur au nombre de cellules mortes (coloration pi). Ceci suggère que les conditions médiatiques ne déclenchent pas des taux élevés de mortalité cellulaire. Deuxièmement, étant donné que seules les cellules étiquetées avec Hoechst et PI sont comptées comme mortes (cellules violettes dans l’image fusionnée), la probabilité de compter les débris est très faible. Cette image montre un bon exemple de cellules correctement tachées.
Figure 1. Chronologie expérimentale et comparaison des analyses de cytotoxicité existantes. (A) Flowchart résumant le calendrier de la procédure expérimentale, par exemple la coloration Hoechst/PI. (B) Comparaison des analyses de cytotoxicité, dont certaines ont été utilisées dans cette étude. Les analyses d’exclusion des colorants impliquent des colorants nucléaires imperméables qui tachent les cellules mortes avec la membrane plasmatique compromise : TB – bleu trypan, PI – iodure de propidium, EtBr – bromure d’éthidium, et SYTOX. Deuxième groupe d’analyses dépendent du métabolisme cellulaire, par exemple, sels de tétrazolium MTT, XTT, et CKK-8 (WST-8), resazurin à base de reagent alamarBlue, etc S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Comparaison d’un panneau d’essais de cytotoxicité avec exclusion bleue de trypan. (A) Images représentatives de cellules totales (Hoechst 33342) et mortes (propidium iodure, PI) OCI-AML2 via la coloration Hoechst/PI. (B) Évaluation de la viabilité des cellules OCI-AML2 à l’aide de différentes méthodes après traitement avec un gradient de concentrations de CCCP(enhaut) ou de 2 DG(enbas). OCI-AML2 ont été traités avec CCCP ou 2-DG dans rpmi-1640 sérum-libre pendant 24 h avant de déterminer la viabilité de cellules. Montré est moyen, barres d’erreur représentent SEM. C. Différence dans la viabilité cellulaire entre les essais de cytotoxicité dans (B) vs taches bleues trypan (voir les tableaux supplémentaires S1-2 pour les nombres exacts et la différence médiane). Les étoiles indiquent une différence significative par rapport à. taches bleues trypan. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – non significatif. La comparaison de groupe a été faite par t-testavec correction pour l’essai multiple d’hypothèse. Trois répliques biologiques indépendantes ont été exécutées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Comme nous l’avonsrécemment signalé 19, les leucémies sont très sensibles aux traitements mitotoxiques, ce qui indique que les cellules ont déjà des dommages mitochondriaux sous-jacents. Sur cette base, nous avons prédit que les analyses MTT et alamarBlue, qui sont basées sur l’activité enzymatique mitochondriale, mesureraient inexactement la viabilité cellulaire. Comme prévu, ces essais (en particulier alamarBlue) ont montré une viabilité significativement plus faible par rapport à l’exclusion bleue trypan, voir figure 2B,C, Tableaux supplémentaires S1-S2). Ceci est compatible avec le fait que les doses de ces composés nécessaires pour induire l’apoptose ou la nécrose sont plus élevées que celles nécessaires pour compromettre la fonction mitochondriale.
Parmi les analyses qui ont été testées, la double coloration avec Hoechst 33342 et pi avait la meilleure combinaison de robustesse, de sensibilité et de consistance avec la coloration de la tuberculose, avec la plus petite déviation médiane de la méthode d’exclusion de la tuberculose après le traitement cccp ou 2-DG(tableaux supplémentaires S1-2). Fait intéressant, à des doses plus élevées de viabilité du PCCC (50 et 100 μM), la viabilité estimée avec Hoechst/PI ou tb a été augmentée par rapport aux doses plus faibles(figure 2B, en haut). Ceci est probablement dû aux précipitations de CCCP à des doses plus élevées dues à son hydrophobicité, réduisant sa concentration effective et son impact sur les cellules. Toutefois, l’augmentation de la dose de CCCP a encore réduit la viabilité moyenne estimée par Hoechst/PI des cellules OCI-AML2 : 74 % à 150 μM, 62 % à 200 μM, 6 % à 300 μM(données non montrées).
L’analyse Hoechst/PI a également été efficace pour déterminer la viabilité cellulaire après traitement avec d’autres molécules de ciblage des mitochondries. Il s’agit notamment de la roténone, un poison qui compromet le complexe I de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux37, et 3-bromopyruvate, un inhibiteur glycolytique et agent alcalin qui altère la respiration mitochondriale et le métabolisme mitochondrial38 (Figure 3A-D, Tables supplémentaires S3-4).
Figure 3. Validation de l’essai de cytotoxicité hoechst/PI dans les cellules leucémiques. (A,B) OCI-AML2 (AML) cellules ont été traitées avec différentes concentrations de roténone (A) ou 3-bromopyruvate, 3-BP (B) dans le sérum sans RPMI-1640 médias pendant 24 h, puis la viabilité a été déterminée. Montré est moyen avec SEM. (C,D) Comparaison de la différence de viabilité entre Hoechst / PI analyse vs trypan taches bleues (pour les cellules en A-B, voir les tableaux supplémentaires S3-4 pour la quantitation). Les étoiles indiquent une signification statistique par rapport à la coloration bleue trypan. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – non significatif. La comparaison de groupe a été faite par t-testavec correction pour l’essai multiple d’hypothèse. E. MOLM-13 (LAM), cellules primaires de LAM isolées d’un patient, cellules MOLT-4 (ALL) et K562 (LMC) ont été traitées avec les concentrations indiquées de roténone dans les médias RPMI-1640 sans sérum pendant 24 h, avant la détermination de viabilité utilisant la coloration hoechst/PI. Montré est moyen avec SEM. Trois répliques biologiques indépendantes ont été exécutées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
L’analyse de cytotoxicité hoechst/PI a été validée à l’aide d’un panel de lignées de cellules leucémiques représentant plusieurs types de leucémie, ainsi que de cellules primaires. Ils comprenaient molm-13 (une lignée cellulaire de LAM), cellules primaires de LAM dérivées d’un échantillon représentatif de patients, MOLT-4 (une lignée aiguë de cellules de leucémie lymphoblastique, TOUS), et K562 (une lignée chronique de cellules myéloïdes de leucémie, LMC) (figure 3E, figure supplémentaire S1). Les résultats de l’analyse Hoechst/PI ont montré que ces cellules présentaient de profondes différences dans la sensibilité à la rotenone, allant des cellules très sensibles (MOLT-4) aux cellules résistantes (K562).
Pour démontrer la robustesse de l’essai, les cellules d’OCI-AML2 ont été traitées avec un gradient de concentration de 3-bromopyruvate, tel que décrit dans le protocole ci-dessus. Des dénombrements cellulaires ont été recueillis pour 6 puits à chaque concentration et sontindiqués ( figure 4A,B). Ces dénombrements ont été utilisés pour calculer la viabilité et ont montré que seulement 4 puits étaient suffisants pour saisir avec précision les résultats de l’analyse (figure 4C). La courbe dose-réponse qui en résulte estindiquée ( Figure 4D).
Figure 4. Reproductibilité de la coloration Hoechst/PI. Viabilité des cellules OCI-AML2 après 24 h de traitement avec différentes concentrations de 3-bromopyruvate (3-BP). (A) Nombre total de cellules comptées via Hoechst 33342 coloration, (B) Nombre de cellules mortes comptées par coloration de propidium iodure. (C) Viabilité (%) calculé àl’aide ( A-B). (D) Graphique représentatif dose-réponse. Montré est moyen avec SEM. Trois répliques biologiques indépendantes ont été exécutées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Bien que l’analyse soit relativement robuste, il faut quand même faire du soin. Une mauvaise exécution de l’essai peut compromettre son exactitude. Plusieurs résultats compromis sont affichés à des fins de dépannage( figure 5). La première série d’images montre les conséquences d’une coloration trop élevée avec l’IP, qui peut résulter des sources suivantes : utilisation du colorant à une concentration trop élevée, coloration trop longue ou utilisation d’un temps d’intensité/intégration de LED trop élevé dans le canal rouge (figure 5A). Ces erreurs généreront un nombre artificiellement gonflé de cellules mortes. La deuxième question découle de la négligence de l’étape de centrifugation. Souvent, les cellules mortes commencent à perdre leur attachement de la surface du plat. Par conséquent, ils seront sous-représentés lors de l’acquisition d’images, qui se produit généralement près du fond du puits (figure 5B). Enfin, la surexposition dans le chenal Hoechst augmente artificiellement la taille des cellules, réduisant considérablement le nombre total par puits et limitant la puissance d’essai (figure 5C).
Figure 5. Comparaison des paramètres d’analyse optimaux et sous-optimaux. Comparaison des résultats obtenus via des paramètres optimisés (gauche) ou des paramètres sous-optimaux (droite). (A) Les PBMCs sains ont été tachés avec l’iodure de propidium à 1 μg/mL (gauche) ou 5 μg/mL (droite) pendant 15 min avant la formation image. (B) Images de cellules OCI-AML2 prises avec (gauche) ou sans centrifugation de plaque (droite). (C) Images de cellules OCI-AML2 acquises avec un temps d’intégration optimal (gauche) ou excessif (droite) pour le canal Hoechst. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Différence avec la méthode bleu trypan, % | ||||
| CCCP, μM | Hoechst/PI | Analyse LDH | Mtt | Bleu Alamar |
| 3.1 | -1.19 | 33.00 | -31.05 | -59.04 |
| 6.3 | 6.99 | 41.90 | -11.03 | -59.34 |
| 12.5 | 0.71 | 41.60 | 4.31 | -52.52 |
| 25 | 30.73 | 66.33 | -3.68 | -51.85 |
| 50 | 47.38 | 50.71 | -17.71 | -60.27 |
| 100 | 13.81 | 17.12 | -45.31 | -67.25 |
| Médiane | 10.40 | 41.75 | -14.37 | -59.19 |
Tableau supplémentaire S1. Différences de viabilité pour un panel d’analyses dans les cellules OCI-AML2 après le traitement cccp. L’évaluation de la viabilité a été exécutée après 24 h de traitement avec différentes concentrations de CCCP. Les différences médianes de viabilité entre les essais testés (Hoechst/PI, LDH, MTT ou alamarBlue) et les taches bleues trypan avec comptage automatisé ont été calculées en fonction des différences de viabilité à chaque concentration de médicaments.
| Différence avec la méthode bleu trypan, % | ||||
| 2-DG, mM | Hoechst/PI | Analyse LDH | Mtt | Bleu Alamar |
| 3.1 | 16.16 | 20.77 | 5.82 | -20.27 |
| 6.3 | 22.93 | 31.96 | -11.13 | -31.11 |
| 12.5 | 30.85 | 45.07 | -34.27 | -36.29 |
| 25 | 13.81 | 42.39 | -55.79 | -52.29 |
| 50 | 16.96 | 81.12 | -29.38 | -47.68 |
| 100 | 7.79 | 149.16 | -19.37 | -28.67 |
| Médiane | 16.56 | 43.73 | -24.38 | -33.70 |
Tableau supplémentaire S2. Différences de viabilité pour un panel d’analyses dans les cellules OCI-AML2 après le traitement 2-DG. L’évaluation de la viabilité a été exécutée après 24 h de traitement avec différentes concentrations de 2-DG. Les différences médianes de viabilité entre les essais testés (Hoechst/PI, LDH, MTT ou alamarBlue) et les taches bleues trypan avec comptage automatisé ont été calculées en fonction des différences de viabilité à chaque concentration de médicaments.
| Rotenone, μM | Différence de viabilité, % (Hoechst/PI-trypan bleu) |
| 10 | 4.45 |
| 25 | 7.61 |
| 50 | 17.70 |
| 100 | 7.74 |
| 150 | 56.38 |
| 200 | 16.57 |
| Médiane | 12.15 |
Tableau supplémentaire S3. Différence de viabilité entre hoechst/PI et méthode d’exclusion de TB dans les cellules d’OCI-AML2 après traitement de rotenone. L’évaluation de la viabilité a été exécutée après 24 h de traitement avec différentes concentrations de rotenone. La différence médiane de viabilité entre Hoechst/PI et la coloration bleue trypan avec comptage automatisé a été calculée en fonction des différences de viabilité à chaque concentration de drogue.
| 3-BP, μM | Différence de viabilité, % (Hoechst/PI-trypan bleu) |
| 5 | 5.73 |
| 10 | 9.00 |
| 25 | 7.72 |
| 50 | -1.90 |
| 100 | -28.23 |
| 200 | -20.77 |
| Median | 1.91 |
Tableau supplémentaire S4. Différence de viabilité entre hoechst/PI et méthode d’exclusion de TB dans les cellules d’OCI-AML2 après traitement de 3-bromopyruvate (3-BP). L’évaluation de la viabilité a été effectuée après 24 h de traitement avec différentes concentrations de 3-BP. La différence médiane de viabilité entre Hoechst/PI et la coloration bleue trypan avec comptage automatisé a été calculée en fonction des différences de viabilité à chaque concentration de drogue.
Figure supplémentaire S1. Images représentatives de cellules tachées de Hoechst/PI, avec ou sans traitement à la rotenone à des concentrations indiquées dans les médias RPMI-1640 sans sérum pendant 24 h : A-B. LAM : lignée cellulaire MOLM-13 (A) et cellules primaires de la LAM (B) dérivées d’un échantillon représentatif de patients. C. C. ALL: MOLT-4 ligne cellulaire. D. D. LMC : ligne cellulaire K562. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Bien que le protocole d’analyse de cytotoxicité Hoechst/PI soit robuste et nécessite relativement peu de temps pratique, plusieurs détails expérimentaux sont très importants pour assurer des résultats précis. Premièrement, il est essentiel de s’assurer que la concentration de DMSO reste inférieure à 0,5 % (v/v). Il est généralement admis que l’exposition à des doses même faibles de DMSO peut modifier considérablement la morphologie et l’attachement des cellules et retarder considérablement la progression du cyclecellulaire 39,40.
Deuxièmement, la coloration doit être effectuée dès que possible après le traitement. Comme il n’y a pas d’étapes de lavage, le composé reste dans les puits et peut continuer à infliger des dommages aux cellules. Par rapport au protocole antérieur35, les cellules ont été tachées pendant seulement 15 minutes. Ceci limite la possibilité que les cellules viables puissent être par inadvertance souillées avec l’iodure de propidium. Pour cette raison, nous suggérons des traitements stupéfiants et des taches si plus de deux plaques seront traitées. Cela permet de temps d’imagerie entre les plaques et améliore la reproductibilité.
Troisièmement, la concentration appropriée de colorant dépend du type de cellule. Il est important de déterminer empiriquement la concentration optimisée d’iodure de propidium, en commençant par les cellules non traitées, en utilisant la coloration bleue trypan comme référence orthogonale.
Enfin, l’étape de centrifugation immédiatement avant la visualisation est également critique. Sur la base de ce protocole, une gamme de 500-4000 cellules est enregistrée (selon la densité d’ensemencement). Il s’agit d’une amélioration notable par rapport aux 100-400 cellules par puits utilisé précédemment35. Compte tenu de la variation de la population de cellules cancéreuses (en particulier les cellules primaires), il est important d’avoir plus de cellules à analyser et peut permettre une analyse plus robuste des données.
En raison de la simplicité relative de la méthode, une grande variété de modifications peuvent facilement être effectuées. Par exemple, de nombreux autres sous-dyes à imperméabilité cellulaire sont disponibles auprès d’un certain nombre de fournisseurs et peuvent être remplacés par de l’iodure de propidium. Bien que cette substitution ait relativement peu de valeur à elle seule, l’augmentation de la palette de couleurs signifie que des expériences plus complexes peuvent être réalisées. Par exemple, l’ajout d’une troisième couleur permettra d’évaluer la survie différentielle entre les sous-populations de cellules, comme c’est généralement le cas avec la cytométrie du flux.
Une modification plus substantielle du protocole est de renoncer à la visualisation cellulaire et à l’aide d’un spectrophotomètre à la place. Cette approche a l’avantage d’utiliser une pièce d’équipement presque omniprésente (un spectrophotomètre standard avec un lecteur de microplaque) et est la méthode la plus rapide pour acquérir des données. Cependant, cette méthode est beaucoup moins précise. L’intensité de fluorescence est représentative de la coloration cellulaire, mais les variations stochastiques de l’intensité des taches, combinées à la zone d’échantillonnage relativement plus petite, introduisent une variabilité significative. Bien que d’autres optimisations (comme l’inclusion d’une étape de lavage fixe et supplémentaire ou d’un plus grand nombre d’échantillons) puissent résoudre ces problèmes, la microscopie par fluorescence est généralement une approche supérieure.
En conclusion, le protocole hoechst/PI modifié est un essai rapide, précis, peu coûteux, de cytotoxicité à haut débit qui est indépendant de la fonction mitochondrique. Cet essai a une utilité considérable pour le criblage efficace des composés ou des combinaisons composées qui ciblent les mitochondries.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
NVK, un chercheur du CPRIT en recherche sur le cancer, remercie le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) pour son généreux soutien, la subvention du CPRIT RR150044. Ces travaux ont également été soutenus par la Subvention de recherche C-1930 de la Fondation Welch et par les National Institutes of Health R35 GM129294 attribués à NVK. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
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