Summary
Het doel van dit protocol is om de assemblage van een biomimetische nanomatrix (NM) met Janus basis nanobuisjes (JBNT's) en fibronectine (FN) te tonen. Wanneer ze worden gekweekt met menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs), vertonen de NMs uitstekende bioactiviteit bij het aanmoedigen van hMSCs-adhesie.
Abstract
Een biomimetische NM werd ontwikkeld om te dienen als een weefsel-engineering biologische steiger, die stamcelverankering kan verbeteren. De biomimetische NM wordt gevormd uit JBNT's en FN door zelfassemblage in een waterige oplossing. JBNT's meten 200-300 μm lang met binnenste hydrofobe holle kanalen en buitenste hydrofiele oppervlakken. JBNT's worden positief geladen en FN's worden negatief geladen. Daarom worden ze, wanneer ze in een neutrale waterige oplossing worden geïnjecteerd, aan elkaar gebonden via niet-covalente binding om de NM-bundels te vormen. Het zelfassemblageproces is binnen enkele seconden voltooid zonder chemische initiators, warmtebron of UV-licht. Wanneer de pH van de NM-oplossing lager is dan het iso-elektrische punt van FN's (pI 5,5-6,0), zullen de NM-bundels zichzelf vrijgeven vanwege de aanwezigheid van positief geladen FN.
NM staat erom bekend de extracellulaire matrix (ECM) morfologisch na te bootsen en kan daarom worden gebruikt als een injecteerbare steiger, die een uitstekend platform biedt om de hMSC-hechting te verbeteren. Celdichtheidsanalyse en fluorescentiebeeldvormingsexperimenten wezen erop dat de NMs de verankering van hMS's aanzienlijk verhoogden in vergelijking met de negatieve controle.
Introduction
Menselijke mesenchymale stamcellen (hMC's) hebben het potentieel voor zelfvernieuwing en zelfdifferentiatie langs verschillende mesenchymale afstammingen aangetoond, wat helpt bij de regeneratie en het onderhoud van weefsels1. Op basis van het differentiatiepotentieel worden hMC's beschouwd als kandidaten voor mesenchymale weefselletsels en hematopoietische stoornistherapie2. hMC's hebben het vermogen aangetoond om wondgenezing te bevorderen door weefselherstel, angiogenese en ontsteking te verminderen3. Zonder hulp van biochemische of biomaterialen is de efficiëntie voor de hMC's om een doelweefsel te bereiken en op de gewenste locatie te functioneren echter laag4. Hoewel verschillende ontworpen steigers zijn gebruikt om hMC's aan te trekken om zich aan de laesies te hechten, zijn sommige plaatsen zoals groeiplaatbreuk, in het midden van een lang bot, niet gemakkelijk toegankelijk door de conventionele voorgefabriceerde steigers, die mogelijk niet perfect passen in een onregelmatig gevormde gewonde plaats.
Hier hebben we een biomimetisch nanomateriaal ontwikkeld dat zichzelf in situ kan assembleren en kan worden geïnjecteerd in een moeilijk te bereiken doelgebied. De injecteerbare biosteiger NM bestaat uit Janus base nanotubes (JBNTs) en fibronectine (FN). JBNT's, ook bekend als de Rosette Nanotubes (RNT's), zijn afgeleid van DNA-basisparen, met name thymine en adenine, hier5,6,7. Zoals te zien is in figuur 1, worden de nanobuisjes gevormd wanneer zes moleculen van de afgeleide DNA-basisparen zichzelf assembleren via waterstofbindingen om een vlak te vormen6. Zes moleculen worden vervolgens op elkaar gestapeld in een vlak via een sterke pi-stapelinteractie7, die tot 200-300 μm lang kan zijn. De JBNT's zijn ontworpen om collageenvezels morfologisch na te bootsen, zodat FN ermee zal reageren.
FN is een lijmglycoproteïne met een hoog molecuulgewicht, dat te vinden is in de extracellulaire matrix (ECM)9. Deze kunnen de aanhechting van stamcellen aan andere componenten van het ECM bemiddelen, met name collageen10. We hebben JBNT's ontworpen om collageenvezels morfologisch na te bootsen, zodat FN ermee kan reageren om NM in een paar seconden te vormen via niet-covalente binding. Daarom is NM een veelbelovende biosteiger die in een botbreukplaats wordt geïnjecteerd die niet toegankelijk is voor de conventioneel vervaardigde steigers. Hier biedt de injecteerbare NM een uitstekend vermogen om hMSC-verankering in vitro te verbeteren, waarbij ze hun potentieel vertonen om te dienen als een steiger voor weefselregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van JBNT's
OPMERKING: JBNT monomeer werd bereid zoals eerder gepubliceerd11.
- Synthese van verbinding A1
- Bereid een oplossing met 8,50 g 2-cyanoazijnzuur en 9,80 g ethylcarbamaat in 25 ml tolueen en 2,5 ml N, N-dimethylformamide. Voeg 4,90 ml fosforylchloride dropwise toe. Verwarm het mengsel vervolgens tot 70 °C en blijf 1,5 uur roeren.
- Koel het reactiemengsel af op kamertemperatuur en giet er 100 g ijswater in. Haal de waterige laag eruit met ethylacetaat (3 x 250 ml) en was met 100 ml pekel. Droog de organische laag over watervrij natriumsulfaat, filter en verdamp vluchtige stoffen onder vacuüm om een lichtgele vaste stof te krijgen.
- Onderwerp de gele vaste stof aan silicagelflitskolomchromatografie (3% methanol/dichloormethaan) om 15,61 g verbinding A1 als wit poeder op te leveren.
- Synthese van verbinding A2
- Meng 3,12 g verbinding A1 en 2,75 g kaliumcarbonaat in 50 ml N, N-dimethylformamide. Roer op kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Voeg 2,6 ml koolstofdisulfide toe aan de reactiesuspensie. Blijf 4 uur roeren.
- Voeg absolute ethanol toe aan het reactiemengsel bij 0 °C. Filtreer het gele neerslag en was met diethylether. Droog 's nachts onder vacuüm tot 6,18 g verbinding A2 als lichtgele vaste stof.
- Synthese van verbinding A3
- Voeg 2,7 ml methylbodide toe in 15 ml acetonitril. Bereid ook afzonderlijk een oplossing van verbinding A2 door 6,18 g A2 tot 80 ml water/acetonitril (verhouding 7:3) toe te voegen. Meng beide oplossingen en roer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
- Verwarm het reactiemengsel tot 95 °C en blijf 3 uur roeren.
- Koel het reactiemengsel af op kamertemperatuur en verdampt vervolgens de vluchtige stoffen onder vacuüm.
- Haal het residu 3x uit met 100 ml ethylacetaat en was met pekel. Droog de organische laag over watervrij natriumsulfaat, filter en verdamp de vluchtige stoffen onder vacuüm om een gele vaste stof te verkrijgen.
- Onderwerp de gele vaste stof aan silicagelflitskolomchromatografie (30% ethylacetaat/hexanen) om 4,52 g van de verbinding A3 op te leveren als lichtgele vaste stof.
- Synthese van verbinding A4
- Bereid allylamineoplossing door 925 μL allylamine toe te voegen aan 20 ml ethanol. Voeg deze oplossing dropwise toe aan de oplossing van verbinding A3, bereid door 3,14 g A3 toe te voegen in 75 ml absolute ethanol, gedurende 30 minuten. Verwarm vervolgens het reactiemengsel tot reflux gedurende 16 uur.
- Koel het reactiemengsel af op kamertemperatuur en verdampt de vluchtige stoffen om een gele vaste stof te geven.
- Onderwerp de gele vaste stof aan silicagelflitskolomchromatografie (50% ethylacetaat/hexanen aan 2% methanol/dichloormethaan) om 1,80 g verbinding A4 als wit kristal op te leveren.
- Synthese van verbinding A5
- Voeg 2,05 g guanidiniumhydrochloride en 7,8 ml natriumethoxide (21 wt% ethanol) toe in 14 ml absolute ethanol. Verwarm het mengsel gedurende 15 minuten tot 45 °C.
- Filtreer het onoplosbare materiaal en voeg het filtraat rechtstreeks toe aan de oplossing van verbinding A4, bereid door 2,70 g A4 toe te voegen in 40 ml absolute ethanol. Verwarm het reactiemengsel tot reflux gedurende 16 uur.
- Filter het neerslag eruit om 2,65 g verbinding A5 te verkrijgen als een niet-witte vaste stof.
- Synthese van verbinding A6
- Voeg langzaam 24,9 ml triethylamine toe aan het drijfmestmengsel dat wordt verkregen door 2,11 g verbinding A5 en 1,10 g 4-Dimethylaminopyridine toe te voegen in 120 ml tetrahydrofuran gedurende 1 minuut. Roer 2 minuten op kamertemperatuur.
- Voeg 20,7 ml di-tert-butyldicarbonaat dropwise toe aan het reactiemengsel en blijf 40 uur roeren bij kamertemperatuur.
- Voeg 20 ml water toe om de reactie te doven. Verdampt de vluchtige stoffen onder vacuüm.
- Haal het rode stroperige residu eruit met 500 ml ethylacetaat. Was het vervolgens in met 250 ml water, 75 ml citroenzuur, 2x met 200 ml water, 200 ml verzadigd natriumbicarbonaat en 200 ml pekel. Droog de organische laag over watervrij natriumsulfaat, filter en verdamp de vluchtige stoffen onder vacuüm om een rood/oranje vaste stof te geven.
- Onderwerp de vaste stof aan silicagelflitskolomchromatografie (0-20% ethylacetaat/hexanen) om 3,87 g verbinding A6 als wit schuim op te leveren.
- Synthese van verbinding A7
- Voeg N-methylmorfoline N-oxide (50 wt.% in water, 1,64 ml) dropwise toe aan de oplossing van verbinding A6 (2,93 g) in aceton/water (8:1, 58,5 ml) en roer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
- Voeg osmiumtetraoxide (4% waterige oplossing) dropwise toe aan het mengsel gedurende een periode van 3 minuten en blijf 24 uur roeren op kamertemperatuur.
- Blus de reactie met 1,0 M waterig natriumsulfiet totdat de oplossing kleurloos wordt. Verwijder de vluchtige stoffen onder vacuüm om te resulteren in een witte drijfmest in water. Verwijder het residu met 350 ml dichloormethaan en was het vervolgens met 150 ml water, gevolgd door een wasbeurt met 150 ml pekel.
- Droog de organische laag over watervrij natriumsulfaat, filter en verdamp de vluchtige stoffen onder vacuüm om 2,45 g verbinding A7 als witte vaste stof op te leveren.
- Synthese van verbinding A8
- Voeg 760 g natriumdivalide toe aan het mengsel van 1,36 g verbinding A7 in 35 ml dichloormethaan/water (6:1, 35 ml) en roer gedurende 42 uur op kamertemperatuur.
- Filter het onoplosbare materiaal eraf en concentreer het filtraat onder vacuüm. Verwijder het resulterende residu met 250 ml dichloormethaan en was het vervolgens met 100 ml water en 100 ml pekel. Droog de organische laag over watervrij natriumsulfaat, filter en verdamp de vluchtige stoffen onder vacuüm om het ruwe product te geven.
- Onderwerp het ruwe product aan silicagelflitskolomchromatografie (5-40% ethylacetaat/hexanen, vervolgens 5% methanol/dichloormethaan) om 1,08 g verbinding A8 op te leveren.
- Synthese van verbinding A9
- Bereid een oplossing van 830 mg verbinding A8 in 15 ml 1,2-dichloorethaan. Voeg de oplossing van dropwise toe aan het mengsel van 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-hexanoic acid trimethylsilyl ethylester (649,5 mg) en N,N-diisopropylethylamine (591 μL) in 24 ml 1,2-dichloorethaan gedurende 3 minuten en roer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
- Voeg 360,3 mg natriumtriacetoxyborohydride toe aan de oplossing en blijf 24 uur roeren op kamertemperatuur.
- Blus het reactiemengsel met 6 ml water. Haal het reactiemengsel 3x uit met 200 ml dichloormethaan en was met 200 ml citroenzuur in water, 2x met 200 ml water, 200 ml verzadigd natriumbicarbonaat en 200 ml pekel in die volgorde. Droog de organische laag over watervrij natriumsulfaat, filter en verdamp de vluchtige stoffen onder vacuüm om het ruwe product te verkrijgen.
- Onderwerp het ruwe product aan silicagelflitskolomchromatografie (5-30% ethylacetaat/hexanen) om 885 mg verbinding A9 op te leveren.
- Synthese van JBNT monomeer
- Los 0,54 g verbinding A9 (0,54 g) op in 10 ml van 94% trifluoracetische zuur/thioanisole-oplossing en roer gedurende 72 uur op kamertemperatuur.
- Voeg diethylether (80 ml) toe aan het reactiemengsel en centrifugeer het neerslag naar beneden. Giet het heldere trifluoracetinezuur met supernatant eruit en was het witte neerslag met diethylether en methanol om 168,6 mg ruw JBNT-monomeer op te leveren(aanvullend bestand 1).
- Zuiver het ruwe JBNT-monomeer door een krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) met een omgekeerde fasekolom. Het isolatieprogramma staat hieronder vermeld: Oplosmiddel A: 100% water; oplosmiddel B: 100% acetonitril; oplosmiddel C: pH=1 HCl wateroplossing; debiet: 3 ml/min (zie tabel 1).
- Verzamel de grootste piek op ongeveer 7,2 min.
2. Fabricage voor JBNT/FN
- Voeg 80 μL van 1 mg/ml JBNT waterige oplossing toe aan 40 μL van 1 mg/ml FN waterige oplossing en pipet meerdere keren.
- Controleer op de aanwezigheid van witte vaste ophanging na pipetten gedurende ongeveer 10 s.
OPMERKING: Er is een video opgenomen om het zelfassemblageproces van NM vast te leggen (Supplemental File 2).
3. Observatie van gelyophiliseerde specimens
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om de steigerstructuur van NM gemaakt van JBNT's en FN weer te geven.
- Bereid FN-, JBNT- en FN/JBNT NM-oplossingen voor voor lyophilized materiaalobservatie. Verdun 10 μL van 100 μg/ml FN met 40 μL gedestilleerd water om een 20 μg/ml-oplossing van FN te maken.
- Bereid 100 mg/ml oplossing van JBNT's door 5 μL van 1 mg/ml JBNT's te verdunnen in 45 μL DI-water.
- Meng 10 μL van 100 μg/ml FN en 5 μL JBNT's van 1 mg/ml JBNT's in 35 μL DI-water om de NM-oplossing te vormen.
- Bedek drie putten van 96-goed heldere ronde bodemmicroplaten met respectievelijk de FN-, JBNT-oplossing en NM-oplossing. Elke put ontvangt 50 μL van de oplossing.
- Voer lyophilisatie uit, zoals hieronder beschreven, om de steigerstructuur van de NM te visualiseren.
- Vries de plaat 's nachts in bij -80 °C.
- Schakel het lyofiele instrument en de vacuümpomp in.
- Druk op de knop Afkoelen om de temperatuur van het systeem te verlagen tot -50 °C.
- Plaats de bevroren plaat in het gelyophiliseerde instrument en sluit alle openingen van de instrumenten.
- Klik op de startknop om de systeemdruk te verlagen tot 0,9 mbar.
- Druk na 4 uur op de beluchtingsknop en open de klep om de systeemdruk naar de atmosferische druk te verhogen.
- Haal de plaat uit het lyofiele instrument.
- Gebruik een microscoop om de FN, JBNT's en de resulterende zelfgemonteerde NM te observeren. Maak verschillende foto's met een camera voor de materialen.
4. Absorptiespectrameting
OPMERKING: Gebruik de wijziging van spectra voor FN en JBNT's om de zelfgemonteerde JBNT/FN NM12te presenteren.
- Meng 30 μL van 100 μg/ml FN met 15 μL gedestilleerd water en 5 μL van 1 mg/ml JBNT's om de JBNT/FN NM-oplossing te bereiden. Witte vaste ophanging is te zien na het meerdere keren pipetten van de oplossing.
OPMERKING: De uiteindelijke concentraties JBNT's en FN in de oplossing zijn respectievelijk 100 μg/ml en 60 μg/ml. JBNT's en FN-oplossingen in dezelfde concentratie als die in de NM-oplossing werden ook voorbereid als besturingsoplossingen. - Verdun 5 μL van 1 mg/ml JBNT's met 45 μL gedestilleerd water om JBNT-controleoplossing te bereiden.
- Verdun 30 μL van 100 μg/ml FN met 20 μL gedestilleerd water om FN-controleoplossing te bereiden.
- Meet de UV-vis absorptiespectra van FN- JBNT- en JBNT/FN NM-oplossingen met de spectrofotometer (zie Materialentabel)om de assemblage van NM te karakteriseren.
- Klik op de UV-Vis knop. Reinig het testoppervlak van de spectrofotometer en laat er 2 μL gedestilleerd water op vallen. Meet het als blanco van 190-850 nm.
- Reinig het testoppervlak van de spectrofotometer en laat er 2 μL FN-oplossing op vallen. Meet de UV-Vis absorptiespectra van FN-oplossing van 190 nm tot 850 nm.
- Reinig het testoppervlak van de spectrofotometer en laat er 2 μL JBNT-oplossing op vallen. Meet de absorptiespectra van JBNT-oplossing van 190 nm tot 850 nm.
- Reinig het testoppervlak van de spectrofotometer en laat er 2 μL JBNT/FN NM-oplossing op vallen. Meet de absorptiespectra van JBNT/FN NM-oplossing van 190 nm tot 850 nm.
5. Voorbereiding van JBNT/FN NM voor transmissie elektronische microscopie (TEM)
- Reinig verschillende rasters vóór negatieve kleuring met een basisplasmareiniger (zie Tabel met materialen).
- Voer de negatieve kleuring voor de monsters uit volgens twee verschillende processen.
- Laat 3 μL van 1 mg/ml JBNT waterige oplossing en 3 μL JBNT/FN NM-oplossing op gescheiden roosters vallen en laat het 2 minuten staan. Spoel vervolgens elk rooster af met 100 μL 0,5% uranylacetaatoplossing (UA). Giet de overtollige oplossing af met filterpapier en droog de roosters aan de lucht.
- Meng 9 μL JBNT/FN NM-oplossing met 3 μL 2,0% UA-oplossing en pipetteer deze meerdere keren. Pipetteer de gemengde oplossing op de roosters en houd deze 2 minuten op de roosters. Gebruik een filterpapier om de gemengde oplossing uit de roosters te verwijderen en droog de roosters op kamertemperatuur.
- Karakteriseer ten slotte het exemplaar voor JBNT's, JBNT/FN NM bevlekt met stap 5.2.1 en JBNT/FN NM bevlekt met stap 5.2.2 met de TEM.
6. In vitro biologische functietest
- Voeg 200 μL negatieve controles (NC, PBS), JBNT's, FN en de JBNT/FN NM-oplossingen toe aan een put van respectievelijk een 8-put chambered slide.
- Vries de 8-put kamer coverglass in met het lyofiele instrument om materialen op de bodem van putten te coaten. Het protocol voor vriesdrogen is hetzelfde als stap 3.5.
- Voeg vervolgens 10.000 cellen/putten hMC's (Passage 3) toe aan de putten en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
- Pipetteer na incubatie het celkweekmedium uit de putten en spoel de kweek af met 1x PBS-oplossing.
- Voeg 100 μL van de fixatieve oplossing toe aan elke put met cellen en laat 5 minuten staan. Spoel cellen twee keer voorzichtig af met 1x PBS.
- Verdun 1% Triton-X 100 tot 0,1%. Voeg 100 μL van 0,1% Triton-X 100 toe aan elke put met cellen en laat 10 minuten staan. Spoel cellen twee keer voorzichtig af met 1x PBS.
- Verdun de Rhodamine Phalloidin tot 1,65 μM. Voeg 100 μL Rhodamine Phalloidin toe aan elke put met cellen en incubeer het kamervormige afdekglas gedurende 30 minuten tegen licht bij kamertemperatuur. Spoel cellen twee keer voorzichtig af met 1x PBS.
- Leg de celbeelden vast met een fluorescerende microscoop.
- Tel de celnummers op fluorescerende afbeeldingen voor elke groep. Bereken de celhechtingsdichtheid door middeling van drie willekeurige gebieden in elke put.
- Presenteer alle gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyses uitvoeren met behulp van een eenzijdige t-test, gevolgd door een analyse van variantie (ANOVA) met p<0,05, die als statistisch significant wordt beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze studies ontdekten dat de vorming van de NM van JBNT's en FN snel is, wat in 10 seconden gebeurde. Zoals getoond in figuur 2,werd witte floccule verkregen toen de JBNT-oplossing werd gemengd met de FN-oplossing en meerdere keren werd gepijpt. Het vormingsproces van NM is volledig biomimetisch. Er zijn geen externe prikkels nodig. Het fabricageproces is veel eenvoudiger dan dat van sommige opkomende biomaterialen, dat is gebaseerd op ultraviolet licht of chemische initiator voor crosslinking13.
We hebben de camerabeelden van FN, JBNT's en de NM vastgelegd en geanalyseerd (figuur 3). Voor de FN-groep werden, op korte witte vlekken na, geen lange vezels waargenomen. De korte clusters waren de eiwit agglomeraties bestaande uit FN, wat aangeeft dat de steigerstructuur niet alleen met FN kan worden gevormd zonder JBNT's (figuur 3A). Zoals getoond in figuur 3B,geven de lange en dunnere vezels het bestaan van JBNT's aan. De breedte van de witte strengen van de NM is breder in vergelijking met JBNT's, wat aangeeft dat de JBNT's en FN met elkaar verbonden zijn en NM vormen. De NM-vezel kan tot enkele centimeters lang worden(figuur 3C).
We hebben de UV-Vis spectra verkregen om de assemblage tussen JBNT's en FN aan te geven. Zoals blijkt uit figuur 4,vertoont JBNT's twee absorptiepieken bij respectievelijk 220 nm en 280 nm. In vergelijking met JBNT's heeft de JBNT/FN NM twee absorptiepieken op dezelfde locatie met een aanzienlijk verlaagde waarde, die afkomstig was van JBNT's, maar tussendoor werd beïnvloed door de niet-covalente zelfgemonteerde JBNT's en FN.
TEM werd gebruikt om de morfologie van de JBNT's en NM te karakteriseren. Zoals getoond in figuur 5A,zijn de JBNT's slanke buizen met uniforme diameters. Onder neutrale omstandigheden worden JBNT's positief geladen terwijl FN negatief wordt opgeladen. Wanneer ze gemengd waren, vormden ze lange vleesboom NM via oplaadinteracties (figuur 5B). Wanneer de pH lager is dan het iso-elektrische punt van het FN (pI van 5,5-6,0), presenteren de NM-bundels zelfontspanner vanwege het positief geladen FN. Zoals weergegeven in figuur 5C, werd de NM, wanneer bewaard in een oplossing met een lage pH (4.0), gedesembled en kwam er veel FN vrij uit de NM. Het FN dat naast de nanobuis wordt gedistribueerd, is ook een sterk bewijs dat de NM is vervaardigd door JBNT 's en FN10.
We onderzochten het effect van de JBNT/FN NM op celhechting. Zoals weergegeven in figuur 6,vertoonde de celhechtingsdichtheid van de NM-groep een significant verschil (p-waarde <0,05) waarde ten opzichte van de negatieve controle. Het verschil kan zijn omdat de NM zijn ontworpen om ecm morfologisch na te bootsen, die een steiger bieden voor celhechting14. Het ECM bestond uit collageen en cellijmglycoproteïnen, zoals fibronectine15. Collageen is gepresenteerd met het vermogen om een hogere hechting en proliferatie van hMSCs te bevorderen16. Bovendien is aangetoond dat fibronectine de hMSCs-hechting op de gewonde plaats verbetert15. Fluorescentiebeeldvorming toonde ook aan dat de therapietrouw van de NM-groep aanzienlijk toenam ten opzichte van de negatieve controlegroep (figuur 7)15,17.
Figuur 1: Schematische illustratie van de hiërarchische zelfassemblage van JBNT's met een lysine zijketen.
Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van de vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Demonstratie voor het zelfgemonteerde proces van de NM.
(A) FN-oplossing. (B) JBNT's gemengd met FN. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van de vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Brightfield foto's.
Brightfield foto's van (A) FN (B) JBNTs en (C) NM gevormd door JBNTs en FN. Elk gebied heeft een diameter van 2 cm. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van de vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Absorptiespectra van FN, JBNT's en JBNT/FN NM.
Dit cijfer wordt herdrukt uit de vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: TEM-afbeeldingen.
TEM afbeeldingen van (A) JBNTs (B) JBNT/FN NM, en (C) vrijgegeven JBNT/FN NM. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van de vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Statistische analyse van cellulaire adhesie.
In dit experiment werd de hechtingsdichtheid van cellen geregistreerd. *p<0,01 in vergelijking met negatieve controles. **p<0,05 in vergelijking met JBNT alleen. N=3. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van de vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Fluorescentiebeelden.
Fluorescentiebeelden van (A) de hMSCs en (B) de hMSC geïncubeerd met de JBNTs. (C) de hMSC geïncubeerd met de FN. (D) de hMSC geïncubeerd met de JBNT/FN NM. Schaalbalk: 100 μm. Dit cijfer wordt herdrukt met toestemming van de vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tijd | A% | B% | C% |
| 0.00 min | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 min | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 min | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 min | 0 | 100 | 0 |
Tabel 1: Verloopverdunningstijd.
Aanvullend dossier 1: Schema voor de synthese van JBNT monomeer. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullend Bestand 2: Video voor zelfassemblage van de FN/JBNT NM. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie ontwikkelden we een zelfgemonteerde biomimetische NM, die werd gevormd met DNA-geïnspireerde JBNT's en FN. Bij het bereiden van de JBNT-oplossing moet het JBNT-gelyophiliseerde poeder in het water worden opgelost in plaats van PBS, omdat PBS agglomeratie van JBNT's zal veroorzaken, wat hun assemblage remt. Bovendien moet de NM ook in water worden geassembleerd als we de nanofibrillerende structuren van de NM willen observeren, omdat het zout in PBS zal bundelen met NM-vezels, wat de resolutie van de beelden aanzienlijk kan verminderen.
De NM heeft een groot potentieel getoond om te dienen als een nieuwe tissue engineering steiger, hoewel er veel inspanningen zijn gedaan om weefsel regeneratieve steigers te fabriceren, die werden gebruikt om hMSCs hechting en differentiatie te vergemakkelijken. De meeste van deze materialen zijn echter vooraf gemaakt met een specifieke vorm, zoals een 3D-geprintesteiger 18,19. Als zodanig zijn ze niet gemakkelijk te implanteren op gewonde plaatsen die zich diep in het gewricht bevinden. De NM-oplossing hier kan echter als vloeistof worden geïnjecteerd en vervolgens dienen als een steiger voor celhechting.
Een beperking is dat de NM niet mechanisch sterk is. In tegenstelling tot polymeren worden ze vervaardigd via zelfassemblage van niet-covalente interacties, dus ze kunnen niet veel mechanische belasting of spanning verdragen. Aan de andere kant vertoont de niet-covalente structuur ook een zeer goede biologische afbreekbaarheid en biocompatibiliteit die geschikt zijn voor biologische functies8,20,21.
De injecteerbare NM heeft een groot potentieel getoond om een doellocatie en een steiger voor MSC homing te bieden om de genezing van botbreuken in het lichaam te verbeteren. Wanneer het echter op de gewonde plaats wordt geïnjecteerd, kan het zijn dat de niet-equivalente NM lange tijd niet op zijn plaats blijft, wat het therapeutische effect kan verminderen. In de toekomst zullen we onderzoeken om andere materialen (zoals hydrogels) op te nemen of om de NM-structuren af te wisselen om de eigenschappen van de NM-steiger verder te optimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Yupeng Chen is medeoprichter van NanoDe Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Dit werk wordt financieel ondersteund door NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) en University of Connecticut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
