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Neuroscience

Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61309
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 4, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine, Dnepropetrovsk State University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve uma nova técnica de medição dos três parâmetros mais importantes de lesão cerebral isquêmica no mesmo conjunto de amostras cerebrais de roedores. Usar apenas uma amostra cerebral é altamente vantajoso em termos de custos éticos e econômicos.

Abstract

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC isquêmico. Historicamente, um modelo animal usado para estimular o AVC isquêmico envolve o oclusão da artéria cerebral média (MCAO). A zona infarto, o edema cerebral e a quebra da barreira hematoencefálica (BBB) são medidos como parâmetros que refletem a extensão da lesão cerebral após o MCAO. Uma limitação significativa para este método é que essas medidas são normalmente obtidas em diferentes amostras cerebrais de ratos, levando a encargos éticos e financeiros devido ao grande número de ratos que precisam ser eutanizados para um tamanho amostral adequado. Aqui apresentamos um método para avaliar com precisão a lesão cerebral após mcao medindo zona de infarto, edema cerebral e permeabilidade BBB no mesmo conjunto de cérebros de ratos. Esta nova técnica fornece uma maneira mais eficiente de avaliar a fisiopatologia do AVC.

Introduction

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC. Globalmente, o AVC isquêmico representa 68% de todos os casos de AVC, enquanto nos Estados Unidos o AVC isquêmico é responsável por 87% dos casos de acidente vascular cerebral1,2. Estima-se que o ônus econômico do AVC atinja US$ 34 bilhões nos Estados Unidos2 e € 45 bilhões na União Europeia3. Modelos animais de AVC são necessários para estudar sua fisiopatologia, desenvolver novos métodos de avaliação e propor novas opções terapêuticas4.

O AVC isquêmico ocorre com a oclusão de uma artéria cerebral grave, geralmente a artéria cerebral média ou um de seus ramos5. Assim, os modelos de AVC isquêmico envolveram historicamente a oclusão da artéria cerebral média (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Seguindo MCAO, a lesão neurológica é mais comumente avaliada pela medição da zona de infarto (IZ) usando um método de coloração de cloreto de tripheniltetrazolium (TTC) de 2,3,5, usando o método de coloração13, edema cerebral (BE) usando secagem ou cálculo dos volumes hemisféricos14,15,16e permeabilidade da barreira cerebral sanguínea (BBB) por uma técnica de espectrometria usando a coloração azul evans17,18,19.

O método tradicional de MCAO usa conjuntos separados de cérebros para cada uma das três medidas cerebrais. Para um grande tamanho amostral, isso resulta em um número significativo de animais eutanizados, com considerações éticas e financeiras adicionais. Um método alternativo para aliviar esses custos envolveria medições de todos os três parâmetros em um único conjunto de cérebros de roedores pós-MCAO.

Tentativas anteriores foram feitas para medir combinações de parâmetros na mesma amostra cerebral. Métodos simultâneos de coloração imunofluorescente20, bem como outras análises moleculares e bioquímicas21 foram descritos após a coloração de TTC na mesma amostra cerebral. Calculamos anteriormente os volumes do hemisfério cerebral para avaliar o edema cerebral e realizamos a coloração do TTC para calcular a zona de infarto no mesmo conjunto cerebral15.

No presente protocolo, apresentamos uma técnica modificada de MCAO que mede a lesão cerebral isquêmica através da determinação da permeabilidade de IZ, BE e BBB no mesmo conjunto de cérebros de roedores. O IZ é medido pela coloração TTC, o BE é determinado pelo cálculo do volume hemisférico, e a permeabilidade do BBB é obtida pelos métodos de espectrometria19. Neste protocolo, utilizou-se um modelo MCAO modificado, baseado na inserção direta e fixação do cateter monofilamento na artéria carótida interna (ICA) e posterior bloqueio do fluxo sanguíneo para a artéria cerebral média (MCA)22. Este método modificado mostra uma taxa reduzida de mortalidade e morbidade em comparação com o método tradicional de MCAO16,22.

Esta nova abordagem fornece um modelo financeiro e ético para medir lesões neurológicas após mcao. Essa avaliação dos principais parâmetros da lesão cerebral isquêmica ajudará a investigar de forma abrangente sua fisiopatologia.

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Protocol

Os seguintes procedimentos foram conduzidos de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinque e Tóquio e as Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos também foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.

1. Preparando ratos para o procedimento experimental

  1. Selecione ratos adultos machos Sprague-Dawley sem patologia atolizada, cada um pesando entre 300 e 350 g.
  2. Mantenha todos os ratos à temperatura ambiente a 22 °C, com 12 horas de ciclos claros e escuros antes do experimento.
  3. Certifique-se de que alimentos e água estão disponíveis ad libitum.
  4. Realizar todos os procedimentos entre 6:00.m e 14:00.m.

2. Preparando ratos para cirurgia

  1. Anestesiar os ratos por 30 minutos com isoflurane (4% para indução e 2% para manutenção) e 24% de oxigênio (1,5 L/min).
    1. Teste o nível de anestesia nos ratos, garantindo que eles não tenham um reflexo de retirada do pedal.
  2. Insira o cateter de calibre 24 na veia da cauda.
    NOTA: O aquecimento da cauda para vasodilatação não é realizado.
    1. Coloque os ratos sobre a mesa em uma posição supina. Use fita médica para fixar todos os quatro membros dos ratos.
  3. Coloque a sonda para medir a temperatura no reto do rato antes da cirurgia.
  4. Durante o procedimento, mantenha uma placa de aquecimento para suportar uma temperatura corporal do núcleo de 37 °C.
  5. Adicione pomada em ambos os olhos do rato para proteção.
  6. Raspe a área cirúrgica e desinfete com três aplicações de 10% de povidone-iodo seguido de 70% de álcool isopropílico.

3. Oclusão da artéria cerebral do lado direito

NOTA: A MCAO é realizada por uma técnica modificada, conforme descrito anteriormente16,22,23, com o uso de instrumentos descritos por McGarry et al.24 e Uluç et al.25.

  1. Dissecar a pele e a fáscia superficial na linha média ventral do pescoço com pinças cirúrgicas e tesouras com lâminas curvas.
  2. Identificar o triângulo muscular, composto pelo ICA, artéria carótida externa (ECA) e artéria carótida comum (CCA).
  3. Separe cuidadosamente o CCA direito e o ICA do nervo vago com microforceps para cirurgia vascular.
  4. Exponha a CCA direita e o ICA. Bloqueie o fluxo sanguíneo proveniente da CCA para o ICA usando micro-clipes ou torniquetes especiais para cirurgia vascular. Faça uma incisão (aproximadamente 1 mm) no ICA usando microscisores para cirurgia vascular.
  5. Insira um cateter monofilamento (4-0 nylon) diretamente através do ICA, cerca de 18,5-19 mm do ponto de bifurcação da CCA direita no círculo de Willis até atingir uma leve resistência, para ocluir a MCA26.
  6. Ligate em torno do ICA acima da bifurcação da CCA.
  7. Para o grupo de controle operado por farsa, realize uma inserção de linha de nylon em vez das etapas 3.5 e 3.616,22.
  8. Administre 5 mL de cloreto de sódio de 0,9% por injeção intraperitoneal.
  9. Feche a ferida por sutura e leve o rato para uma área de recuperação.
    NOTA: Alguns minutos após o fim da anestesia, o rato acordará e se moverá independentemente ao redor da gaiola.
  10. Às 23 horas após mcao, injete 2% de Evans azul em soro fisiológico (4 mL/kg)23,26 na veia traseira para ambos os grupos operados através de uma cânula27.
    NOTA: Isto é usado como um rastreador de permeabilidade cérebro-sangue. Deixe circular por 60 minutos.

4. Determinação da zona de infarto

  1. Medida IZ às 24h após MCAO como descrito anteriormente9,15,18,19,26.
    NOTA: Ratos que perderam mais de 20% de seu peso ou desenvolveram convulsões ou hemiplegia são excluídos do experimento.
  2. Eutanize o rato substituindo a mistura de gás inspirada por 20% de oxigênio e 80% de dióxido de carbono até que o rato deixe de respirar espontaneamente.
  3. Abra o peito com uma incisão lateral de 5-6 cm através da parede abdominal sob a caixa torácica usando tesouras e fórceps cirúrgicos.
  4. Realize uma incisão diafragmática ao longo de toda a extensão da caixa torácica com tesoura e fórceps cirúrgicos.
  5. Deslocando cuidadosamente os pulmões, cortando a caixa torácica até a clavícula nos lados direito e esquerdo28.
  6. Perfuse com 200 mL de soro fisiológico normal através do ventrículo esquerdo do coração.
  7. Puna ou incise o átrio direito do coração com uma tesoura.
  8. Realizar decapitação usando uma guilhotina e coletar tecido cerebral.
  9. Usando uma tesoura de íris, cortada do foie magnum até a borda distal da superfície posterior do crânio em ambos os lados.
  10. Separe as lâmpadas olfativas, conexões nervosas ao longo da superfície ventral e superfície dorsal do crânio do cérebro.
  11. Remova o cérebro da cabeça.
  12. Produza 6 fatias cerebrais criando seções horizontais de 2 mm de espessura com uma lâmina de barbear de 0,009", sem revestimento, de borda única.
  13. Incubar por 30 min a 37 °C em 0,05% TTC.
  14. Coloque o tecido cerebral nos slides do microscópio e realize a varredura óptica dessas 6 fatias cerebrais com uma resolução de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1, por exemplo).
  15. Adicione um filtro azul com um editor de fotos (por exemplo, Adobe Photoshop CS2) usando a função Channel Mixer(Image > Adjustments > Channel Mixer) e salve a imagem como um formato de arquivo JPEG.
    NOTA: Após a aplicação do filtro azul, a imagem aparecerá em escala de cinza.
  16. Abra a imagem salva em ImageJ 1.37v29,30.
    NOTA: Este programa de computador usa uma função limiar para isolar e calcular os pixels que são preto ou branco (ver Figura 1).
  17. Para cada uma das 6 fatias cerebrais da imagem, selecione e salve cada hemisfério (ipsilateral direito ferido e contralateral inin ferido) como um arquivo de imagem separado usando a ferramenta "seleção de polígonos" do menu principal.
  18. Defina o limite para determinar o IZ usando uma função de limiar automático do menu principal do software ImageJ selecionando Image > Adjust > Threshold, e meça o número de pixels em cada hemisfério de um único conjunto cerebral.
    NOTA: Macros podem ser usadas para esta etapa no software ImageJ (ver Suplemento 2 para o código). O corte é um parâmetro crítico para determinar quais pixels converter em branco e que se converter em preto dependendo do tom de cinza (ver Suplemento 3 e Suplemento 4 como exemplos). ImageJ então compara pixels brancos e pretos para determinar IZ. Com base no protocolo de coloração e configurações do scanner, usamos um valor de corte constante de 0,220.
  19. Realizar a medição da correção do IZ para inchaço tecidual utilizando as Razões dos Hemisférios Cerebrais Ipsilaterais e Contralateral (RICH) método13,23 (ver exemplo no Suplemento 5).
    Equation 1
    NOTA: O tamanho do infarto é avaliado como uma porcentagem do hemisfério contralateral.

5. Determinação do edema cerebral31

NOTA: Use ImageJ 1.37v para medição de BE32,33.

  1. Meça BE 24 h após MCAO. Para cálculo do BE, utilize os dados do volume do hemisfério esquerdo e direito (em unidades).
  2. Realize a digitalização óptica com uma resolução de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1, por exemplo).
  3. Selecione hemisférios cerebrais e defina o corte para determinar BE com ImageJ 1.37v, conforme descrito acima nas seções 4.17-4.19.
  4. Expresse a área BE como uma porcentagem das áreas padrão do hemisfério contralateral não afetado, calculada pelo método RICH utilizando a equação seguinte (ver exemplo no Suplemento 5)23,34.
    Equation 2
    NOTA: A extensão do BE é avaliada como uma porcentagem do hemisfério contralateral.

6. Determinação do rompimento do BBB

  1. Medir o rompimento do BBB 24 h após MCAO.
  2. Divida os hemisférios direito e esquerdo em seis fatias e coloque cada uma em um tubo de microcentrífuga.
  3. Homogeneize cada fatia do tecido cerebral em ácido tricloroacético, com base no cálculo de 1 g de tecido cerebral em 4 mL de ácido tricloroacético de 50%.
  4. Centrifugar a 10.000 x g por 20 min.
  5. Líquido supernacido diluído 1:3 com 96% de etanol.
  6. Realize a espectrofotometria de luminescência utilizando o software de espectrofotometria, instalando a placa e realizando uma leitura amostral usando os seguintes parâmetros: Comprimento de onda de intensidade de fluorescência de 620 nm (largura de banda 10 nm) e um comprimento de onda de emissão de 680 nm (largura de banda 10 nm)23,35 ; Mod top; Número Carne 25; Manual 100; Tremendo 1 segundo, 1 mm.
    NOTA: Use um comprimento de onda de excitação de 620 nm (largura de banda 10 nm) e um comprimento de onda de emissão de 680 nm (largura de banda 10 nm). 23,35

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Representative Results

Medição da zona de infarto

Um teste t de amostra independente indicou que 19 ratos submetidos a MCAO permanente demonstraram um aumento significativo no volume de infarto cerebral em comparação com os 16 ratos operados por vergonha (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (ver Figura 2A).). Os dados são expressos como uma porcentagem média do hemisfério contralateral ± SD.

Medição do edema cerebral

Um teste t de amostra independente indicou que 19 ratos submetidos a MCAO permanente demonstraram aumento significativo na extensão do edema cerebral após 24 h em comparação com os 16 ratos operados por vergonha (MCAO=12,31% ± 8,6 vs. Sham = 0,64% ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (ver Figura 2B).). Os dados são expressos como uma porcentagem média do hemisfério contralateral ± SD.

Permeabilidade da barreira cerebral sanguínea

Um teste t de amostra independente indicou que 19 ratos submetidos a MCAO permanente demonstraram aumento significativo na extensão da quebra do BBB após 24 h em comparação com os 16 ratos operados por farsa (MCAO=2235 ng/g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18,05) = 8,47 p < 0,01, d = 2,7 (ver Figura 2C).). Os dados são medidos em ng/g de tecido cerebral e apresentados como ± SD médios.

Grupo Hora Procedimentos
Sham operado (16 ratos) 0 Indução de MCAO e inserção de filamento para grupo operado por farsa
MCAO (19 ratos)
Sham operado (16 ratos) 23h Injeção de Evans azul
MCAO (19 ratos)
Sham operado (16 ratos) 24h Coleta cerebral para medições de IZ, BE e BBB rompimento
MCAO (19 ratos)

Tabela 1: Cronograma do protocolo. Às 23 horas depois da MCAO, a solução azul evans foi injetada. Uma hora depois (24 h após mcao), foi realizada coleta cerebral, e a permeabilidade de IZ, BE e BBB foram medidas em todos os grupos.

Figure 1
Figura 1: Fatias cerebrais representativas de ratos operados por farsas e MCAO.
(A-B) Imagem digitalizada original. (C-D) Transformação em escala de cinza. (E-G) Função limiar. (G-H) Aplicação de um filtro azul. (I-J) Função limiar após a aplicação do filtro azul. (K-L) Usando função limiar para avaliar o edema cerebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados histológicos de ratos MCAO comparados com ratos operados por vergonha.
(A) Zona infarto. O volume da zona de infarto em 19 ratos após o MCAO foi significativamente aumentado em comparação com os 16 ratos operados por farsa 24 h após a cirurgia (*p < 0,01). (B)Edema cerebral. O volume de edema cerebral em 19 ratos após o MCAO foi significativamente aumentado em comparação com os 16 ratos operados por farsa 24 h após a cirurgia (*p < 0,01). (C) Permeabilidade da barreira cerebral sanguínea. A permeabilidade da barreira cerebral sanguínea em 19 ratos após o MCAO foi significativamente aumentada em comparação com os 16 ratos operados por vergonha 24 h após a cirurgia (*p < 0,01). Os valores foram expressos como uma porcentagem média do hemisfério contralateral ± SD e o índice médio de extravasação azul evans em ng/g de tecido cerebral ± SD de acordo com amostras independentes t-test. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p< 0,05, e altamente significativos quando p < 0,01. Esta figura foi modificada de Kuts et al.23Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplemento 1: Exemplo de varredura de fatias cerebrais. Clique aqui para baixar este número.

Suplemento 2: Macros que podem ser usadas no software ImageJ para a função de limiar automático e medir pixels. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplemento 3: Exemplo de limiar automático. Clique aqui para baixar este número.

Suplemento 4: Exemplo de pixels medidos em cada hemisfério. Clique aqui para baixar este número.

Suplemento 5: Análise amostral. Clique aqui para baixar este número.

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Discussion

O objetivo principal do presente protocolo foi demonstrar medições consistentes de três parâmetros principais de lesão isquêmica: permeabilidade IZ, BE e BBB. Estudos anteriores neste campo demonstraram a possibilidade de realizar um ou dois desses parâmetros juntos na mesma amostra. Além da redução de custos que este método de três partes oferece, ele também fornece um modelo bioético mais desejável que limita o número de animais que devem ser operados e, posteriormente, eutanizados. Como em todas as técnicas histológicas, o método é limitado pela incapacidade de observar lesões isquêmicas dinamicamente.

Quatro programas de computador foram usados na análise de imagens: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 e IBM SPSS Statistics 22. ImageJ foi usado para medir a extensão da zona de infarto e edema cerebral. O Adobe Photoshop foi usado para limitar o efeito do azul Evans no tecido cerebral, uma vez que uma cor azul indica quebra do BBB. Antes de calcular a zona de infarto, é necessário remover a cor azul da imagem, uma vez que a cor não permite medições precisas da zona de infarto (ver Figura 1B, 1D, 1F). Excel e SPSS foram utilizados para o processamento de dados.

A técnica para avaliar uma zona de infarto com software de computador ImageJ baseia-se em uma comparação de pixels preto e branco em um hemisfério saudável com pixels em um hemisfério infartado. No hemisfério infarto, a zona de infarto não está manchada com TTC; portanto, é indicado por uma região branca na Figura 1B que é medida. Para que o programa calcule corretamente a zona de infarto, é necessário converter os pixels em tons de intensidades variadas de cores cinzas (ver Figura 1F, 1J). A cor azul, causada pelo azul evans (ver Figura 1B),pode afetar a avaliação da zona de infarto (ver Figura 1F). Portanto, o primeiro passo é remover a cor azul usando um filtro azul e, em seguida, converter a imagem em uma imagem em preto e branco (ver Figura 1J). Usamos o Adobe Photoshop, mas outros programas de computador também podem ser usados para este fim, como o RawTherapeePortable.

Em seguida, estabelecemos parâmetros uniformes para calcular a zona de infarto em todas as 6 fatias de um conjunto cerebral usando ImageJ, a fim de padronizar o procedimento de medição. Isso é necessário porque todas as 6 fatias de cada conjunto foram manchadas e escaneadas sob as mesmas condições e requerem um parâmetro de corte unificado. O corte é um parâmetro crítico para determinar quais pixels se converter em branco e que se converter em preto dependendo do tom de cinza (ver Figura 1D, 1H). Usamos a função Limiar do menu principal para este fim. O passo final na análise da imagem foi o cálculo da zona de infarto e edema cerebral.

A medição da zona de infarto pode ser realizada por diversas técnicas, incluindo coloração histológica ou técnicas radiológicas, como um tomógrafo computado36,tomografia de emissão de pósitrons e ressonância magnética23,36. Estudos anteriores em laboratório demonstraram a avaliação do volume de infarto utilizando manchas com TTC15,26. Este método é baseado em uma reação química entre TTC e desidrogenases mitocondriais de neurônios. Os tecidos saudáveis, ricos em desidrogenases, são coloridos com vermelho com essa coloração. No entanto, nas células necróticas, essa mudança de cor não ocorre devido a danos no sistema que participa da oxidação dos compostos orgânicos37. Em nossos estudos anteriores, demonstramos uma alta correlação entre essa técnica histológica e os resultados da varredura de imagem cerebral desta área23.

As medidas de edema cerebral podem ser avaliadas tanto in vivo quanto in vitro. O edema cerebral resulta de alterações patológicas nas atividades dos canais de íons de sódio e cálcio e transportadores que levam ao aumento da água intracelular38,39,40,41. Alternativamente, o inchaço pode ocorrer por danos no BBB que aumentam a água extracelular. 42 Em estudos anteriores, o edema cerebral foi determinado com base em técnicas úmidas e secas, seguido pelo cálculo do teor de água tecidual43. Uma vantagem do método que apresentamos neste protocolo é sua simplicidade e precisão comparando com outras técnicas existentes23,44,45.

O método mais útil para detecção de quebra de BBB é a espectroscopia de luminescência após a injeção azul de Evans. A medição da permeabilidade do BBB é baseada na injeção de Evans blue, que se liga à albumina. Por sua vez, a massa molecular de albumina é de 66 kDa e muito mais significativa do que o peso molecular de Evans azul 961 Da. Assim, a medição da permeabilidade do BBB é determinada precisamente pela massa molecular de albumina que penetra através do BBB danificado, transferindo assim o azul Evans. Além das técnicas descritas acima, existem outras técnicas, em especial aquelas baseadas em uma combinação de várias moléculas dextrans e radioativas, que juntas dão resultados mais precisos. A medição da quebra do BBB por espectrometria de luminescência é mais barata e fácil de usar, em comparação com técnicas mais precisas, mas mais caras. Utilizou-se este método para as avaliações de interrupção do BBB juntamente com medidas de zona de infarto e edema cerebral. A injeção de Evans azul para avaliação da permeabilidade bbb antes da indução de MCAO não afeta a precisão de medir esses dois parâmetros23.

O presente protocolo apresenta uma nova técnica para medir os três determinantes mais importantes da lesão cerebral isquêmica na mesma amostra cerebral. Este método também pode ser aplicado a modelos de outras lesões cerebrais. Este protocolo contribuirá para o estudo da fisiopatologia da lesão isquêmica.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko e Evgenia Goncharyk do Departamento de Fisiologia, Faculdade de Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ucrânia por seu apoio e contribuições úteis às nossas discussões. Os dados obtidos fazem parte da tese de doutorado de Ruslan Kuts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22 IBM
Office 365 ProPlus Microsoft - Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurociência Questão 164 Ruptura da barreira cerebral de sangue (BBB) edema cerebral zona infarto derrame isquêmico oclusão da artéria cerebral média (MCAO) modelo de rato
Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores
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Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

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