Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.
Abstract
Ein biomimetisches NM wurde entwickelt, um als gewebetechnisches biologisches Gerüst zu dienen, das die Stammzellverankerung verbessern kann. Das biomimetische NM wird aus JBNTs und FN durch Selbstmontage in wässriger Lösung gebildet. JBNTs messen 200-300 m lang mit inneren hydrophoben Hohlkanälen und äußeren hydrophilen Oberflächen. JBNTs sind positiv geladen und FNs sind negativ geladen. Daher werden sie, wenn sie in eine neutrale wässrige Lösung injiziert werden, über nicht kovalente Bindungen zu den NM-Bündeln zusammengebunden. Der Selbstmontageprozess wird innerhalb weniger Sekunden ohne chemische Initiatoren, Wärmequelle oder UV-Licht abgeschlossen. Wenn der pH-Wert der NM-Lösung niedriger ist als der isoelektrische Punkt von FNs (pI 5.5-6.0), werden sich die NM-Bundles aufgrund des Vorhandenseins von positiv geladenem FN selbst freisetzen.
NM ist dafür bekannt, die extrazelluläre Matrix (ECM) morphologisch nachzuahmen und kann daher als injizierbares Gerüst verwendet werden, das eine hervorragende Plattform zur Verbesserung der hMSC-Haftung bietet. Zelldichteanalysen und Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente zeigten, dass die NMs die Verankerung von hMSCs im Vergleich zur Negativkontrolle signifikant erhöhten.
Introduction
Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) haben das Potenzial für Selbsterneuerung und Selbstdifferenzierung entlang verschiedener mesenchymaler Abstammunggezeigt, was bei der Regeneration und Erhaltung von Geweben hilft1. Basierend auf dem Differenzierungspotenzial werden hMSCs als Kandidaten für mesenchymale Gewebeverletzungen und hämatopoetische Störungstherapie2betrachtet. hMSCs haben die Fähigkeit gezeigt, die Wundheilung durch Erhöhung der Gewebereparatur, Angiogenese und Verringerung der Entzündung3zu fördern. Ohne hilfe durch biochemische oder biomaterialien ist die Effizienz der hMSCs, ein Zielgewebe zu erreichen und am gewünschten Ort zu funktionieren, gering4. Obwohl verschiedene technische Gerüste verwendet wurden, um hMSCs anzuziehen, um an den Läsionen festzuhängen, sind einige Stellen wie Wachstumsplattenfrakturen in der Mitte eines langen Knochens nicht leicht zugänglich durch die herkömmlichen vorgefertigten Gerüste, die möglicherweise nicht perfekt in eine unregelmäßig geformte verletzte Stelle passen.
Hier haben wir ein biomimetisches Nanomaterial entwickelt, das sich vor Ort selbst zusammenbauen und in ein schwer erreichbares Zielgebiet injiziert werden kann. Das injizierbare Biogerüst NM besteht aus Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN). JBNTs, auch bekannt als Rosette Nanotubes (RNTs), werden aus DNA-Basenpaaren abgeleitet, insbesondere Thymin und Adenin, hier5,6,7. Wie in Abbildung 1dargestellt, bilden sich die Nanoröhren, wenn sich sechs Moleküle der abgeleiteten DNA-Basenpaare selbst über Wasserstoffbindungen zu einer Ebene6zusammensetzen. Sechs Moleküle werden dann über eine starke Pi-Stacking-Wechselwirkung7,die bis zu 200-300 m lang sein kann, in einer Ebene übereinander gestapelt. Die JBNTs wurden entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagiert.
FN ist ein hochmolekulares Klebeglykoprotein, das in der extrazellulären Matrix (ECM)9zu finden ist. Diese können die Befestigung von Stammzellen an anderen Komponenten des ECM, insbesondere Kollagen10, vermitteln. Wir haben JBNTs entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagieren kann, um NM in wenigen Sekunden durch nicht kovalente Bindung zu bilden. Daher ist NM ein vielversprechendes Biogerüst, das in eine Knochenbruchstelle injiziert werden kann, die von den konventionell gefertigten Gerüsten nicht zugänglich ist. Hier präsentiert das injizierbare NM eine hervorragende Fähigkeit, die hMSC-Verankerung in vitro zu verbessern und zeigt ihr Potenzial, als Gerüst für die Geweberegeneration zu dienen.
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Protocol
1. Synthese von JBNTs
HINWEIS: JBNT monomer wurde wie zuvor veröffentlicht11erstellt.
- Synthese der Verbindung A1
- Bereiten Sie eine Lösung vor, die 8,50 g 2-Cyanoessigsäure und 9,80 g Ethylcarbamat in 25 ml Toluin und 2,5 ml N, N-Dimethylformamid enthält. 4,90 ml Phosphorylchlorid tropfenweise hinzufügen. Dann die Mischung auf 70 °C erhitzen und 1,5 h rühren.
- Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und gießen Sie 100 g Eiswasser ein. Die wässrige Schicht mit Ethylacetat (3 x 250 ml) abziehen und mit 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Flüchtige unter Vakuum, um einen hellgelben Feststoff zu erhalten.
- Den gelben Feststoff der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (3% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 15,61 g Verbindung A1 als weißes Pulver zu ergeben.
- Synthese der Verbindung A2
- 3,12 g Verbindung A1 und 2,75 g Kaliumcarbonat in 50 ml N, N-Dimethylformamid mischen. Bei Raumtemperatur 2 h umrühren.
- Fügen Sie der Reaktionssuspension 2,6 ml Kohlenstoffdisulfid hinzu. Halten Sie rühren für 4 h.
- Absolutes Ethanol bei 0 °C in das Reaktionsgemisch geben. Filtern Sie den gelben Niederschlag heraus und waschen Sie ihn mit dem Ethylether. Unter Vakuum über Nacht trocknen, um 6,18 g Verbindung A2 als hellgelb fest zu ergeben.
- Synthese der Verbindung A3
- 2,7 ml Methyljodid in 15 ml Acetonitril hinzufügen. Außerdem eine Lösung der Verbindung A2 separat vorbereiten, indem 6,18 g A2 bis 80 ml Wasser/Acetonitril (7:3-Verhältnis) hinzugefügt werden. Mischen Sie beide Lösungen und rühren Sie bei Raumtemperatur für 30 min.
- Das Reaktionsgemisch auf 95 °C erhitzen und 3 h rühren.
- Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur, und verdampfen Sie dann die Flüchtigen unter Vakuum.
- Den Rückstand 3x mit 100 ml Ethylacetat extrahieren und mit Salzlake waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen gelben Feststoff zu erhalten.
- Den gelben Feststoff der Kieselgel-Blitzsäulenchromatographie (30% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 4,52 g der Verbindung A3 als hellgelben Feststoff zu ergeben.
- Synthese der Verbindung A4
- Bereiten Sie die Allylaminlösung vor, indem Sie 925 L Allylamin in 20 ml Ethanol hinzufügen. Fügen Sie diese Lösung tropfenweise in die Lösung der Verbindung A3, vorbereitet durch Zugabe von 3,14 g A3 in 75 ml absolutem Ethanol, über 30 min. Dann erhitzen Sie das Reaktionsgemisch zu Reflux für 16 h.
- Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und verdampfen Sie die Flüchtigen, um einen gelben Feststoff zu geben.
- Den gelben Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (50% Ethylacetat/Hexanen bis 2% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 1,80 g Verbindung A4 als weißen Kristall zu ergeben.
- Synthese der Verbindung A5
- 2,05 g Guanidiniumhydrochlorid und 7,8 ml Natriumethoxid (21 Gew.-% in Ethanol) in 14 ml absolutes Ethanol hinzufügen. Das Gemisch 15 min auf 45 °C erhitzen.
- Filtern Sie das unlösliche Material ab und fügen Sie das Filtrat direkt in die Lösung der Verbindung A4 ein, die durch Zugabe von 2,70 g A4 in 40 ml absolutem Ethanol hergestellt wird. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf Reflux für 16 h.
- Filtern Sie den Niederschlag heraus, um 2,65 g Verbindung A5 als off-white Feststoff zu erhalten.
- Synthese der Verbindung A6
- Fügen Sie 24,9 ml Triethylamin langsam in das Güllegemisch, das durch Zugabe von 2,11 g Verbindung A5 und 1,10 g 4-Dimethylaminopyridin in 120 ml Tetrahydrofuran über 1 min erhalten wird. Bei Raumtemperatur 2 min rühren.
- 20,7 ml Di-Tert-Butyldicarbonat tropfenweise in das Reaktionsgemisch geben und bei Raumtemperatur 40 h rühren.
- Fügen Sie 20 ml Wasser hinzu, um die Reaktion zu löschen. Verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum.
- Extrahieren Sie den roten viskosen Rückstand mit 500 ml Ethylacetat. Dann mit 250 ml Wasser, 75 ml 10% Zitronensäure, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole einwaschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen rot/orange festen Körper zu geben.
- Den Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (0-20% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 3,87 g Verbindung A6 als weißen Schaum zu ergeben.
- Synthese der Verbindung A7
- N-Methylmorpholine N-Oxid (50 Gew.% in Wasser, 1,64 ml) tropfenweise in die Lösung der Verbindung A6 (2,93 g) in Aceton/Wasser (8:1, 58,5 ml) geben und bei Raumtemperatur 5 min rühren.
- Osmiumtetraoxid (4% wässrige Lösung) über einen Zeitraum von 3 min tropfenweise in das Gemisch geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.
- Die Reaktion mit 1,0 M wässrigem Natriumsulfit ablöschen, bis die Lösung farblos wird. Entfernen Sie die flüchtigen Stoffe unter Vakuum, um eine weiße Gülle in Wasser zu führen. Den Rückstand mit 350 ml Dichlormethan abziehen und dann mit 150 ml Wasser waschen, gefolgt von einer Wäsche mit 150 ml Sole.
- Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um 2,45 g Verbindung A7 als weißen Feststoff zu ergeben.
- Synthese der Verbindung A8
- 760 g Natriumperiodid in 35 ml Dichlormethan/Wasser (6:1, 35 ml) in das Gemisch von 1,36 g Verbindung A7 geben und bei Raumtemperatur 42 h rühren.
- Filtern Sie das unlösliche Material ab und konzentrieren Sie das Filtrat unter Vakuum. Die resultierenden Rückstände mit 250 ml Dichlormethan extrahieren und dann mit 100 ml Wasser und 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.
- Das Rohprodukt der Kieselgel-Säulenchromatographie (5-40% Ethylacetat/Hexane, dann 5% Methanol/Dichlormethan) auf 1,08 g Verbindung A8 auferliegen.
- Synthese der Verbindung A9
- Bereiten Sie eine Lösung von 830 mg Verbindung A8 in 15 ml 1,2-Dichlorethan vor. Fügen Sie die Lösung tropfenweise in das Gemisch aus 6-Benzyloxycarbonylamino-2-L-Amino-Hexanosäure-Trimethylsilyl-Ethylester (649,5 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (591 l) in 24 ml von 1,2-Dichlorethan über 3 min und rühren bei Raumtemperatur für 15 min.
- 360,3 mg Natriumtriacetoxyborohydrid in die Lösung geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.
- Das Reaktionsgemisch mit 6 ml Wasser ablöschen. Das Reaktionsgemisch 3x mit 200 ml Dichlormethan extrahieren und mit 200 ml 10% Zitronensäure in Wasser, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole in dieser Reihenfolge waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.
- Das Rohprodukt der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (5-30% Ethylacetat/Hexane) auf 885 mg Verbindung A9 aussetzen.
- Synthese von JBNT-Monomer
- 0,54 g Verbindung A9 (0,54 g) in 10 ml 94% Trifluoressigsäure/Thioanisollösung auflösen und bei Raumtemperatur 72 h rühren.
- Diethylether (80 ml) dem Reaktionsgemisch hinzufügen und den Niederschlag zentrieren. Gießen Sie die klare Trifluoressigsäure, die Überstand enthält, und waschen Sie den weißen Niederschlag mit Demethylether und Methanol, um 168,6 mg Roh-JBNT-Monomer(Ergänzungsdatei 1) zu ergeben.
- Reinigen Sie das rohe JBNT-Monomer durch eine hochleistungsreiche Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Reverse-Phase-Säule. Das Isolationsprogramm ist unten aufgeführt: Lösungsmittel A: 100% Wasser; Lösungsmittel B: 100% Acetonitril; Lösungsmittel C: pH=1 HCl-Wasserlösung; Durchfluss: 3 ml/min (siehe Tabelle 1).
- Sammeln Sie den größten Gipfel in etwa 7,2 min.
2. Herstellung für JBNT/FN
- Fügen Sie die wässrige Lösung JBNT mit 80 l von 1 mg/ml mehrmals in eine 1 mg/ml FN-Wässerlösung und Pipette.
- Prüfen Sie, ob eine weiße Feststoffsuspension nach dem Pipetieren ca. 10 s ist.
HINWEIS: Ein Video wurde aufgenommen, um den Selbstmontageprozess von NM (Supplemental File 2) zu erfassen.
3. Beobachtung lyophilisierter Proben
HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Gerüststruktur von NM aus JBNTs und FN anzuzeigen.
- Bereiten Sie FN-, JBNT- und FN/JBNT NM-Lösungen für die Lyophilisierte Materialbeobachtung vor. Verdünnen Sie 10 l von 100 g/ml FN mit 40 l destilliertem Wasser, um eine 20-g/ml-Lösung von FN herzustellen.
- Bereiten Sie 100 mg/ml Lösung von JBNTs durch Verdünnung von 5 l von 1 mg/ml JBNTs in 45 l DI-Wasser vor.
- Mischen Sie 10 l von 100 g/ml FN und 5 x l von 1 mg/ml JBNTs in 35 l DI-Wasser, um die NM-Lösung zu bilden.
- Beschichten Sie drei Bohrungen mit 96-gut klaren rundrunden Boden-Mikroplatten mit der FN-, JBNT-Lösung bzw. NM-Lösung. Jeder Brunnen erhält 50 l der Lösung.
- Führen Sie eine Lyophilisierung durch, wie unten beschrieben, um die Gerüststruktur des NM zu visualisieren.
- Einfrieren der Platte bei -80 °C über Nacht.
- Schalten Sie das lyophilisierte Instrument und die Vakuumpumpe ein.
- Drücken Sie die Abkühltaste, um die Temperatur des Systems auf -50 °C zu reduzieren.
- Legen Sie die gefrorene Platte in das lyophilisierte Instrument und schließen Sie alle Öffnungen der Instrumente.
- Klicken Sie auf die Starttaste, um den Systemdruck auf 0,9 mbar zu reduzieren.
- Nach 4 h drücken Sie die Belüftungstaste und öffnen Sie das Ventil, um den Systemdruck auf den atmosphärischen Druck zu erhöhen.
- Nehmen Sie die Platte aus dem lyophilisierten Instrument.
- Verwenden Sie ein Mikroskop, um die FN, JBNTs und das resultierende selbstmontierte NM zu beobachten. Nehmen Sie mehrere Fotos mit einer Kamera für die Materialien.
4. Absorptionsspektrenmessung
HINWEIS: Verwenden Sie den Spektrenwechsel für FN und JBNTs, um den selbst montierten JBNT/FN NM12vorzustellen.
- Mischen Sie 30 l von 100 g/ml FN mit 15 l destilliertem Wasser und 5 l von 1 mg/ml JBNTs, um die JBNT/FN NM-Lösung vorzubereiten. Weiße feste Suspension kann nach dem Pipettieren der Lösung mehrmals gesehen werden.
ANMERKUNG: Die Endkonzentrationen von JBNTs und FN in der Lösung betragen 100 g/ml bzw. 60 g/ml. JBNTs und FN-Lösungen in der gleichen Konzentration wie in der NM-Lösung wurden ebenfalls als Steuerungslösungen vorbereitet. - Verdünnen Sie 5 l von 1 mg/ml JBNTs mit 45 l destilliertem Wasser, um die JBNT-Kontrolllösung vorzubereiten.
- Zur Herstellung der FN-Kontrolllösung 30 l von 100 g/ml FN mit 20 l destilliertem Wasser verdünnen.
- Messen Sie die UV-Vis-Absorptionsspektren von FN-, JBNT- und JBNT/FN NM-Lösungen mit dem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle), um die Montage von NM zu charakterisieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche UV-Vis. Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 l destilliertes Wasser darauf fallen. Messen Sie es als Leerzeichen von 190-850 nm.
- Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L FN-Lösung darauf fallen. Messen Sie die UV-Vis Absorptionsspektren der FN-Lösung von 190 nm bis 850 nm.
- Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT-Lösung von 190 nm bis 850 nm.
- Reinigen Sie die Testoberfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT/FN NM-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT/FN NM-Lösung von 190 nm bis 850 nm.
5. Vorbereitung von JBNT/FN NM für die elektronische Übertragungsmikroskopie (TEM)
- Reinigen Sie mehrere Gitter vor negativer Färbung mit einem grundlegenden Plasmareiniger (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie die negative Färbung für die Proben nach zwei verschiedenen Prozessen durch.
- Lassen Sie 3 l von 1 mg/ml jbNTs wässrige Lösung und 3 l JBNT/FN NM-Lösung auf getrennten Gittern fallen und lassen Sie es für 2 min. Spülen Sie dann jedes Gitter mit 100 l 0,5% Uranylacetat (UA) Lösung. Entleeren Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier und trocknen Sie die Gitter lufttrocken.
- Mischen Sie die JBNT/FN NM-Lösung mit einer Lösung von 3 l mit einer UA-Lösung von 2,0 % und führen Sie sie mehrmals durch. Pipette die gemischte Lösung auf den Gittern und halten Sie es auf den Gittern für 2 min. Verwenden Sie ein Filterpapier, um die gemischte Lösung aus den Gittern zu entfernen und die Gitter bei Raumtemperatur zu trocknen.
- Schließlich charakterisieren Sie die Probe für JBNTs, JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.1 und JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.2 mit dem TEM gebeizt.
6. In-vitro-Biologische Funktion Assay
- Fügen Sie 200 L Negativsteuerungen (NC, PBS), JBNTs, FN und die JBNT/FN NM-Lösungen in einen Brunnen einer 8-Well-Kammerrutsche ein.
- Das 8-well-kammerförmige Deckglas mit dem lyophilisierten Instrument trocknen, um Materialien auf dem Boden der Brunnen zu beschichten. Das Protokoll zum Gefriertrocknen entspricht Schritt 3.5.
- Dann 10.000 Zellen/Brunnen hMSCs (Passage 3) in die Brunnen geben und 24 h bei 37 °C mit 5%CO2bebrüten.
- Nach der Inkubation das Zellkulturmedium aus den Brunnen herauspipetten und die Kultur mit 1x PBS-Lösung abspülen.
- Fügen Sie 100 l der fixativen Lösung zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie sie 5 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.
- 1% Triton-X 100 bis 0,1% verdünnen. Fügen Sie 100 l von 0,1% Triton-X 100 zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie es 10 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.
- Verdünnen Sie das Rhodamine Phalloidin auf 1,65 m. Fügen Sie 100 L Rhodamine Phalloidin zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie das kammerförmige Deckglas, das bei Raumtemperatur 30 min vom Licht gehalten wird. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.
- Erfassen Sie die Zellbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop.
- Zählen Sie die Zellennummern für fluoreszierende Bilder für jede Gruppe. Berechnen Sie die Zellhaftungsdichte, indem Sie in jedem Brunnen drei zufällige Bereiche durchschnittlich umstellen.
- Präsentieren Sie alle Daten als durchschnittliche ± Standardabweichung (SD). Führen Sie statistische Analysen mit einem einseitigen t-Test durch, gefolgt von einer Varianzanalyse (ANOVA) mit p<0.05, die als statistisch signifikant angesehen wird.
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Representative Results
Unsere Studien entdeckten, dass die Bildung des NM von JBNTs und FN schnell ist, was in 10 Sekunden geschah. Wie in Abbildung 2dargestellt, wurde weißes Flockel erhalten, wenn die JBNT-Lösung mit der FN-Lösung gemischt und mehrmals pipettiert wurde. Der Entstehungsprozess von NM ist vollständig biomimetisch. Es sind keine äußeren Reize erforderlich. Der Herstellungsprozess ist viel einfacher als der einiger aufkommenden Biomaterialien, die auf ultraviolettem Licht oder chemischem Initiator für die Vernetzung13basieren.
Wir haben die Kamerabilder von FN, JBNTs und dem NM aufgenommen und analysiert (Abbildung 3). Für die FN-Gruppe wurden bis auf kurze weiße Flecken keine langen Fasern beobachtet. Die kurzen Cluster waren die Protein-Agglomerationen, die aus FN bestehen, was darauf hindeutet, dass die Gerüststruktur nicht mit FN allein ohne JBNTs gebildet werden kann (Abbildung 3A). Wie in Abbildung 3Bdargestellt, weisen die langen und dünneren Fasern auf die Existenz von JBNTs hin. Die Breite der weißen Stränge des NM ist im Vergleich zu JBNTs breiter, was darauf hindeutet, dass die JBNTs und FN miteinander verbunden sind und NM bilden. Die NM-Faser kann bis zu mehreren Zentimeter lang werden (Abbildung 3C).
Wir haben die UV-Vis-Spektren erhalten, um die Montage zwischen JBNTs und FN anzuzeigen. Wie in Abbildung 4dargestellt, weist JBNTs zwei Absorptionsspitzen bei 220 nm bzw. 280 nm auf. Im Vergleich zu JBNTs hat der JBNT/FN NM zwei Absorptionsspitzen an der gleichen Stelle mit einem deutlich reduzierten Wert, der von JBNTs stammte, aber von den nicht kovalenten selbstmontierten JBNTs und FN dazwischen beeinflusst wurde.
TEM wurde verwendet, um die Morphologie der JBNTs und NM zu charakterisieren. Wie in Abbildung 5Adargestellt, sind die JBNTs schlanke Rohre mit gleichmäßigen Durchmessern. Unter neutralen Bedingungen werden JBNTs positiv geladen, während FN negativ geladen werden. Wenn sie gemischt wurden, bildeten sie lange fibroide NM über Ladungsinteraktionen (Abbildung 5B). Wenn der pH-Wert niedriger ist als der isoelektrische Punkt des FN (pI von 5.5-6.0), präsentieren die NM-Bündel aufgrund des positiv geladenen FN eine Selbstfreigabe. Wie in Abbildung 5Cdargestellt, wurde das NM, wenn es in einer Lösung mit niedrigem pH-Wert (4,0) konserviert wurde, dissembled, und eine Menge FN wurde aus dem NM freigesetzt. Der neben der Nanoröhre verteilte FN ist auch ein starker Beweis dafür, dass das NM von JBNTs und FN10hergestellt wurde.
Wir untersuchten die Wirkung des JBNT/FN NM auf die Zellhaftung. Wie in Abbildung 6dargestellt, zeigte die Zellhaftungsdichte der NM-Gruppe einen signifikanten Differenzwert (p-Wert <0,05) im Vergleich zum Negativkontrollwert. Der Unterschied kann daran liegen, dass das NM entwickelt wurde, um ECM morphologisch nachzuahmen, das ein Gerüst für die Zellhaftung14zur Verfügung stellt. Das ECM bestand aus Kollagenen und zellklebenden Glykoproteinen wie Fibronectin15. Kollagen wurde mit der Fähigkeit präsentiert, höhere Haftung und Proliferation von hMSCs16zu fördern. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Fibronectin die hMSCs Haftung an der verletzten Stelle sowie15verbessert. Fluoreszenz-Bildgebung zeigte auch, dass die hMSCs-Adhärenz der NM-Gruppe im Vergleich zur Negativkontrollgruppe signifikant zunahm (Abbildung 7)15,17.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der hierarchischen Selbstmontage von JBNTs mit einer Lysin-Seitenkette.
Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Demonstration für den selbstzusammengesetzten Prozess des NM.
(A) FN-Lösung. (B) JBNTs gemischt mit FN. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Brightfield-Fotos.
Brightfield Fotografien von (A) FN (B) JBNTs und (C) NM, gebildet von JBNTs und FN. Jeder Bereich hat einen Durchmesser von 2 cm. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Absorptionsspektren von FN, JBNTs und JBNT/FN NM.
Diese Zahl wird aus der vorherigen Publikation12nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: TEM-Bilder.
TEM Bilder von (A) JBNTs (B) JBNT/FN NM und (C) veröffentlicht JBNT/FN NM. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Statistische Analyse der zellulären Adhäsion.
In diesem Experiment wurde die Zellhaftungsdichte aufgezeichnet. *p<0.01 im Vergleich zu Negativkontrollen. **p<0.05 im Vergleich zu JBNT allein. N=3. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Fluoreszenzbilder.
Fluoreszenzbilder von (A) den hMSCs und (B) der hMSC inkubiert mit den JBNTs. (C) die hMSC inkubiert mit dem FN. (D) die hMSC mit dem JBNT/FN NM inkubiert. Maßstabsleiste: 100 m. Diese Abbildung wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation12neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zeit | A% | B% | C% |
| 0.00 min | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 Min. | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 Min. | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 Min. | 0 | 100 | 0 |
Tabelle 1: Gradientenelutionszeit.
Ergänzende Datei 1: Schema für die Synthese von JBNT-Monomer. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: Video zur Selbstmontage des FN/JBNT NM. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Studie entwickelten wir ein selbstzusammengesetztes biomimetisches NM, das mit DNA-inspirierten JBNTs und FN gebildet wurde. Bei der Herstellung der JBNT-Lösung sollte das lyophilisierte JBNT-Pulver anstelle von PBS ins Wasser aufgelöst werden, da PBS eine Agglomeration von JBNTs verursacht, was ihre Montage hemmt. Darüber hinaus sollte das NM auch in Wasser montiert werden, wenn wir die nanofibrilen Strukturen des NM beobachten wollen, da das Salz in PBS mit NM-Fasern gebündelt wird, was die Auflösung der Bilder erheblich reduzieren kann.
Das NM hat ein großes Potenzial gezeigt, als neuartiges Gewebe-Engineering-Gerüst zu dienen, obwohl viele Anstrengungen unternommen wurden, um geweberegenerative Gerüste herzustellen, die verwendet wurden, um die Haftung und Differenzierung von hMSCs zu erleichtern. Die meisten dieser Materialien sind jedoch mit einer bestimmten Form vorgefertigt, wie z. B. ein 3D-gedrucktes Gerüst18,19. Als solche sind sie nicht einfach, in verletzte Stellen implantiert zu werden, die tief im Gelenk sind. Die NM-Lösung kann hier jedoch als Flüssigkeit injiziert werden und dann als Gerüst für die Zellhaftung dienen.
Eine Einschränkung ist, dass der NM nicht mechanisch stark ist. Im Gegensatz zu Polymeren werden sie durch Selbstmontage von nichtkovalenten Wechselwirkungen hergestellt, so dass sie keine große mechanische Belastung oder Spannung ertragen können. Andererseits weist die nichtkovalente Struktur auch eine sehr gute biologische Abbaubarkeit und Biokompatibilität auf, die für biologische Funktionen geeignet ist8,20,21.
Das injizierbare NM hat ein großes Potenzial gezeigt, einen Zielort und ein Gerüst für MSC-Homing zur Verbesserung der Knochenbruchheilung im Körper bereitzustellen. Wenn jedoch in die verletzte Stelle injiziert, kann das nichtkovalente NM für eine lange Zeit nicht an Ort und Stelle bleiben, was die therapeutische Wirkung reduzieren kann. In Zukunft werden wir versuchen, andere Materialien (wie Hydrogele) zu integrieren oder die NM-Strukturen zu wechseln, um die Eigenschaften des NM-Gerüstes weiter zu optimieren.
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Disclosures
Dr. Yupeng Chen ist Mitbegründer von NanoDe Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird finanziell unterstützt durch NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) und University of Connecticut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
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