Summary
このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ 胚および画像核内アクチン棒集合体にローダミン共役球状アクチンを注入することです。
Abstract
このプロトコルの目的は、熱ストレスに続く生きたショウジョウバエメラノガスター胚に集まり、核内アクチン棒を可視化することです。アクチンロッドは、神経変性疾患を含むヒト病理に付随する保存された誘導アクチンストレス応答(ASR)の特徴である。以前は、ASRが形態形成の失敗と胚の発達の生存率の低下に寄与することを示した。このプロトコルは、イメージング、遺伝学および生化学に非常に適したモデルシステムにおけるアクチンロッドアセンブリおよびASRの基礎となるメカニズムの継続的な研究を可能にする。胚は回収され、注入のためにそれらを準備するためにカバースリップに取り付けられる。ローダミン共役球状アクチン(G-アクチンレッド)を希釈し、マイクロニードルに装填する。各胚の中心に1回の注射が行われる。注射後、胚は高温でインキュベートされ、核内アクチン棒は共焦点顕微鏡で視覚化される。光漂白(FRAP)実験後の蛍光回復はアクチン棒に対して行われ得る。細胞質中のアクチンが豊富なその他の構造も画像化することができる。我々は、G-アクチンレッドが内因性G-アクチンのように重合し、単独では正常な胚の発達を妨げないことを発見した。このプロトコルの1つの制限は、胚への重大な傷害を避けるために注射中に注意を払わなければならないということです。しかし、練習では、ショウジョウバエ胚にG-actinRedを注入することは、アクチンロッドを視覚化するための迅速かつ信頼性の高い方法であり、任意の遺伝子型のハエや低酸素症や酸化ストレスを含む他の細胞ストレスの導入で簡単に使用することができます。
Introduction
このプロトコルは、誘導アクチンストレス応答(ASR)1を受けている熱ストレス胚における核内アクチン棒の集合体を可視化するためにG-アクチンレッドを注入する方法を説明する。我々は、胚において形態形成の破壊および生存率の低下をもたらすASRの研究を支援するためにこのプロトコルを開発し、成人のヒト細胞型は腎不全2、筋筋筋症3、アルツハイマー病およびハンチントン病4、5、6、7、8を含む病理に関連している。このASRは、ヒートショック9、10、11、酸化ストレス4、6、および異常ハンチンチンまたはβアミロイドオリゴマー化4、5、6、7、9、13、14、15、16を含む多数の細胞ストレスによって誘発される。ASRの特徴は、アクチン相互作用タンパク質のストレス誘発過活性化によって駆動される細胞質または影響を受ける細胞の核のいずれかに異常なアクチン棒の組み立てであり、Cofilin1、5、6、10。残念ながら、ASRに関する重要な知識のギャップは残っています。例えば、アクチン棒の機能は知られていない。私たちは、いくつかの細胞型の細胞質にロッドが形成される理由を理解していないが、他の人の核。また、ASRがストレスを受けている細胞や胚に対して保護的または不適応であるかどうかも明らかではない。最後に、コフィリンの過剰活性化やアクチンロッドアセンブリの根底にある詳細なメカニズムはまだ分かりません。したがって、このプロトコルは、生きたフルーツフライ胚の非常に難しい実験システムにおけるアクチンロッド形成およびダイナミクスを視覚化することによってASRを探査するための迅速かつ汎用性の高いアッセイを提供する。
生きているショウジョウバエ胚にG-アクチンレッドをマイクロインジェクトするプロトコルは、組織構築イベント中に正常な細胞質アクチン構造17のダイナミクスを研究するために最初に開発された。これらの研究では、G-アクチンレッド注射は、サイトカネシスまたは胃の17、18を含む胚の初期の発達過程に悪影響を及ぼさないことを発見した。その後、プロトコルを変更し、ASR1を受けている熱ストレス胚のアクチンロッドのイメージングを可能にするために、胚処理およびG-アクチンレッド注入を適応させる。G-アクチン赤注射以外の他の方法は、胚中のアクチンを視覚化するために使用することができる。これらの方法は、アクチンまたはウトロフィン-mCherry、ライフアクト、F-トラチンGFP、およびモージンGFPなどのアクチン結合タンパク質のドメインにタグ付けされた蛍光タンパク質(FP)を発現させることに依存している(19でレビュー)。しかし、これらのFPプローブを使用すると、いくつかのアクチン構造を安定または破壊する可能性があるため注意が必要であり、すべてのアクチン構造20に等しくラベルを付け、アクチンGFPの場合は、応力依存だけでなくアクチン濃度依存性のロッドアセンブリの分析に問題がある。したがって、G-アクチンレッドは、フライ胚のロッド研究のための好ましいプローブであり、胚の大きなサイズは、その容易な注射を可能にする。
このプロトコルのワークフローは、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27にタンパク質、核酸、薬物、および蛍光指標を注入するために使用されてきた他の確立されたマイクロインジェクション技術に似ています。しかし、ここでのG-アクチンレッドのマイクロインジェクションに続いて、胚は、ASRおよび核内アクチン棒集合体を誘導するために軽度の熱ストレスにさらされる。ハエや注入リグにアクセスできるラボでは、異なるストレスによる誘導や、異なる遺伝的背景での変調など、ASRに関する特定の研究ラインに対して、この方法を容易に実装し、適応可能にする必要があります。
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Protocol
1. 胚コレクションカップとリンゴジュース寒天プレートを準備する
- 注射実験の5日前に、28 を構築するか、または少なくとも2つの小さな胚採取カップを調達する。小さなコレクションカップ28で使用される新鮮な60ミリメートルリンゴジュース寒天プレートを作ります。4°Cで湿ったペーパータオルで覆われたプラスチック製の箱にプレートを保管してください。
注:ステップ1.3で説明したようにフライ番号が設定された小さな胚コレクションカップは、実験ごとに十分な胚数を提供すると同時に、胚の取り扱いと注射を早期発達段階のイメージングを可能にするのに十分な時間で行うことができるようにします。 - 18°Cにリンゴジュースプレートを温め、プレートの中央に酵母ペーストのダブを追加します。酵母ペーストは、活性酵母と蒸留水の簡単なペーストです。
- 最も寛大な産卵を促進するために、実験の2日前にハエとコレクションカップを設定します。コレクションカップに少なくとも100匹のメスと50匹の雄のハエを加え、準備されたリンゴジュースプレートを上に付けます(図1、ステップ1)。注射実験に至るまでの日には、リンゴジュースプレートを1日に少なくとも2回、朝に1回、夕方に1回変更します。
注:胚の採取のコップが12時間のライトオン/ライトオフサイクルで18°Cに保たれている場合、最良の注入および画像化の結果が得られる。
2. マイクロインジェクション用G-アクチンレッド の作業ストック溶液を準備する
注:この準備は、G-actinRedの5mg / mL作業ストックの2μLしか作らず、マイクロインジェクション技術に慣れていない場合は、ステップ3にスキップして、貴重な作業ストックを節約するために中性のpHバッファでマイクロインジェクションを練習することが有利です。ベンダーのG-actinRed の10 μgストックは、最大6ヶ月間、4°Cで乾燥剤の〜500 gの16オンススクリュートップジャーに元の包装に保管することができます。
- G-バッファストックソリューションを事前に準備します:5 mM Tris-HCl、0.2mM CaCl 2、pH 8.0。フィルターを使用し、室温で保管します。
- 注射の日に、ステップ2.1からGバッファストックを使用して氷上の新鮮なスナップキャップマイクロ遠心分離管にGバッファ作業溶液の1 mLを準備し、示された最終濃度で次の補充:1 mMジチオスライトール(DTT)および0.2 mMM ATP、pH 8.0。
注:Gバッファ動作ソリューションの1 mL量は、実験に必要なもの以上ですが、準備を簡素化します。実験後に超過分を破棄するか、ユーザーが好みに応じてスケールダウンできます。- 氷の上に10 μgのG-actinの赤 いストックを保ち、最初にチューブの中のG-actinRed のピンクの液滴の上にろ過された蒸留水の1 μLを加えます。
- 次に、ステップ2.2から冷たく、作りたてのGバッファ作業溶液を1μL加えます。ピペットのボリュームを1 μLに設定してよく混ぜ合わせるため、上下に20回ピペットを入れる。G-actinレッド ストックは5mg/mLの最終希釈になります。
- 準備したG-アクチンレッド を氷の上で30分間インキュベートします。
- 遠心分離機は、マイクロ遠心分離機で4°Cで20分間16,000xgで調製したG-アクチンレッドを任意の沈殿物を除去する。
- 慎重に氷の上に新鮮なスナップキャップマイクロ遠心チューブに上清の1.5 μLをパイプし、濃いピンクのペレットを避けます。
- マイクロニードルにロードする準備ができるまで、準備したG-actinレッド 上清を氷の上に最大6時間保管してください。
注:マイクロニードルは、マイクロピペットの引き手で事前にキャピラリーチューブから引っ張ることができ、その後、100 x 20ミリメートルペトリ皿にモデリング粘土のストリップに室温で保存することができます。マイクロニードルプルの推奨パラメータは、ピペットクックブック29にあります。
3. 胚を収集し、注射用にマウント
- ハエが18°Cの酵母ペーストでリンゴジュースプレートに30分間胚を置くことを許可します。
- ハエが横たわっている間、 酵母ペーストのない リンゴジュース寒天プレートを室温に事前に温め、かみそりの刃でリンゴジュース寒天の4cm x 1cmの長方形のくさびを切り取り、25mm x 75 mmのガラススライドに置きます。
- 30分採取およびデコールリオネート胚から採取した収穫プレートは、新鮮な漂白剤を注ぎ込み、蒸留水で1:1希釈し、プレート上に1分間旋回し、28(図1、ステップ2)に記載するようにプレートを旋回させた。
注:漂白剤の異なるブランドは、異なる濃度で販売されています。ここで使用される漂白剤は、ボトルから6%次亜塩素酸ナトリウムであり、3%次亜塩素酸ナトリウムの最終濃度に希釈されます。わずかに低い濃度で他の漂白剤ブランドも同様にうまく機能します。 - 漂白剤とデコリオネート胚を回収バスケット(70μm細胞ストレーナー)に注ぎ、噴出ボトルの蒸留水でプレートを2回リンスし、これらのくすを回収バスケットに加えます。
- 酵母の塊が見えず、ペーパータオルに点がけられたときに余分な漂白剤からピンクの跡が残らないまで、蒸留水で採取バスケット内のデコリオネート胚を精力的に洗浄する。
- 30分採取およびデコールリオネート胚から採取した収穫プレートは、新鮮な漂白剤を注ぎ込み、蒸留水で1:1希釈し、プレート上に1分間旋回し、28(図1、ステップ2)に記載するようにプレートを旋回させた。
- 蒸留水で湿らせた毛を持つ絵筆を使用して、デコリオネートを移し、コレクションバスケットからガラススライド上の準備されたリンゴジュース寒天ウェッジに胚を洗浄します。
- 細かい先端ピンセットまたは解剖針を使用して、長方形の寒天ウェッジの長い軸に沿って10個の胚を直線に並べ替えます(図1、ステップ3)。前極が右向きで、後側が研究者に向かうよう、胚を頭から尾に並べてください(図1、ステップ3、拡大)。
- P200ピペットチップの端部の0.5cmをカミソリの刃で切り取り、「胚接着剤」(28に記載)に浸す。幅5mmの領域(図1、ステップ4)を24mm×50mmの長方形のカバースリップの長い端に沿って寛大にコーティングし、乾燥させて接着剤を付けます。乾燥は〜30 sを取り、接着剤コーティングされた領域全体が濡れたり光沢なくマットに見えたら完了します。
注:少なくとも48時間前に「胚接着剤」を準備してください。28に記載されているようにシンチレーションバイアルで両面テープのストリップにn-ヘプタンを追加します。 - 「胚接着剤」が乾燥したら、カバースリップの端と胚の列の間に2〜3mmのスペースを残して、寒天の上に整列した胚の列の上にカバースリップ接着剤をそっと下に置きます。
注:カバースリップの端に近すぎる胚を貼り付けると、実験の過程で胚が乾燥しすぎる可能性があります。 - 胚が上を向いることができるようにカバースリップをひっくり返します。カバースリップの 1 つの長いエッジに沿って、そしてカバースリップの最も近い端に向かう腹側領域 (図 1、ステップ 4、拡大) に沿って、ラインで立ち往生する必要があります。
- 16オンスのスクリュートップジャーに保存された新鮮な青の乾燥剤の150 gの上に優しく胚でカバースリップを置くことによって胚を乾燥させる。蓋をしっかりとねじ込み、8~10分間インキュベートします(図1、ステップ5)。
- 乾燥後、デシカンジャーからカバースリップを取り出し、カバースリップの各短い側を顕微鏡スライドにテープで貼り付け、胚側を上にして、2枚の4cm2片の両面テープを使用して、胚カバースリップが注入段階に収まるようにする(図1、ステップ6)。
- パツールピペットを使用した2~3滴のハロカーボン27オイルを加えて、整列した胚を覆い、さらに脱水から保護する(図1、ステップ6)。
4. アクチンロッド形成を促進するために、胚を注入し、熱する
注:すべての注入は18°Cの温度管理された部屋で行われる。
- ガラスペトリ皿から湿度の高いインキュベーションチャンバーを少なくとも100mm x 20mmの大きさで準備し、蒸留水で湿らせたラボティッシュワイパーのねじれでチャンバーに並ぶ(図1、ステップ8)。32°Cでインキュベーションチャンバーを予熱するか、または胚を注入する前に所望のインキュベーション温度を温める。
- マイクロインジェクタ用の気流弁を開き、マイクロインジェクタをオンにします(圧縮空気またはハウスエア、圧力が90psi以上で適しています)。
- 胚が乾燥している間、マイクロローダーチップを使用して、以前に準備されたG-アクチンレッド 上清をマイクロニードルにバックロードします。ピペットを1-1.5 μLに描画するように設定します。
注: アクチンの粘性のため、積み込み量が正確でない場合があり、少なくとも1~2マイクロニードルをロードするのに十分なアクチンが残っている可能性があります。マイクロニードルが適切に較正され、実験の過程で詰まっていない場合、ロードされたマイクロニードルあたり最大60個の胚を注入することができます。 - マイクロニードルを針ホルダーに取り付け、ネジを締めます。マイクロインジェクターにエアチューブを接続し、マイクロニードルの逆流圧力が30 hPaに平衡していることを確認します。
- マイクロインジェクターの設定を調整して、スライドマイクロメータ上にG-アクチンレッド (〜500 pL)の直径100μmの気泡を出します。マイクロインジェクターで圧力ノブ(500-1500 hPa)と射出パルスタイムノブ(0.1-0.5 s)を回転させて、適切なバブルサイズを得る。アクチン粘度とマイクロニードルチップサイズの変動を考慮して、新しいマイクロニードルがロードされるたびにこれらの設定を調整します。
注:準備されたG-アクチンレッド は粘性であり、胚を注入する前に排出されるべきマイクロニードルの先端に空気があるかもしれません。G-アクチンレッド がマイクロニードルの先端から容易に排出されない場合は、スライドマイクロメーターの端にマイクロニードル先端をそっと壊します。 - 取り付けられた胚を持つスライドを顕微鏡のステージに置きます。
注:設定されたすべての注入は異なるので、研究者はそれに応じて注射方法を調整する必要があります。ここで胚は静止したマイクロニードルに対して移動し、胚をマイクロニードルに動かして各胚を注入する。 - マイクロマニピュレーターのステージと10倍の目的の焦点を光顕微鏡で調整し、胚が見えるようにします。胚は、ビテリン膜の輪郭が最も鋭く、胚が最も大きく見えるとき、正しい焦点面にある。正しい発達段階にある胚を注入して、注入後のインキュベーションが完了するまでに、クラッチのほとんどが所望の発達段階に達するように(例えば、ボウネスのステージ2-3 30 で胚を注入して、32°Cでの熱ストレス後の細胞化でロッドを観察する)。
- マイクロニードルコントロールを使用して、針を胚と同じ焦点面に持ち込みます。
注:マイクロニードルがステージまたはマイクロニードルを移動中にカバースリップに引っかかる場合、マイクロニードルはスライドに近すぎて正しい焦点面にありません。マイクロニードルは、カバースリップに平行で、かなりの角度ではなく、必要があります(図1、ステップ7)。 - マイクロニードルを胚に挿入して、腹側領域の真ん中、胚「赤道」で胚に当たる。マイクロニードル先端が胚の中央の内側に見えるときに、フットペダルまたは「注入」ボタンでトリガーインジェクション(図1、ステップ7)。
- G-アクチンレッド を一度注入し、ゆっくりとマイクロニードルを取り除きます。ステージを移動し、適切な発達段階の各胚について繰り返します。
注:Gアクチンレッド が注入され、細胞質のビットが胚から漏れ出す可能性があるため、胚の膨張は正常です。 - すべての胚が注入された後、準備された湿気の注入室に胚を入れてスライドを置き、蓋を閉じる(図1、ステップ8)。細胞化に達する胚を得ようとする場合、湿気の多いインキュベーションチャンバーで32°Cで60〜75分間胚を熱ストレスさせる。
注:インキュベーション時間は、熱ストレス胚の細胞化における棒の視覚化を可能にする注目されています。より低い温度31で発達が遅くなるので、非熱ストレス制御胚のインキュベーション時間は長くなります。これらの対照胚は、特定の実験の設計および問われる質問に応じて、18°Cまたは25°Cなどの温度で湿気の多いチャンバーでインキュベートすることができる。G-アクチンレッド が胚全体に拡散するのに必要な最小インキュベーション時間は30分です。
5. 共焦点顕微鏡による熱ストレス胚中の画像アクチン棒
- 胚が熱ストレスを受けている間、共焦点顕微鏡をオンにして、561 nmレーザーチャネルを選択します。
- 対物レンズ(推奨25倍、40倍、63倍)を作業位置に移動します。
- 熱を強調した胚をイメージングする場合は、加熱されたステージインキュベーターを32°Cの内部温度を達成するように設定する。 ポイントアンドシュートまたは赤外線温度計を使用して、目的またはその近くの温度を確認できます。
- インキュベーションが完了した後、湿気の高いインキュベーションチャンバーから注入された胚でスライドを取り外す(図1、ステップ9)。
- 素早く作業し、取り付けられた胚を付けたカバースリップをスライドに付着させるために使用された両面テープピースをそっとこじ取る(図1、ステップ9)。
注意:あまりにも多くの力が加えられるとカバーリップが簡単に粉々になる可能性がありますので、これらのステップ中は穏やかにしてください。 - 2枚の長さ2枚の長さのテープを2枚一緒に貼り付け、テープを半分に半分に切って2つのストリップ、2つのストリップ、2.5 x 0.5 cmの長さを作ります(図1、ステップ10)。
- 各テープストリップの長さの3分の2を最初のカバースリップに貼り付け、Halocarbon 27オイル(図1、ステップ10、オレンジ)の胚の両側に隣接し、テープストリップの3分の1が胚が貼り付けられている最初のカバースリップの端にぶら下がったままにします。手袋をはめた手を使用し、このステップ中に胚に触れないように注意してください。
- テープストリップの上に2つ目の長方形のカバースリップをそっと置き、カバーリップの間に胚を挟みます(図1、ステップ10、青)。25 mm のエッジを位置合わせしますが、幅を 1 cmずつずれ 50 mm の端に保ちます。
注:この2番目のカバースリップの完全な表面は、対物レンズに面する新しいイメージング表面 になりますので、この第2のカバースリップ表面に指紋やHalocarbon 27油を取得しないように注意してください。オフセットは、余分なハロカーボン27油を均等に胚を浸漬するために添加することができるように必要です。必要に応じて、2つのカバーリップがサンドイッチの上部で交う縫い目にHalocarbon 27オイルを加え、毛細血管作用によって胚をコーティングします( 図1、ステップ10の破線を参照)。 - カミソリの鈍い側でテープストリップの上にあるカバースリップの領域をそっとタップして、カバースリップをテープに付着します。
- カバースリップサンドイッチをひっくり返し、ラボのティッシュワイパーの上に置いて、画像表面を清潔に保ち、共焦点顕微鏡に運びます(図1、ステップ11)。イメージングの前にテープが両方のカバーリップに完全に貼り付けられていることを確認します。
- 加熱された段階が温度であることを確認し、反転顕微鏡を使用する場合は、選択した対物レンズに浸漬液を追加します。
- カバースリップサンドイッチを慎重にステージに配置して、新しい撮像面(2番目のカバースリップ)が浸漬液に触れるものであることを確認します(図1、ステップ11)。
注:必要に応じて、カバースリップサンドイッチを両面テープの2つの小片でステージに貼り付けて、カバーリップが加熱されたステージにうまく収まらない場合にイメージング中に不要な動きを防ぎます。 - 細胞化中の胚(Bownesステージ4a30)または透過光または蛍光のいずれかを使用した望ましい発達段階に焦点を当てる。
- 胚に焦点を当てたら、共焦点顕微鏡のレーザー取得モードに切り替え、必要に応じてレーザーパワーとゲイン、フレームサイズ、タイリング、投影設定を調整します。
- 胚の核の焦点面を通して表面図を撮り、核内アクチン棒を見つける。ロッドは、比較的暗い核の内側に明るい筋やドットとして複数の方向に表示される必要があります(図2A、2C)。
6. 代替画像実験
- FRAPを行い、核内アクチン棒の長さや細胞質のアクチン構造(細胞化中の血漿膜の毛穴の先端など)でのアクチンのターンオーバーを調べる。
- イメージングソフトウェアでは、実験を取得するファーロウ先端またはアクチンロッドの周りの長方形の領域を選択します。
- 矩形の集録領域内のアクチンロッドの中心の小さな正方形領域を漂白するために選択します。アクチンロッドの先端が見えるようにし、核内のロッドの正確な追跡を可能にするために、実験の過程で漂白を取得しないことを確認します。
- 漂白剤レーザーを50倍に設定し、漂白剤レーザーパワーを最大に設定します。
- 時間経過を選択して、最大ピクセルのドウェル速度で合計120秒までの画像を毎秒取得し、画像取得の最初の2秒後にレーザーを漂白するように設定します。
- データを定量化して、蛍光回復の半時間を決定する1.
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Representative Results
胚処理の概略的なワークフローを 図 1に示し、代表的な実験のタイムテーブルを 表 1に示します。良好な実験結果の推定は、注入された10個の胚ごとに、見られる胚の少なくとも半分が正しい発達段階にあり、損傷を受けておらず、32°Cの熱ストレスを伴う堅牢なASRを示すということです。 このASRは、 図2A( 右パネル)の胚の代表的な表面図像に示すように、核内アクチン棒の組み立てによって証明される。アクチンロッドは、核内のいくつかの向き(画像平面に平行または垂直)で現れ、いくつかの焦点面を通して画像化することができます。それに比べて、18°Cでインキュベートされたコントロール胚はアクチン棒を表示しない(図2A、左パネル)。 図2Bに示すように、ロッドを含む原子核のパーセントを定量化できます。また、FRAP実験はロッド(図2C)に対して行われてもよい。FRAPデータの推奨定量方法を1 で参照し、アクチンロッドの漂白領域と未漂白領域に対する蛍光回収プロットの例を 図2Dに示す。
もし胚が注射によってひどく損傷を受けたり、実験中に乾燥しすぎたりすると、有糸分裂性非同期が観察され、細胞化が中断される。時には、胚に十分なアクチンを注入できなかったために棒が見えないことがあります。この場合、G- アクチンレッド注入量が500pL(ステップ4.5でマイクロメーターで測定)であることを確認し、この量が各胚マイクロインジェクションの間にG-アクチンレッド バブルのサイズを確認するために周囲の油にテスト注入を行うことによって胚間で一貫していることを確認する。さらに、ロッドの視覚化を確実にするために、ロッドアセンブリが可逆的な1 であり、胚が30分以上32°C未満の温度に保たれている場合はロッドが分解できるため、ステップ5.4で湿度の高いチャンバーから採取されると、カバースリップを追加し、胚を加熱顕微鏡ステージに移動させます。
図1:実験中の胚処理の概略図。(1)胚採取カップに入った大人のハエは、リンゴジュース寒天プレートに胚を置く。(2)胚は1:1漂白剤:蒸留水でデコリオネートされ、回収バスケットに注ぎ、蒸留水で十分に洗浄して漂白剤や破片を除去する。(3)胚は、スライド上の長方形のリンゴジュース寒天ウェッジに絵筆で移され、寒天の端に面した後ろ領域を持つ頭から尾に、その側面に配置されます。(4)ガラスカバースリップ(オレンジ)の5 x 50mm領域は「胚接着剤」でコーティングされ、寒天に配置された胚の列にそっと押し下げてカバースリップに付着する。(5) 胚を覆うカバースリップは、胚が上向きになるように反転する。胚はスクリュートップジャーに乾燥する。(6)乾燥後すぐに、カバースリップはスライドにテープでつながれ、胚は上を向き、胚はHalocarbon 27油で覆われる。(7) あらかじめ用意されたG-アクチンレッドを搭載したマイクロニードルを使用して、各胚の腹側領域の中央に1回の注射を行い、針はカバースリップに平行に配置される。(8)注射後、胚は、湿ったラボ組織ワイパーで湿ったラボ組織ワイパー(18°C)または熱ストレス(32°C)で加湿したペトリ皿の中でインキュベートされる。(9)インキュベーション後、その上に胚が付いているカバースリップはスライドから取除かれる。(10)両面テープを2枚重ねて、縦半分にスライスし、最初のカバースリップで胚を取り巻く油の両側に置く。第2のカバースリップ(青)は、新しいイメージング表面を作成するために最初の上に置かれ、必要に応じて胚をカバーするために追加されるより多くの油のためのギャップを残すように相殺される。(11)反転した共焦点顕微鏡での画像撮影の場合、カバースリップサンドイッチは反転され、2番目のカバースリップは目的に向かう。イメージングはインキュベートされたチャンバーで行われ、アクチンロッドは各胚の核のいくつかの焦点面上で視覚化されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 熱ストレス胚におけるアクチン棒の代表的な結果(A)アクチンロッドは、制御温度18°C(左パネル)でインキュベートされた胚では見られないが、32°C(右パネル)で熱ストレスを受けた胚の核に見られる。(B)代表的な実験からアクチン棒を有する核の割合の定量化。各ドットは、棒および核が画像領域全体で数えられた1つの胚を表す(n=18°Cで22胚、32°Cでn=23胚;誤差棒は標準偏差を示す)。不等分散を仮定した学生のt検定を使用して、p値を計算しました。(C)代表的な時系列はアクチン棒のFRAPを示す。漂白されたロッドの部分は白い矢印で示されます。プレ漂白剤は、漂白剤のステップの前に2 sです。時間=0sは漂白剤ステップであり、蛍光回復は60sポスト漂白剤まで追跡した。(D)プロットは、同じロッド内の未漂白領域と比較して、ロッドの漂白領域におけるアクチン蛍光の回復ダイナミクスを示す。ロッドは非常に安定しており、その中のアクチンはターンオーバーしません。したがって、回復は見られない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:推奨時刻表を含む実験ワークフローこの時刻表は、プロトコルの各ステップを完了するためにかかる予想時間を要約します。
| 順序 | ステップ | 各ステップに必要な時間 | 説明 |
| 1 | 1.1 | 5日前 | 胚の収集ケージを作る。リンゴジュース寒天プレートを注ぎます。 |
| 2 | 1.2-1.3 | 2日前 | 大人の雄と雌のハエとコレクションケージを設定します。 |
| 3 | 2.6 注 | 1日前 | マイクロニードルを作るために毛細管を引っ張ります。 |
| 4 | 2.1-2.6 | 1時間 | Gアクチンを準備します。 |
| 5 | 3.1 | 30分 | ハエが卵を産むことを許可します。 |
| 6 | 3.2-3.10 | 15~30分 | 胚を収集、マウント、乾燥させる。胚を油で覆う。 |
| 7 | 4.1 | 30分前 | 湿度の高いインキュベーションチャンバーを準備します。 |
| 8 | 4.2-4.4 | 1分 | マイクロニードルをロードします。 |
| 9 | 4.5-4.10 | 10~20分 | G-アクチンの泡サイズを調整し、胚を注入する。 |
| 10 | 4.11 | 30分-1+ h | インキュベート/熱ストレス胚。 |
| 11 | 5.1-5.3 | 1時間前に | 顕微鏡とインキュベーションステージをオンにします。 |
| 12 | 5.4-5.10 | 5分 | イメージング用のカバーリップの間に胚を挟む。 |
| 13 | 5.11-6.6 | 15分-1+ h | 胚中の核内アクチン棒の画像。 |
表 2: トラブルシューティングの提案この表は、プロトコルの正常な完了を支援するためのトラブルシューティングの推奨事項を示しています。
| 潜在的な問題 | 提案 |
| ハエは十分な胚を産まない。 | カップを5日前までに設定します(ステップ1.1~1.3を参照)。産卵を奨励するために実験に至るまで、1日あたり3倍のプレートを交換します。ハエは30分ではなく1時間胚を産ませます。若い大人のハエとカップを設定します。 |
| G-アクチンはマイクロニードルから排出されません。 | マイクロインジェクターの圧力と時間設定を高める。マイクロニードルチップをさらに破ります(ステップ4.5注を参照)。大きな下駄はクリアされないかもしれないので、新しい針をロードします。 |
| 十分に小さいバブルサイズを較正することは困難です。 | 圧力と時間の設定を調整します(ステップ 4.5 を参照)。マイクロニードルチップの開口部が大きすぎる可能性があるため、新しい針をロードします。 |
| 胚は注入の間カバースリップの接着剤から解放する。 | ヘプタン溶液に両面テープを追加して、将来のカバーリップに合わせて「胚接着剤」の一貫性を調整します(ステップ3.5注を参照)。 |
| 胚は温度インキュベーション中に乾燥する。 | スライドがインキュベーションチャンバー内のレベル(ステップ4.11を参照)であり、オイルが外に悪いかもしれないものに触れていないことを確認してください。胚に油の余分な滴を追加します。射出前乾燥時間を短くします(ステップ3.8を参照)。 |
| オイルは、第1および第2のカバーリップの間の胚を完全に覆うわけではない。 | カバーリップ間の小さな隙間にキャピラリー作用を介して余分な油を追加します(ステップ5.8注を参照してください)。 |
| 核内アクチン棒は熱ストレスの胚では見えない。 | より大きな量のG-actinを注入する(ステップ4.5を参照)。射出後インキュベーション(ステップ4.11参照)と撮像チャンバの両方の温度が32°Cであることを確認する(ステップ5.3参照)。 |
| G-アクチンの大きな気泡は、胚の注射部位の周りに見える。 | G-actinの少量を注入する(ステップ4.5を参照)。胚乾燥時間を長くして、胚内部に注入されたアクチンのより良い保持を促進する(ステップ3.8を参照)。 |
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Discussion
この方法の意義は、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27におけるマイクロインジェクションの確立されたプロトコルを利用して、ASRおよび付随するアクチンロッドアセンブリに関する新しい研究を可能にすることです。生きた胚にG-アクチンレッドを注入する主な利点は、ASRが様々な文脈下で研究できることである。将来の研究のために、これらの文脈は、変異型スクリーンの一部として他の遺伝子型の胚を注入するか、酸化ストレス4、32などの異なるストレス状態に注入された胚を暴露することを含むかもしれない。ここでは詳細には説明しませんが、この注射技術は、核酸、他のタンパク質、薬物および指標染料(例えば、21、22、23、24、32)を注射してASRを研究するように修飾することもできる。したがって、この方法は、ASRを誘発するストレスの範囲を同定し、ASR中の細胞応答をさらに特徴付け(例えばミトコンドリア活性の変化)、および核内アクチン棒集合体の基礎となる新しい分子およびメカニズムを明らかにするための多くのアプローチを提示する。
プロトコルのいくつかの重要なステップには次のものが含まれます:ステップ3.8では、胚は正常な注射と最良の胚の健康を確保するために適切に乾燥する必要があります。乾燥時間は、実験室の周囲温度と湿度に依存するので、胚を処理するためのこのパラメータを確立するために、最初に中性pHバッファを用いて取り付け、乾燥、および注入を練習することが推奨されます。ステップ4.5では、マイクロニードルおよび注入設定を微調整して、十分なG-アクチンレッド を胚に注入できるようにする必要があります。あまりにも少ないG-アクチンレッド が胚に注入されると、アクチンロッドの形成が遊離アクチン1の濃度に依存するため、アクチンロッドが容易に可視化されない場合がある。また、蛍光強度がバックグラウンド蛍光を克服するのに十分な高さがないため、十分なG-アクチンレッド 注入がない場合、FRAP実験から一貫した結果を得ることは困難です。したがって、新しい針をロードして使用するたびに、気泡のサイズを調整することが重要です。G-アクチンレッド は粘性があり、マイクロニードルの中で詰まりやすい。時々、これは胚に可変量のG-アクチンを注入することにつながる。マイクロニードルが詰まって高圧でマイクロニードルをクリアできない場合は、マイクロニードルの先端をさらに壊すか、新しいマイクロニードルをロードして新しい胚のセットを注入する必要があるかもしれません。最後に、ステップ4.11では、胚を高温で、かつASRが誘導され、ロッドが1を形成するのに十分な時間の間、インキュベートされなければならない。すべてのインキュベーターの温度は常に監視されるべきであり、インキュベーターからインキュベーターに胚を移す時間は限られており、タイマーはすべてのインキュベーションに使用されるべきです。その他の考えられる問題は、トラブルシューティングのヒントとともに 表 2 に示されています。
このプロトコルの1つの大きな制限は、注射、インキュベーションおよびイメージング中に胚の健康を維持するために例外的な注意を払わなければならないということです。このプロトコルは、胚の健康を最大化するように設計されており、重要な実践により、研究者は胚の発達が温度31あたり期待される速度で進行してプロトコルのすべてのステップを完了することができる。プロトコルの第2の制限は、かなり高価であり、すべてのフライラボのための一般的な機器ではないマイクロインジェクションリグの必要性です。しかし、隣接する実験室が他の胚(例えば、ゼノプス、ゼブラフィッシュ、およびカエノハブディティス・エレガンス)または付着細胞を注入するために装備されている場合、使用される注射リグはショウジョウバエ注射に適している可能性が高い。その場合、ピペットクックブック29のガイドラインに従って、ショウジョウバエ胚に針の形状のみを適合する必要があります。あるいは、市場に安価なミコインジェクターオプション(例えば、アナログマイクロインジェクター)があり、注入リグを組み立てるコストを大幅に削減することができます。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
著者らは、ソカック研究所でこの技術のパイオニアを助けたリリウ・ジェンとゼングイ・シューと、分析を支援したハサン・シーデの作品を感謝して認めている。この研究のための仕事はNIHからの助成金によって資金を提供される(R01 GM115111)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
