Summary
Bu protokolün amacı, Janus baz nanotüpleri (JBNTs) ve fibronektin (FN) ile bir biyomimetik nanomatrixin (NM) montajını göstermektir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC' ler) ile birlikte kültürlendiğinde, NM'ler hMSC'lerin yapışkanını teşvik etmede mükemmel biyoaktivite sergiler.
Abstract
Kök hücre ankrajını artırabilen bir doku mühendisliği biyolojik iskelesi olarak hizmet edecek bir biyomimetik NM geliştirilmiştir. Biyomimetik NM, sulu bir çözeltide kendi kendine montaj yoluyla JBNT'lerden ve FN'den oluşturulur. JBNT'ler iç hidrofobik içi boş kanallar ve dış hidrofilik yüzeylerle 200-300 μm uzunluğundadır. JBNT'ler pozitif olarak ve FN'ler negatif olarak ücretlendirilir. Bu nedenle, nötr sulu bir çözeltiye enjekte edildiğinde, NM demetlerini oluşturmak için yaygın olmayan yapıştırma yoluyla birbirine bağlanırlar. Kendi kendine montaj işlemi, herhangi bir kimyasal başlatıcı, ısı kaynağı veya UV ışığı olmadan birkaç saniye içinde tamamlanır. NM çözeltisinin pH'ı FN'lerin izoelektrik noktasından (pI 5.5-6.0) daha düşük olduğunda, NM demetleri pozitif yüklü FN varlığı nedeniyle kendiliğinden serbest kalacaktır.
NM'nin hücre dışı matrisi (ECM) morfolojik olarak taklit ettiği bilinmektedir ve bu nedenle, hMSC yapıştırmasını geliştirmek için mükemmel bir platform sağlayan enjekte edilebilir bir iskele olarak kullanılabilir. Hücre yoğunluğu analizi ve floresan görüntüleme deneyleri, NM'lerin negatif kontrole kıyasla hMSC'lerin ankrajını önemli ölçüde artırdığını gösterdi.
Introduction
İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC'ler), dokuların yenilenmesine ve bakımına yardımcı olan farklı mezenkimal soylar boyunca kendini yenileme ve kendini farklılaştırma potansiyelini göstermiştir1. Farklılaşma potansiyeline dayanarak, hMSC'ler mezenkimal doku yaralanmaları ve hematopoetik bozukluk tedavisi için aday olarak kabul edilir2. hMSC'ler doku onarımını, anjiogenezini artırarak ve iltihabı azaltarak yara iyileşmesini teşvik etme yeteneğini göstermiştir3. Bununla birlikte, biyokimyasal veya biyomalzemeler yardımı olmadan, hMSC'lerin bir hedef dokuya ulaşması ve istenen yerde çalışması için verimlilik düşüktür4. Lezyonlara yapışmak için hMSC'leri çekmek için çeşitli tasarlanmış iskeleler kullanılsa da, uzun bir kemiğin ortasındaki büyüme plakası kırığı gibi bazı bölgelere, düzensiz şekilli bir yaralı bölgeye mükemmel bir şekilde sığmayan geleneksel önceden imal edilmiş iskeleler tarafından kolayca erişilemez.
Burada, kendi kendine yerinde monte edilebilen ve ulaşılması zor bir hedefe enjekte edilebilen bir biyomimetik nanomalzeme geliştirdik. Enjekte edilebilir biyo-iskele NM, Janus baz nanotüpler (JBNTs) ve fibronektinden (FN) oluşur. Rozet Nanotüpleri (RNTs) olarak da bilinen JBNT'ler, DNA baz çiftlerinden, özellikle timin ve adenden türetilir, burada5,6,7. Şekil 1'degörüldüğü gibi, nanotüpler, türetilmiş DNA tabanının altı molekülü hidrojen bağları aracılığıyla kendi kendine birleşerek bir düzlem oluşturduğunda oluşur6. Daha sonra altı molekül, 200-300 μm uzunluğa kadar olabilen güçlü bir pi istifleme etkileşimi7aracılığıyla bir düzlemde birbirlerine yığılır. JBNT'ler morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarlanmıştır, böylece FN onlarla reaksiyona girecektir.
FN, hücre dışı matriste (ECM)9bulunan yüksek moleküler ağırlıklı yapışkan glikoproteindir. Bunlar kök hücrelerin ECM'nin diğer bileşenlerine, özellikle kollajen10'abağlanmasına aracılık edebilir. JBNT'leri morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarladık, böylece FN onlarla reaksiyona girerek kararsız bağlanma yoluyla birkaç saniye içinde NM oluşturabilir. Bu nedenle, NM, geleneksel olarak imal edilmiş iskeleler tarafından erişilemeyen bir kemik kırılma bölgesine enjekte edilecek umut verici bir biyo-iskeledir. Burada, enjekte edilebilir NM, doku yenilenmesi için bir iskele görevi görebilme potansiyellerini sergileyen hMSC ankraj in vitro'yu geliştirmek için mükemmel bir yetenek sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. JBNT'lerin Sentezi
NOT: JBNT monomer daha önce yayınlandı olduğu gibi hazırlanmıştır11.
- Bileşik A1 sentezi
- 25 mL toluen ve 2,5 mL N, N-dimetilformamid içinde 8,50 g 2-siyanoasetik asit ve 9,80 g etilkarbamat içeren bir çözelti hazırlayın. Damla yönünde 4,90 mL fosforel klorür ekleyin. Daha sonra karışımı 70 ° C'ye ısıtın ve 1,5 saat karıştırmaya devam edin.
- Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve 100 g buzlu su dökün. Sulu tabakayı etil asetat (3 x 250 mL) ile çıkarın ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, soluk sarı bir katı elde etmek için uçucuları vakum altında filtreleyin ve buharlaştırın.
- Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%3 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz bir toz olarak 15,61 g bileşik A1 elde edin.
- A2 bileşiği sentezi
- 3.12 g bileşik A1 ve 2.75 g potasyum karbonatı 50 mL N, N-dimetilformamid karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.
- Reaksiyon süspansiyonu için 2,6 mL karbon disülfid ekleyin. 4 saat karıştırmaya devam edin.
- Reaksiyon karışımına 0 °C'de mutlak etanol ekleyin. Sarı çökeltiyi filtreleyin ve dietil eter ile yıkayın. Soluk sarı katı olarak 6,18 g bileşik A2 elde etmek için vakum altında bir gecede kurutun.
- A3 bileşiği sentezi
- 15 mL asetonitril içine 2,7 mL metil iyodür ekleyin. Ayrıca, 6,18 g A2 ila 80 mL su/asetonitril (7:3 oranı) ekleyerek ayrı ayrı bir A2 bileşik çözeltisi hazırlayın. Hem çözeltileri karıştırın hem de oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.
- Reaksiyon karışımını 95 °C'ye ısıtın ve 3 saat boyunca karıştırmaya devam edin.
- Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve ardından uçucuları vakum altında buharlaştırin.
- Kalıntıyı 100 mL etil asetat ile 3x çıkarın ve salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, sarı bir katı elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
- Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%30 etil asetat/hexanes) maruz kalarak A3 bileşiğin 4,52 g'ını açık sarı katı olarak elde edin.
- A4 bileşiği sentezi
- 20 mL etanol içine 925 μL allylamin ekleyerek alllamin çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi, 75 mL mutlak etanolde 3,14 g A3 eklenerek hazırlanan bileşik A3 çözeltisine damla yönünde ekleyin, 30 dakikadan fazla. Daha sonra reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.
- Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve sarı bir katı vermek için uçucuları buharlaştırin.
- Sarı katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%50 etil asetat/heksanlar %2 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz kristal olarak 1,80 g bileşik A4 elde edin.
- A5 bileşiği sentezi
- 14 mL mutlak etanol içine 2,05 g guanidinyum hidroklorür ve 7,8 mL sodyum etoksit (etanolde% 21 wt) ekleyin. Karışımı 15 dakika boyunca 45 °C'ye ısıtın.
- Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı doğrudan 40 mL mutlak etanol içine 2,70 g A4 ekleyerek hazırlanan A4 bileşiği çözeltisine ekleyin. Reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.
- 2,65 g bileşik A5 elde etmek için çökeltmeyi beyaz olmayan bir katı olarak filtreleyin.
- Bileşik A6 sentezi
- 1 dakika boyunca 120 mL tetrahidrofuranda 2,11 g bileşik A5 ve 1,10 g 4-Dimetilaminopyridine eklenerek elde edilen bulamaç karışımına yavaşça 24,9 mL trietilamin ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika karıştırın.
- Reaksiyon karışımına damla yönünde 20,7 mL di-tert-butil dikarbonat ekleyin ve oda sıcaklığında 40 saat karıştırmaya devam edin.
- Reaksiyonun söndürülmesi için 20 mL su ekleyin. Uçucuları vakum altında buharlaştır.
- Kırmızı viskoz kalıntıyı 500 mL etil asetat ile çıkarın. Ardından, 250 mL su, 75 mL% 10 sitrik asit, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, kırmızı/turuncu bir katı vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
- Katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%0-20 etil asetat/heksanes) vererek beyaz köpük olarak 3,87 g bileşik A6 elde edin.
- Bileşik A7 sentezi
- Aseton/suda (8:1, 58,5 mL) A6 (2,93 g) bileşik çözeltisine damla yönünde N-metilmorfolin N-oksit (suda% 50 wt.% ekleyin) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
- Karışıma 3 dakikalık bir süre boyunca damla yönünde osmiyum tetraoksit (%4 sulu çözelti) ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.
- Çözelti renksiz olana kadar reaksiyonun 1.0 M sulu sodyum sülfit ile söndürülmesi. Suda beyaz bir bulamaca neden olmak için vakum altındaki uçucuları çıkarın. Kalıntıyı 350 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 150 mL su ile yıkayın ve ardından 150 mL salamura ile yıkayın.
- Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, beyaz bir katı olarak 2,45 g bileşik A7 elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
- Bileşik A8 sentezi
- 35 mL dikloromethane/suda (6:1, 35 mL) 1,36 g bileşik A7 karışımına 760 g sodyum periodide ekleyin ve 42 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
- Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı vakum altında yoğunlaştırın. Elde edilen kalıntıyı 250 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 100 mL su ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
- Ham ürünü silika jel flaş kolon kromatografisine (%5-40 etil asetat/altıgen, daha sonra %5 metanol/dikloromethane) 1,08 g bileşik A8 verimine tabi tutunun.
- Bileşik A9 sentezi
- 1,2-dikloroetan 15 mL'de 830 mg bileşik A8 çözeltisi hazırlayın. Damlacık çözeltisini 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-heksanoik asit trimetilsilyl etil ester (649.5 mg) karışımına ekleyin ve N,N-diisopropylethylamine (591 μL) 24 mL'de 1,2-dikloroetan 3 dakika boyunca karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
- Çözeltiye 360,3 mg sodyum triacetoxyborohidrit ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.
- Reaksiyon karışımını 6 mL su ile söndürin. Reaksiyon karışımını 200 mL diklorometan ile 3x çıkarın ve suda% 10 sitrik asit 200 mL, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.
- Ham ürünü 885 mg bileşik A9 elde etmek için silika jel flaş sütun kromatografisine (%5-30 etil asetat/heksanes) tabi edin.
- JBNT monomer sentezi
- 0,54 g bileşik A9 'ı (0,54 g) %94 trifluoroasetik asit/tiyoanisol çözeltisinin 10 mL'sinde çözün ve oda sıcaklığında 72 saat karıştırın.
- Reaksiyon karışımına dietil eter (80 mL) ekleyin ve çökeltmeyi santrifüjleyin. Süpernatant içeren berrak trifluoroasetik asidi dökün ve beyaz çökeltiyi 168,6 mg ham JBNT monomer(Ek Dosya 1)elde etmek için dietil eter ve metanol ile yıkayın.
- Ham JBNT monomerini, ters faz sütununa sahip yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) ile arındırın. İzolasyon programı aşağıda listelenmiştir: Solvent A: % 100 su; solvent B: %100 asetonitril; solvent C: pH=1 HCl su çözeltisi; akış hızı: 3 mL/dk (bkz. Tablo 1).
- Yaklaşık 7.2 dakikada en büyük zirveyi toplayın.
2. JBNT / FN için İmalat
- 40 μL 1 mg/mL FN sulu çözeltiye ve pipete birkaç kez 80 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ekleyin.
- Yaklaşık 10 s pipetlemeden sonra beyaz katı süspansiyonun varlığını kontrol edin.
NOT: NM'nin kendi kendine montaj sürecini yakalamak için bir video çekildi (Ek Dosya 2).
3. Liyofilize örneklerin gözlemlenmesi
NOT: Bu adım, JBNT'lerden ve FN'den yapılan NM'nin iskele yapısını göstermek için gerçekleştirilir.
- Lyophilized malzeme gözlemi için FN, JBNT ve FN/JBNT NM çözümlerini hazırlayın. 20 μg/mL'lik bir FN çözeltisi yapmak için 10 μL 100 μg/mL FN'yi 40 μL damıtılmış su ile seyreltin.
- 45 μL DI suda 5 μL 1 mg/mL JBNT seyrelterek 100 mg/mL JBNT çözeltisi hazırlayın.
- NM çözeltisini oluşturmak için 35 μL DI suda 10 μL 100 μg/mL FN ve 5 μL 1 mg/mL JBNT karıştırın.
- Sırasıyla FN, JBNT çözümü ve NM çözümü ile 96 kuyulu yuvarlak alt mikro plakalardan oluşan üç kuyuyu kapla. Her kuyu 50 μL çözelti alır.
- NM'nin iskele yapısını görselleştirmek için aşağıda açıklandığı gibi liyofilizasyon gerçekleştirin.
- Plakayı gece boyunca -80 °C'de dondurun.
- Lyophilized cihazı ve vakum pompasını açın.
- Sistemin sıcaklığını -50 °C'ye düşürmek için soğuma düğmesine basın.
- Donmuş plakayı liyofilize enstrümana koyun ve aletlerin tüm açıklıklarını kapatın.
- Sistem basıncını 0,9 mbar'a düşürmek için başlat düğmesini tıklatın.
- 4 saat sonra, havalandırma düğmesine basın ve sistem basıncını atmosferik basınca artırmak için vanayı açın.
- Tabağı teofiliz aletinden çıkar.
- FN, JBNT'leri ve ortaya çıkan kendi kendine monte edilmiş NM'yi gözlemlemek için bir mikroskop kullanın. Malzemeler için bir kamera ile birkaç fotoğraf çekin.
4. Absorpsiyon spektrum ölçümü
NOT: Kendi kendine monte edilmiş JBNT / FN NM12'yisunmak için FN ve JBNT'ler için spektrum değişikliğini kullanın.
- JBNT/FN NM çözeltisini hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 15 μL damıtılmış su ve 5 μL 1 mg/mL JBNT ile karıştırın. Çözeltiyi birkaç kez pipetledikten sonra beyaz katı süspansiyon görülebilir.
NOT: Çözeltideki son JBNT ve FN konsantrasyonları sırasıyla 100 μg/mL ve 60 μg/mL'dir. NM çözümünde kullanılana aynı konsantrasyonda JBNT'ler ve FN çözümleri de kontrol çözümleri olarak hazırlanmıştır. - JBNT kontrol çözeltisini hazırlamak için 5 μL 1 mg/mL JBNT'yi 45 μL damıtılmış su ile seyreltin.
- FN kontrol çözeltisi hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 20 μL damıtılmış su ile seyreltin.
- NM'nin montajını karakterize etmek için FN, JBNT ve JBNT/FN NM çözeltilerinin UV-vis emme spektrumunu spektrofotometre ile ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
- UV-Vis düğmesini tıklatın. Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL damıtılmış su bırakın. 190-850 nm arasında boş olarak ölçün.
- Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL FN çözeltisi bırakın. FN çözeltisinin UV-Vis emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.
- Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT çözeltisi bırakın. JBNT çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.
- Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın. JBNT/FN NM çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.
5. İletim elektronik mikroskopisi (TEM) için JBNT/FN NM hazırlanması
- Temel plazma temizleyici ile negatif boyamadan önce birkaç ızgarayı temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- İki farklı işlemi takiben numuneler için negatif boyama gerçekleştirin.
- Ayrı ızgaralara 3 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ve 3 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın ve 2 dakika bekletin. Ardından her ızgarayı %0,5 uranil asetat (UA) çözeltisinin 100 μL'si ile durulayın. Fazla çözeltiyi filtre kağıdı ile boşaltın ve ızgaraları havayla kurutun.
- 9 μL JBNT/FN NM solüsyonunun 3 μL%2,0 UA çözeltisi ile karıştırın ve birkaç kez pipetlayın. Pipet ızgaralar üzerinde karışık çözelti ve 2 dakika boyunca ızgaralarda tutun. Karışık çözeltiyi ızgaralardan çıkarmak ve ızgaraları oda sıcaklığında kurutmak için bir filtre kağıdı kullanın.
- Son olarak, numuneyi JBNT'ler, adım 5.2.1 ile lekelenmiş JBNT/FN NM ve TEM ile 5.2.2 adımı ile lekelenmiş JBNT/FN NM için karakterize edin.
6. In vitro biyolojik fonksiyon tahlil
- 200 μL negatif kontrol (NC, PBS), JBNT, FN ve JBNT/FN NM çözümlerini sırasıyla 8 iyi odalmış bir slayt kuyusuna ekleyin.
- Kuyuların dibindeki malzemeleri kaplamak için 8 kuyulu odalı örtü örtüsünü liyofilize aletle dondurun. Dondurarak kurutma protokolü adım 3.5 ile aynıdır.
- Daha sonra kuyulara 10.000 hücre /kuyu hMSC (Passage 3) ekleyin ve % 5 CO 2 ile 37 °C'de24saat kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, hücre kültürü ortamını kuyulardan dışarı atın ve kültürü 1x PBS çözeltisi ile durulayın.
- Her kuyuya 100 μL sabitleyici çözelti ekleyin ve 5 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.
- Seyreltin 1% Triton-X 100 ila% 0.1. Her kuyuya 100 μL% 0.1 Triton-X 100 ekleyin ve 10 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.
- Rhodamine Phalloidin'i 1,65 μM'ye seyreltin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.
- Floresan mikroskopla hücre görüntülerini yakalayın.
- Her grup için floresan görüntülerdeki hücre numaralarını sayın. Her kuyuda üç rastgele alanın ortalamasını alarak hücre yapışıklık yoğunluğunu hesaplayın.
- Tüm verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun. Tek kuyruklu bir t testi kullanarak istatistiksel analizler yapın, ardından istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilen p<0.05 ile varyans analizi (ANOVA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çalışmalarımız, JBNT ve FN'nin NM oluşumunun hızlı olduğunu keşfetti, bu da 10 saniyede gerçekleşti. Şekil 2'degösterildiği gibi, JBNT çözeltisi FN çözeltisi ile karıştırıldığında ve birkaç kez pipetlendiğinde beyaz flokül elde edildi. NM'nin oluşum süreci tamamen biyomimetiktir. Harici uyaranlara gerek yoktur. İmalat süreci, çapraz bağlantı için ultraviyole ışık veya kimyasal başlatıcıya dayanan bazı gelişmekte olan biyomalzemelerden çok dahakolaydır.
FN, JBNTs ve NM'nin kamera görüntülerini yakaladık ve analiz ettik (Şekil 3). FN grubu için kısa beyaz lekeler dışında uzun lifler gözlenmedi. Kısa kümeler, iskele yapısının JBNT'ler olmadan tek başına FN ile oluşturulamayacağını gösteren FN'den oluşan protein aglomeralarıydı (Şekil 3A). Şekil 3B'degösterildiği gibi, uzun ve daha ince lifler JBNT'lerin varlığını gösterir. NM'nin beyaz tellerinin genişliği JBNT'lere kıyasla daha geniştir, bu da JBNT'lerin ve FN'nin NM oluşturan birbirleriyle çapraz bağ kurduğunu gösterir. NM lifi birkaç santimetre uzunluğa kadar büyüyebilir(Şekil 3C).
JBNT'ler ve FN arasındaki montajı belirtmek için UV-Vis spektrumunu elde ettik. Şekil 4'tegösterildiği gibi, JBNT'ler sırasıyla 220 nm ve 280 nm'de iki emilim zirvesi sergiler. JBNT'lerle karşılaştırıldığında, JBNT / FN NM, JBNT'lerden gelen ancak aralarındaki yaygın olmayan kendi kendine monte edilen JBNT'lerden ve FN'den etkilenen önemli ölçüde azaltılmış bir değere sahip aynı konumda iki emilim zirvesine sahiptir.
TEM, JBNT'lerin ve NM'nin morfolojisini karakterize etmek için kullanılmıştır. Şekil 5A'dagösterildiği gibi, JBNT'ler düzgün çaplara sahip ince tüplerdir. Nötr koşullar altında, JBNT'ler pozitif olarak ücretlendirilirken FN negatif olarak ücretlendirilir. Karıştırıldığında, şarj etkileşimleri yoluyla uzun fibroid NM oluşturdular (Şekil 5B). pH, FN'nin izoelektrik noktasından (pI 5,5-6,0) daha düşük olduğunda, NM demetleri pozitif yüklü FN nedeniyle kendiliğinden serbest bırakma sunar. Şekil 5C'de gösterildiği gibi, düşük pH (4.0) içeren bir çözeltide korunduğunda, NM parçalandı ve NM'den çok sayıda FN serbest bırakıldı. Nanotüple birlikte dağıtılan FN, NM'nin JBNT'ler ve FN10tarafından uydurduklarının da güçlü bir kanıtıdır.
JBNT/FN NM'nin hücre yapıştırma üzerindeki etkisini araştırdık. Şekil 6'dagösterildiği gibi, NM grubunun hücre yapıştırma yoğunluğu negatif kontrole kıyasla anlamlı fark (p-değeri <0.05) değeri göstermiştir. Fark, NM'nin hücre yapıştırma14için bir iskele sağlayan ECM'yi morfolojik olarak taklit etmek için tasarlanmış olması olabilir. ECM, fibronektin15gibi kollajenler ve hücre yapışkan glikoproteinlerinden oluşuyordu. Kollajen, hMSC'lerin daha yüksek yapışıklığını ve çoğalmasını teşvik etme yeteneği ilesunulmuştur 16. Ek olarak, fibronektin yaralı bölgedeki hMSCs yapışkanını arttırdığı gösterilmiştir15. Floresan görüntüleme ayrıca NM grubunun hMSC yapışmasının negatif kontrol grubuna göre önemli ölçüde arttığını göstermiştir (Şekil 7)15,17.
Şekil 1: JBNT'lerin lizin yan zinciri ile hiyerarşik kendi kendine montajının şematik gösterimi.
Bu şekil önceki yayından izin atılmış olarak yenidenyazdırılır 12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: NM'nin kendi kendine birleştirilmiş süreci için gösteri.
(A) FN çözümü. (B) FN ile karıştırılır JBNT'ler. Bu şekil önceki yayından izin atılmış olarak yenidenyazdırılır 12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Brightfield fotoğrafları.
(A) FN (B) JBNTs ve (C) NM'nin JBNTs ve FN tarafından oluşturulan Brightfield fotoğrafları. Her alanın çapı 2 cm'dir. Bu şekil önceki yayından izin atılmış olarak yenidenyazdırılır 12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FN, JBNT ve JBNT/FN NM emilim spektrumları.
Bu şekil önceki yayından yeniden yazdırılır12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: TEM görüntüleri.
TEM görüntüleri (A) JBNTs (B) JBNT / FN NM ve (C) JBNT / FN NM yayınladı. Bu şekil önceki yayından izin atılmış olarak yenidenyazdırılır 12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hücresel yapıştırma istatistiksel analizi.
Bu deneyde hücre yapıştırma yoğunluğu kaydedildi. *p<0.01 negatif denetimlerle karşılaştırıldığında. **p<0.05 sadece JBNT ile karşılaştırıldığında. N=3. Bu şekil önceki yayından izin atılmış olarak yenidenyazdırılır 12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Floresan görüntüler.
Floresan görüntüler (A) hMSC ve (B) hMSC JBNT'lerile inkübe. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şekil önceki yayından izin atılmış olarak yenidenyazdırılır 12. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Saat | A% | B% | C% |
| 0.00 dk | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 dk | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 dk | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 dk | 0 | 100 | 0 |
Tablo 1: Degrade verme süresi.
Ek Dosya 1: JBNT monomer sentezi için şema. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: FN / JBNT NM'nin kendi kendine montajı için video. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, DNA'dan ilham alan JBNT'ler ve FN ile oluşturulan kendi kendine monte edilmiş bir biyomimetik NM geliştirdik. JBNT çözeltisini hazırlarken, JBNT liyofilize tozu PBS yerine suya çözülmelidir, çünkü PBS, montajlarını engelleyen JBNT'lerin aglomerasyonuna neden olacaktır. Ayrıca, NM'nin nano-fibril yapılarını gözlemlemek istiyorsak NM de suda monte edilmelidir, çünkü PBS'deki tuz, görüntülerin çözünürlüğünü büyük ölçüde azaltabilecek NM lifleri ile birlikte gelecektir.
NM, hMSC'lerin yapışmasını ve farklılaşmasını kolaylaştırmak için kullanılan doku rejeneratif iskeleleri imal etmek için çok çaba sarf edilmesine rağmen, yeni bir doku mühendisliği iskelesi olarak hizmet etmek için büyük bir potansiyel göstermiştir. Bununla birlikte, bu malzemelerin çoğu 3D baskılı iskele18,19gibi belirli bir şekille önceden yapılmıştır. Bu nedenle, eklemin derinliklerindeki yaralı bölgelere implante edilmesi kolay değildir. Bununla birlikte, buradaki NM çözeltisi bir sıvı olarak enjekte edilebilir ve daha sonra hücre yapışıklığında bir iskele görevi görebilirsiniz.
Bir sınırlama, NM'nin mekanik olarak güçlü olmamasıdır. Polimerlerin aksine, yaygın olmayan etkileşimlerin kendi kendine montajı yoluyla üretilirler, bu nedenle çok fazla mekanik yükleme veya gerginliğe dayanamazlar. Öte yandan, noncovalent yapı aynı zamanda biyolojik fonksiyonlar için uygun çok iyi biyobozunurluk ve biyouyumbilite sunar8,20,21.
Enjekte edilebilir NM, vücutta kemik kırığı iyileşmesini artırmak için MSC homing için bir hedef konum ve bir iskele sağlamak için büyük bir potansiyel göstermiştir. Bununla birlikte, yaralı bölgeye enjekte edildiğinde, uyumsuz NM uzun süre yerinde kalmayabilir ve bu da terapötik etkiyi azaltabilir. Gelecekte, diğer malzemeleri (hidrojeller gibi) dahil etmeyi veya NM iskelesinin özelliklerini daha da optimize etmek için NM yapılarını değiştirmeyi keşfedeceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Yupeng Chen, NanoDe Therapeutics, Inc.'in kurucu ortağıdır.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Kariyer Ödülü (1653702) ve Connecticut Üniversitesi tarafından finansal olarak desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
