Målet med denne protokollen er å vise montering av en biomimetisk nanomatrix (NM) med Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). Når de er samkulturert med humane mesenchymale stamceller (hMSCer), viser NMs utmerket bioaktivitet i oppmuntrende hMSCer vedheft.
En biomimetisk NM ble utviklet for å tjene som et vev-engineering biologisk stillas, som kan forbedre stamcelle forankring. Biomimetisk NM er dannet fra JBNTs og FN gjennom selvmontering i en vandig løsning. JBNTs måler 200-300 μm i lengde med indre hydrofobe hule kanaler og ytre hydrofile overflater. JBNTs belastes positivt og FNs belastes negativt. Derfor, når de injiseres i en nøytral vandig løsning, bindes de sammen via ikke-kovalent binding for å danne NM-buntene. Selvmonteringsprosessen fullføres i løpet av få sekunder uten kjemiske initiativtakere, varmekilde eller UV-lys. Når pH av NM-løsningen er lavere enn isoelektrisk punkt av FNs (pI 5.5-6.0), NM bunter vil selv-release på grunn av tilstedeværelsen av positivt ladet FN.
NM er kjent for å etterligne den ekstracellulære matrisen (ECM) morfologisk og dermed kan brukes som et injiserbart stillas, noe som gir en utmerket plattform for å forbedre hMSC vedheft. Celletetthetsanalyse og fluorescensavbildningseksperimenter indikerte at NMs økte ankerplassen til HMSCer betydelig sammenlignet med den negative kontrollen.
Humane mesenchymale stamceller (hMSCer) har vist potensialet for selvfornyelse og selvdiensisjon langs forskjellige mesenchymale avstamninger, noe som bidrar til regenerering og vedlikehold avvev 1. Basert på differensieringspotensialet, anses hMSCer som kandidater for mesenchymale vevsskader og hematopoetisk lidelsesterapi2. hMSCs har vist evnen til å fremme sårheling ved å øke vevreparasjon, angiogenese og redusere betennelse3. Men uten biokjemisk eller biomaterialer assistanse, effektiviteten for hMSCs å nå et mål vev og funksjon på ønsket sted er lav4. Selv om ulike konstruerte stillas har blitt benyttet til å tiltrekke seg hMSCer for å holde seg på lesjonene, er noen steder som vekstplatebrudd, midt i et langt bein, ikke lett tilgjengelig av de konvensjonelle prefabrikkerte stillasene, som kanskje ikke passer perfekt inn i et uregelmessig formet skadet sted.
Her har vi utviklet et biomimetisk nanomateriale som selv kan montere in situ og injiseres til et vanskelig tilgjengelig målområde. Injiserbare bio-stillas NM består av Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). JBNTs, også kjent som Rosette Nanotubes (RNTs), er avledet fra DNA base par, spesielt thymine og adenin, her5,6,7. Som vist i figur 1dannes nanorørene når seks molekyler av den avledede DNA-basen parer seg selv montere via hydrogenbindinger for å danne et plan6. Seks molekyler stables deretter på hverandre i et plan via en sterk pi-stabling interaksjon7, som kan være opp til 200-300 μm i lengde. JBNTs er designet for å morfologisk etterligne kollagenfibre slik at FN vil reagere med dem.
FN er et høymolekylært klebemiddel glykoprotein, som finnes i den ekstracellulære matrisen (ECM)9. Disse kan megle vedlegg av stamceller til andre komponenter i ECM, spesielt kollagen10. Vi designet JBNTs for å morfologisk etterligne kollagenfibre slik at FN kan reagere med dem for å danne NM om noen få sekunder via ikke-kovalent binding. Derfor er NM et lovende biostillas som skal injiseres i et beinbruddssted som ikke kunne være tilgjengelig av de konvensjonelt fabrikkerte stillasene. Her presenterer injiserbare NM en utmerket evne til å forbedre hMSC forankring in vitro, viser sitt potensial til å tjene som et stillas for vev regenerering.
I denne studien utviklet vi en selvmontert biomimetisk NM, som ble dannet med DNA-inspirerte JBNTs og FN. Ved fremstilling av JBNT-løsningen skal JBNT lyofilisert pulver oppløses i vannet i stedet for PBS fordi PBS vil forårsake agglomerasjon av JBNTs, noe som hemmer deres montering. Videre bør NM også monteres i vann hvis vi ønsker å observere nano-fibril strukturer av NM, fordi saltet i PBS vil pakke med NM-fibre, noe som i stor grad kan redusere oppløsningen på bildene.
NM har vist…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes økonomisk av NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) og University of Connecticut.
1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
96-well plate | Corning | 353072 | |
absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
silica gel | TCI America | S0821 | |
sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |