Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Mätning efter stroke cerebral ödem, infarkt zon och blod -hjärnbarriär nedbrytning i en enda uppsättning gnagare hjärnprover

doi: 10.3791/61309 Published: October 23, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver en ny teknik för att mäta de tre viktigaste parametrarna för skandinavisk hjärnskada på samma uppsättning gnagare hjärnprover. Att bara använda ett hjärnprov är mycket fördelaktigt när det gäller etiska och ekonomiska kostnader.

Abstract

En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är ischemisk stroke. Historiskt sett innebär en djurmodell som används för att stimulera ischemisk stroke mellersta cerebral arteriell ocklusion (MCAO). Infarktzon, hjärnödem och blod- hjärnbarriärnedbrytning (BBB) mäts som parametrar som återspeglar omfattningen av hjärnskada efter MCAO. En betydande begränsning av denna metod är att dessa mätningar normalt erhålls i olika råtthjärnprover, vilket leder till etiska och ekonomiska bördor på grund av det stora antalet råttor som behöver avlivas för en lämplig provstorlek. Här presenterar vi en metod för att noggrant bedöma hjärnskada efter MCAO genom att mäta infarkt zon, hjärnan ödem och BBB permeabilitet i samma uppsättning råtta hjärnor. Denna nya teknik ger ett effektivare sätt att utvärdera strokens patofysiologi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet över hela världen är stroke. Globalt representerar ischemisk stroke 68% av alla strokefall, medan ischemisk stroke i USA står för 87% avstrokefallen 1,2. Det uppskattas att den ekonomiska bördan av stroke uppgår till 34 miljarder dollar i Förenta staterna2 och 45 miljarder euro i Europeiska unionen3. Djurmodeller av stroke är nödvändiga för att studera dess patofysiologi, utveckla nya metoder för utvärdering och föreslå nya terapeutiska alternativ4.

Ischemisk stroke uppstår med ocklusion av en större cerebral artär, vanligtvis den mellersta cerebrala artären eller en av dess grenar5. Således har modeller av ischemisk stroke historiskt involverat mellersta cerebrala gatan ocklusion (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Efter MCAO, neurologisk skada bedöms oftast genom mätning av infarktzon (IZ) med hjälp av en 2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid (TTC) färgningsmetod13, hjärnödem (BE) med torr eller beräkna halvklotformade volymer14,15,16, och blod hjärnbarriär (BBB) permeabilitet genom en spektroskopi teknik med Evans blå färgning17,18,19.

Den traditionella MCAO-metoden använder separata uppsättningar hjärnor för var och en av de tre hjärnmätningarna. För en stor urvalsstorlek resulterar detta i ett betydande antal avlivade djur, med ytterligare etiska och ekonomiska överväganden. En alternativ metod för att lindra dessa kostnader skulle innebära mätningar av alla tre parametrarna i en enda uppsättning efter MCAO gnagare hjärnor.

Tidigare försök har gjorts att mäta kombinationer av parametrar i samma hjärnprov. Samtidiga immunofluorescerandefärgningsmetoder 20 samt andra molekylära och biokemiska analyser21 har beskrivits efter TTC färgning i samma hjärnan prov. Vi har tidigare beräknat hjärnhalvvolymer för att bedöma hjärnan ödem och utfört TTC färgning för att beräkna infarkt zon i samma hjärna set15.

I det nuvarande protokollet presenterar vi en modifierad MCAO-teknik som mäter ischemisk hjärnskada genom att bestämma IZ, BE och BBB permeabilitet i samma uppsättning gnagare hjärnor. IZ mäts med TTC-färgning, BE bestäms genom beräkning av halvklotferisk volym och BBB permeabilitet erhålls med spektrometrimetoder19. I detta protokoll använde vi en modifierad MCAO-modell, baserad på direkt insättning och fixering av monofilamentkatetern i den inre halspulsådern (ICA) och ytterligare blockering av blodflödet till den mellersta cerebrala artären (MCA)22. Denna modifierade metod visar en minskad dödlighet och sjuklighet jämfört med den traditionella MCAO-metoden16,22.

Detta nya tillvägagångssätt ger en ekonomiskt sund och etisk modell för att mäta neurologiska skador efter MCAO. Denna bedömning av de viktigaste parametrarna för skandinaviska hjärnan skada kommer att bidra till att grundligt undersöka dess patofysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Följande förfaranden genomfördes i enlighet med rekommendationerna i Helsingfors och Tokyoförklaringen och riktlinjerna för användning av försöksdjur från Europeiska gemenskapen. Experimenten godkändes också av djurvårdskommittén vid Ben-Gurion University of the Negev.

1. Förbereda råttor för försöksförfarandet

  1. Välj vuxna manliga Sprague-Dawley råttor utan overt patologi, var och en väger mellan 300 och 350 g.
  2. Håll alla råttor i rumstemperatur vid 22 °C, med 12 timmars ljus och mörka cykler före experiment.
  3. Se till att mat och vatten finns tillgängliga ad libitum.
  4. Utför alla procedurer mellan 06:00 .m. och 14:00.m.

2. Förbereda råttor för operation

  1. Söv råttorna i 30 minuter med isofluran (4% för induktion och 2% för underhåll) och 24% syre (1,5 L/min).
    1. Testa anestesinivån hos råttorna genom att se till att de inte har en pedaluttagsreflex.
  2. Sätt in 24-gauge katetern i svans venen.
    OBS: Svansuppvärmning för vasodilatation utförs inte.
    1. Placera råttorna på bordet i en supin position. Använd medicinsk tejp för att fästa alla fyra råttornas lemmar.
  3. Placera sonden för temperaturmätning i råttretumet före operationen.
  4. Under proceduren, behåll en värmeplatta för att stödja en 37 °C kärnkroppstemperatur.
  5. Tillsätt salva i båda råttans ögon för skydd.
  6. Raka operationsområdet och desinficera med tre tillämpningar av 10% povidone-jod följt av 70% isopropylalkohol.

3. Höger sida mellersta cerebrala gatan ocklusion

OBS: MCAO utförs med en modifierad teknik, som tidigarebeskrivits 16,22,23, med användning av instrument som beskrivs av McGarry et al.24 och Uluç et al.25.

  1. Dissekera huden och ytlig fascia vid den ventrala mittlinjen i nacken med kirurgiska pincett och sax med böjda blad.
  2. Identifiera muskeltriangeln, bestående av ICA, extern halspulsåder (ECA) och vanlig halsartär (CCA).
  3. Separera försiktigt rätt CCA och ICA från vagusnerven med mikroforceps för kärlkirurgi.
  4. Avslöja rätt CCA och ICA. Blockera blodflödet som kommer från CCA till ICA med antingen mikroklämmor eller speciella tourniquets för kärlkirurgi. Gör ett snitt (ca 1 mm) på ICA med hjälp av mikroscissorer för kärlkirurgi.
  5. För in en monofilamentkateter (4-0 nylon) direkt genom ICA, ca 18,5-19 mm från den högra CCA:s bifurcationspunkt i Willis cirkel tills den når ett milt motstånd, för att ocklusera MCA26.
  6. Ligate runt OM ICAEN ovanför bifurcationen av CCA.
  7. För den skenstyrda kontrollgruppen, utför en insättning av nylontråd istället för steg 3.5 och 3.616,22.
  8. Administrera 5 ml 0, 9% natriumklorid genom intraperitoneal injektion.
  9. Stäng såret med sutur och ta råttan till ett återhämtningsområde.
    OBS: Några minuter efter anestesins vaknar råttan och rör sig självständigt runt buret.
  10. Vid 23 h efter MCAO, injicera 2% Evans blå i saltlösning (4 ml/kg)23,26 i svans venen för båda drivna grupper via en kanyl27.
    OBS: Detta används som en blod-hjärnan permeabilitet spårämne. Låt cirkulera i 60 minuter.

4. Bestämning av infarktzon

  1. Mät IZ vid 24 h efter MCAO enligt beskrivningentidigare 9,15,18,19,26.
    OBS: Råttor som förlorat mer än 20% av sin vikt eller utvecklade anfall eller hemiplegi är uteslutna från experimentet.
  2. Avliva råttan genom att ersätta den inspirerade gasblandningen med 20% syre och 80% koldioxid tills råttan upphör att andas spontant.
  3. Öppna bröstet med ett 5-6 cm lateralt snitt genom bukväggen under bröstkorgen med sax och kirurgiska tång.
  4. Utför ett diafragmatiskt snitt längs hela revbensburens längd med sax och kirurgiska tång.
  5. Försiktigt förskjuta lungorna, skär genom revbensburen upp till nyckelbenet på höger och vänster sida28.
  6. Granska med 200 ml normal saltlösning genom hjärtats vänstra ventrikel.
  7. Punktera eller inkubera hjärtats högra atrium med sax.
  8. Utför halshuggning med en giljotin och samla hjärnvävnad.
  9. Använd irissax, skär från foramen magnum till den distala kanten av den bakre skallytan på båda sidor.
  10. Separera luktlökarna, nervösa anslutningar längs den ventrala ytan och den dorsala ytan av skallen från hjärnan.
  11. Ta bort hjärnan från huvudet.
  12. Producera 6 hjärnskivor genom att skapa 2 mm tjocka horisontella sektioner med ett .009" rostfritt stål, obestruket rakblad med en kant.
  13. Inkubera i 30 min vid 37 °C i 0,05% TTC.
  14. Placera hjärnvävnaden på mikroskopbilderna och utför optisk skanning av dessa 6 hjärnskivor med en upplösning på 1600x1600 dpi (se tillägg 1 till exempel).
  15. Lägg till ett blått filter med en fotoredigerare (t.ex. Adobe Photoshop CS2) med hjälp av funktionen Kanalblandare (Bild > Justeringar > Kanalblandare) och spara bilden som ett JPEG-filformat.
    OBS: När du har applicerat det blå filtret visas bilden gråskala.
  16. Öppna den sparade bilden i BildJ 1.37v29,30.
    Obs: Det här datorprogrammet använder en tröskelfunktion för att isolera och beräkna pixlarna som antingen är svarta eller vita (se figur 1).
  17. För var och en av bildens 6 hjärnskivor väljer och sparar du varje halvklot (höger skadad ensidig och vänster oskadd kontralateral) som en separat bildfil med hjälp av verktyget "polygonval" på huvudmenyn.
  18. Ställ in brytpunkt för att bestämma IZ med hjälp av en automatisk tröskelfunktion från huvudmenyn i ImageJ-programvaran genom att välja Bild > Justera > Tröskelvärdeoch mäta antalet pixlar på varje halvklot i en enda hjärnuppsättning.
    Makron kan användas för det här steget i ImageJ-programvaran (se tillägg 2 för koden). Avskärningen är en kritisk parameter för att bestämma vilka pixlar som ska konverteras till vitt och vilka som ska konverteras till svart beroende på grå nyans (se tillägg 3 och tillägg 4 som exempel). ImageJ jämför sedan vita och svarta pixlar för att bestämma IZ. Baserat på färgningsprotokollet och skannerinställningarna använde vi ett konstant brytvärde på 0,220.
  19. Utför mätning av IZ-korrigering för vävnadssvullnad med hjälp av förhållandet mellan ipsilateral och kontralateral cerebrala halvklot (RICH)metod 13,23 (se exempel i tillägg 5).
    Equation 1
    OBS: Infarktstorleken bedöms som en procentandel av kontralaterala halvklotet.

5. Bestämning av hjärnans ödem31

OBS: Använd ImageJ 1.37v för mätning av BE32,33.

  1. Mät BE 24 h efter MCAO. För beräkning av BE, använd data från vänster och höger halvklotvolym (i enheter).
  2. Utför optisk skanning med en upplösning på 1600x1600 dpi (se tillägg 1 till exempel).
  3. Välj hjärnhalvor och ställ in cut-off för bestämning med ImageJ 1.37v, enligt beskrivningen ovan i avsnitten 4.17-4.19.
  4. Uttryck BE-området i procent av standardområdena på det opåverkade kontralaterala halvklotet, beräknat med RICH-metoden med följande ekvation (se exempel i tillägg 5)23,34.
    Equation 2
    OBS: Omfattningen av BE bedöms som en procentandel av kontralateral halvklotet.

6. Bestämning av BBB-störningar

  1. Mät BBB-störningar 24 timmar efter MCAO.
  2. Dela upp höger och vänster halvklot i sex skivor och lägg var och en i ett mikrocentrifugrör.
  3. Homogenisera varje skiva av hjärnvävnaden i triklorättiksyra, baserat på beräkningen av 1 g hjärnvävnad i 4 ml 50% triklorättiksyra.
  4. Centrifugera vid 10 000 x g i 20 min.
  5. Späd supernatantvätska 1:3 med 96% etanol.
  6. Utför luminescence spektrofotometri genom att använda spektrofotometri programvara, installera plattan och utföra ett prov avläsning med hjälp av följande parametrar: Fluorescens intensitet excitation våglängd på 620 nm (bandbredd 10 nm) och en emissionsvåglängd på 680 nm (bandbredd 10 nm)23,35; Mod topp; Nummer Kött 25; Handbok 100; Skakar 1 sekund, 1 mm.
    OBS: Använd en excitationsvåglängd på 620 nm (bandbredd 10 nm) och en utsläppsvåglängd på 680 nm (bandbredd 10 nm). 23,35

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mätning av infarktzoner

Ett oberoende t-test visade att 19 råttor som genomgick permanent MCAO visade en signifikant ökning av hjärnans infarktvolym jämfört med de 16 sham-operated råttorna (MCAO= 7,49% ± 3,57 jämfört med Sham = 0,31 % ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (se figur 2A)). Uppgifterna uttrycks som en genomsnittlig procentandel av den kontralaterala ± SD.

Mätning av hjärnödem

Ett oberoende t-test visade att 19 råttor som genomgick permanent MCAO visade signifikant ökning av omfattningen av hjärnans ödem efter 24 timmar jämfört med de 16 skenopererade råttorna (MCAO=12,31% ± 8, 6 jämfört med. Sham = 0,64% ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (se figur 2B)). Uppgifterna uttrycks som en genomsnittlig procentandel av den kontralaterala ± SD.

Blodhjärnbarriär permeabilitet

Ett oberoende t-test visade att 19 råttor som genomgick permanent MCAO visade signifikant ökning av omfattningen av BBB-nedbrytningen efter 24 timmar jämfört med de 16 skenstyrda råttorna (MCAO=2235 ng/g ± 1101 jämfört med. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18,05) = 8,47 p < 0,01, d = 2,7 (se figur 2C)). Data mäts i ng/g av hjärnvävnad och presenteras som ± SD.

Grupp Tid Förfaranden
Sham opererad (16 råttor) 0 Induktion av MCAO och införande av glödtråd för skenstyrd grupp
MCAO (19 råttor)
Sham opererad (16 råttor) 23h (på 23 timmar) Injektion av Evans blå
MCAO (19 råttor)
Sham opererad (16 råttor) 24h (på 24 timmar) Hjärninsamling för mätningar av IZ-, BE- och BBB-störningar
MCAO (19 råttor)

Tabell 1: Protokollets tidslinje. Vid 23 h efter MCAO injicerades Evans blå lösning. En timme senare (24 h efter MCAO), hjärninsamling utfördes och IZ, BE och BBB permeabilitet mättes i alla grupper.

Figure 1
Figur 1: Representativa hjärnskivor av sham-operated och MCAO råttor.
(A-B) Original skannad bild. (C-D) Omvandling till gråskala. (E-G) Tröskelfunktion. Jagär inte så bra på att setill att det finns en Applicering av ett blått filter. - Jagär inte så bra på dethär. Tröskelfunktion efter blått filterprogram. - Jaghar inte tid med dethär. Använda tröskelfunktion för att bedöma hjärnans ödem. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Histologiska resultat av MCAO-råttor jämfört med skenstyrda råttor.
a)Infarktzon. Infarktzonvolymen hos 19 råttor efter MCAO ökades signifikant jämfört med de 16 skenopererade råttorna 24 timmar efter operationen (*p < 0,01). B)Hjärnödem. Hjärnan ödem volym i 19 råttor efter MCAO ökades avsevärt jämfört med 16 sham-operated råttor 24 h efter kirurgi (* p < 0,01). (C) Blod hjärnbarriär permeabilitet. Blodhjärnbarriären permeabilitet hos 19 råttor efter MCAO ökades signifikant jämfört med de 16 sham-operated råttor 24 h efter kirurgi (*p < 0,01). Värden uttrycktes som en genomsnittlig procentandel av kontralateral halvklotet ± SD och betyder Evans blå extravasation index i ng/g av hjärnvävnad ± SD enligt oberoende-prover t-test. Resultaten ansågs statistiskt signifikanta när p< 0,05, och mycket signifikanta när p < 0,01. Denna siffra har ändrats från Kuts et al.23Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tillägg 1: Exempel skanning av hjärnskivor. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Tillägg 2: Makron som kan användas i ImageJ-programvara för den automatiska tröskelfunktionen och mätning av pixlar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tillägg 3: Exempel på autotröskel. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Tillägg 4: Exempel på uppmätta pixlar på varje halvklot. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Tillägg 5: Provanalys. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Huvudsyftet med detta protokoll var att påvisa konsekventa mätningar av tre huvudparametrar för ischemisk skada: IZ, BE och BBB permeabilitet. Tidigare studier på detta område har visat möjligheten att utföra en eller två av dessa parametrar tillsammans i samma urval. Förutom den kostnadsminskning som denna tredelad metod erbjuder ger den också en mer önskvärd bioetisk modell som begränsar antalet djur som måste opereras och därefter avlivas. Som i alla histologiska tekniker begränsas metoden av oförmågan att observera ischemiska skador dynamiskt.

Fyra datorprogram användes i bildanalysen: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 och IBM SPSS Statistics 22. ImageJ användes för att mäta förlängningen av infarkt zon och hjärnan ödem. Adobe Photoshop användes för att begränsa effekten av Evans blå på hjärnvävnad, eftersom en blå färg indikerar BBB-nedbrytning. Innan du beräknar infarktzonen är det nödvändigt att ta bort den blå färgen från bilden, eftersom färgen inte tillåter exakta mätningar av infarktzonen (se figur 1B, 1D, 1F). Excel och SPSS användes för databehandling.

Tekniken för att bedöma en infarktzon med ImageJ-datorprogramvara är baserad på en jämförelse av svartvita pixlar på en hälsosam halvklot till pixlar på en infarkt halvklot. På det infarkta halvklotet är infarktzonen inte fläckad med TTC; Därför indikeras det av en vit region i figur 1B som mäts. För att programmet korrekt ska kunna beräkna infarktzonen är det nödvändigt att konvertera pixlarna till nyanser av olika intensiteter i grå färger (se figur 1F, 1J). Den blå färgen, som orsakas av Evans blå (se figur 1B),kan påverka bedömningen av infarktzonen (se figur 1F). Därför är det första steget att ta bort den blå färgen med ett blått filter och sedan konvertera bilden till en svartvit bild (se bild 1J). Vi använde Adobe Photoshop, men andra datorprogram kan också användas för detta ändamål, till exempel RawTherapeePortable.

Vi fastställde sedan enhetliga parametrar för beräkning av infarktzonen i alla 6 skivor av en hjärnuppsättning med ImageJ för att standardisera mätproceduren. Detta är nödvändigt eftersom alla 6 segment från varje uppsättning har färgats och skannats under samma förhållanden och kräver en enhetlig brytningsparameter. Avskärningen är en kritisk parameter för att bestämma vilka pixlar som ska konverteras till vitt och vilka som ska konverteras till svart beroende på grå nyans (se figur 1D, 1H). Vi använde tröskelfunktionen från huvudmenyn för detta ändamål. Det sista steget i bildanalysen var beräkningen av infarktzonen och hjärnödem.

Mätningen av infarktzonen kan utföras med olika tekniker, inklusive histologisk färgning eller radiologic tekniker såsom en beräknad tomografi36,positron utsläpp tomografi och magnetisk resonanstomografi23,36. Tidigare studier i labbet har visat bedömning av infarktvolym med färgning med TTC15,26. Denna metod är baserad på en kemisk reaktion mellan TTC och mitokondriellt dehydrogenaser av nervceller. De friska vävnaderna, rika på dehydrogenaser, är färgade med rött med denna färgning. Men i nekrotiska celler uppstår inte denna färgförändring på grund av skador i systemet som deltar i oxidation av organiska föreningar37. I våra tidigare studier visade vi en hög korrelation mellan denna histologiska teknik och resultat från hjärnbildsskanning av detta område23.

Mätningar av cerebralt ödem kan bedömas både in vivo och in vitro. Cerebral ödem resulterar från patologiska förändringar i verksamheten hos natrium- och kalciumjonkanaler och transportörer som leder till en ökning av intracellulärt vatten38,39,40,41. Alternativt kan svullnad uppstå genom BBB-skador som ökar extracellulärt vatten. I tidigare studier fastställdes cerebral ödem baserat på våta och torra tekniker följt av beräkningen av vävnadsvattenhalten43. En fördel med den metod vi presenterar i detta protokoll är dess enkelhet och noggrannhet jämfört med andra befintliga tekniker23,44,45.

Den mest användbara metoden för BBB nedbrytning upptäckt är luminescence spektroskopi efter Evans blå injektion. Mätningen av BBB permeabilitet baseras på injektionen av Evans blå, som binder till albumin. I sin tur är den molekylära massan av albumin 66 kDa och mycket mer signifikant än molekylvikten hos Evans blå 961 Da. Således bestäms mätningen av BBB permeabilitet exakt av den molekylära massan av albumin som tränger igenom den skadade BBB, vilket överför Evans blå. Förutom de tekniker som beskrivs ovan finns det andra tekniker, särskilt de som bygger på en kombination av olika dextrans och radioaktiva molekyler, som tillsammans ger mer exakta resultat. Mätning av BBB-uppdelning efter luminescence spectrometri är billigare och lättare att använda, jämfört med mer exakta men dyrare tekniker. Vi använde denna metod för utvärderingar av BBB störningar tillsammans med mätningar av infarkt zon och hjärnan ödem. Injektion av Evans blå för bedömning av BBB permeabilitet före induktion av MCAO påverkar inte noggrannheten i att mäta dessa två parametrar23.

Det nuvarande protokollet presenterar en ny teknik för att mäta de tre viktigaste bestämningsfaktorerna för skandinavisk hjärnskada på samma hjärnprov. Denna metod kan också tillämpas på modeller av andra hjärnskador. Detta protokoll kommer att bidra till studien av patofysiologi av skandinaviska skada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko och Evgenia Goncharyk vid institutionen för fysiologi, fakulteten för biologi, ekologi och medicin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraina för deras stöd och hjälpsamma bidrag till våra diskussioner. De erhållna uppgifterna ingår i Ruslan Kuts doktorsavhandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22 IBM
Office 365 ProPlus Microsoft - Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. European cardiovascular disease statistics 2017. (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O'Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology - Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. e52675 (2015).
  30. Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018).
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate's blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997).
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan's Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).
Mätning efter stroke cerebral ödem, infarkt zon och blod -hjärnbarriär nedbrytning i en enda uppsättning gnagare hjärnprover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).More

Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter