Summary
L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.
Abstract
Una MN biomimetica è stata sviluppata per fungere da impalcatura biologica di ingegneria tissutale, che può migliorare l'ancoraggio delle cellule staminali. La MN biomimetica è formata da JBNT e FN attraverso l'auto-assemblaggio in una soluzione acquosa. I JBNT misurano 200-300 μm di lunghezza con canali cavi idrofobici interni e superfici idrofile esterne. I JBNT sono caricati positivamente e le FN sono addebitate negativamente. Pertanto, quando iniettati in una soluzione acquosa neutra, vengono legati insieme tramite incollaggio non covalente per formare i fasci di MN. Il processo di auto-assemblaggio viene completato in pochi secondi senza alcun iniziatore chimico, fonte di calore o luce UV. Quando il pH della soluzione NM è inferiore al punto isoelettrico delle FN (pI 5.5-6.0), i bundle nm si auto-rilasciano a causa della presenza di FN caricato positivamente.
La MN è nota per imitare morfologicamente la matrice extracellulare (ECM) e quindi può essere utilizzata come impalcatura iniettabile, che fornisce un'eccellente piattaforma per migliorare l'adesione hMSC. L'analisi della densità cellulare e gli esperimenti di imaging a fluorescenza hanno indicato che gli NMS hanno aumentato significativamente l'ancoraggio degli HMS rispetto al controllo negativo.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali umane (hSPC) hanno mostrato il potenziale di auto-rinnovamento e auto-differenziazione lungo diversi lignaggi mesenchimali, il che aiuta nella rigenerazione e nel mantenimento dei tessuti1. In base al potenziale di differenziazione, gli hMSC sono considerati candidati per lesioni mesenchimali del tessuto e terapia del disturbo ematopoietico2. hSPC hanno dimostrato la capacità di promuovere la guarigione delle ferite aumentando la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi e riducendo l'infiammazione3. Tuttavia, senza assistenza biochimica o biomateriale, l'efficienza per gli hMSC di raggiungere un tessuto bersaglio e funzionare nella posizione desiderata è bassa4. Sebbene varie impalcature ingegnerizzate siano state utilizzate per attirare gli HMSC ad aderire alle lesioni, alcuni siti come la frattura della piastra di crescita, nel mezzo di un osso lungo, non sono facilmente accessibili dalle impalcature prefabburate convenzionali, che potrebbero non adattarsi perfettamente a un sito ferito di forma irregolare.
Qui, abbiamo sviluppato un nanomateriale biomimetico che può auto-assemblarsi in situ ed essere iniettato in un'area bersaglio difficile da raggiungere. La bio-impalcatura iniettabile NM è composta da nanotubi di base janus (JBNT) e fibronectina (FN). I JBNT, noti anche come Nanotubi di Rosetta (RTT), derivano da coppie di basi di DNA, in particolare timina e adenina,qui 5,6,7. Come si vede nella Figura 1, i nanotubi si formano quando sei molecole delle coppie di basi di DNA derivate si auto-assemblano tramite legami idrogeno per formare unpiano 6. Sei molecole vengono quindi impilate l'una sull'altra in un piano attraverso una forte interazione di pi-stacking7, che può essere lunga fino a 200-300 μm. I JBNT sono progettati per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN reagisca con loro.
FN è una glicoproteina adesiva ad alto peso molecolare, che può essere trovata nella matrice extracellulare (ECM)9. Questi possono mediare l'attaccamento delle cellule staminali ad altri componenti dell'ECM, in particolarecollagene 10. Abbiamo progettato JBNT per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN possa reagire con loro per formare la MN in pochi secondi attraverso il legame non covalente. Pertanto, la MN è una promettente bio-impalcatura da iniettare in un sito di frattura ossea che non potrebbe essere accessibile dalle impalcature fabbricate convenzionalmente. Qui, la MN iniettabile presenta un'eccellente capacità di migliorare l'ancoraggio hMSC in vitro, esibendo il loro potenziale di servire come impalcatura per la rigenerazione dei tessuti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sintesi dei JBNT
NOTA: Il monomero JBNT è stato preparato come pubblicato in precedenza11.
- Sintesi del composto A1
- Preparare una soluzione contenente 8,50 g di acido 2-cianoacetico e 9,80 g di etilcarbamato in 25 mL di toluene e 2,5 mL di N, N-dimetilformamide. Aggiungere 4,90 mL di cloruro di fosforile dropwise. Quindi scaldare la miscela a 70 °C e continuare a mescolare per 1,5 ore.
- Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente e versare 100 g di acqua ghiacciata. Estrarre lo strato acquoso con acetato di etile (3 x 250 mL) e lavare con 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo pallido.
- Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (3% di metanolo/diclorometano) per produrre 15,61 g di composto A1 come polvere bianca.
- Sintesi del composto A2
- Mescolare 3,12 g di composto A1 e 2,75 g di carbonato di potassio in 50 mL di N, N-dimetilformamide. Mescolare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Aggiungere 2,6 mL di disolfuro di carbonio alla sospensione di reazione. Continuare a mescolare per 4 ore.
- Aggiungere l'etanolo assoluto alla miscela di reazione a 0 °C. Filtrare il precipitato giallo e lavare con etere dietile. Asciugare sotto vuoto durante la notte per produrre 6,18 g di composto A2 come solido giallo pallido.
- Sintesi del composto A3
- Aggiungere 2,7 mL di ioduro di metile in 15 mL di acetonitrile. Inoltre, preparare separatamente una soluzione di composto A2 aggiungendo 6,18 g di A2 a 80 mL di acqua / acetonitrile (rapporto 7:3). Mescolare entrambe le soluzioni e mescolare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Scaldare la miscela di reazione a 95 °C e continuare a mescolare per 3 ore.
- Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente, quindi evaporare i volatili sotto vuoto.
- Estrarre il residuo 3x con 100 mL di acetato di etile e lavare con salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo.
- Sottosoggettare il solido giallo alla cromatografia della colonna flash del gel di silice (30% acetato/esani etilico) per produrre 4,52 g del composto A3 come solido giallo chiaro.
- Sintesi del composto A4
- Preparare la soluzione di alleilamina aggiungendo 925 μL di alleilamina in 20 mL di etanolo. Aggiungere questa soluzione dropwise alla soluzione del composto A3, preparato aggiungendo 3,14 g di A3 in 75 mL di etanolo assoluto, oltre 30 min. Quindi riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.
- Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente ed evaporare i volatili per dare un solido giallo.
- Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (50% di acetato/esani etilico al 2% di metanolo/diclorometano) per produrre 1,80 g di composto A4 come cristallo bianco.
- Sintesi del composto A5
- Aggiungere 2,05 g di cloridrato di guanidinio e 7,8 mL di etoossido di sodio (21 wt% in etanolo) in 14 mL di etanolo assoluto. Scaldare la miscela a 45 °C per 15 minuti.
- Filtrare il materiale insolubile e aggiungere il filtrato direttamente nella soluzione del composto A4, preparato aggiungendo 2,70 g di A4 in 40 mL di etanolo assoluto. Riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.
- Filtrare il precipitato per ottenere 2,65 g di composto A5 come solido bianco sconto.
- Sintesi del composto A6
- Aggiungere lentamente 24,9 mL di trietilammina alla miscela di liquami ottenuta aggiungendo 2,11 g di composto A5 e 1,10 g di 4-dimetilaminopiridina in 120 mL di tetraidrofurano oltre 1 min. Mescolare a temperatura ambiente per 2 minuti.
- Aggiungere 20,7 mL di di-tert-butil dicarbonato dropwise alla miscela di reazione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 40 h.
- Aggiungere 20 mL di acqua per spegnere la reazione. Evaporare i volatili sotto vuoto.
- Estrarre il residuo viscoso rosso con 500 mL di acetato di etile. Quindi, lavarlo con 250 mL di acqua, 75 mL di acido citrico al 10%, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare un solido rosso/arancione.
- Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani di etile allo 0-20%) per produrre 3,87 g di composto A6 come schiuma bianca.
- Sintesi del composto A7
- Aggiungere N-metilmorfolina N-ossido (50 wt.% in acqua, 1,64 mL) dropwise alla soluzione di composto A6 (2,93 g) in acetone/acqua (8:1, 58,5 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere tetraossido di osmio (soluzione acquosa al 4%) dropwise alla miscela per un periodo di 3 minuti e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.
- Spegnere la reazione con solfito di sodio acquoso da 1,0 M fino a quando la soluzione diventa incolore. Rimuovere i volatili sotto vuoto per provocare un liquame bianco in acqua. Estrarre il residuo con 350 mL di diclorometano e quindi lavare con 150 mL di acqua seguito da un lavaggio con 150 mL di salamoia.
- Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per produrre 2,45 g di composto A7 come solido bianco.
- Sintesi del composto A8
- Aggiungere 760 g di perioduro di sodio alla miscela di 1,36 g di composto A7 in 35 mL di diclorometano/acqua (6:1, 35 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 42 ore.
- Filtrare il materiale insolubile e concentrare il filtrato sotto vuoto. Estrarre il residuo risultante con 250 mL di diclorometano, quindi lavare con 100 mL di acqua e 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare il prodotto grezzo.
- Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (5-40% acetato/esani etilico, quindi 5% metanolo/diclorometano) per produrre 1,08 g di composto A8.
- Sintesi del composto A9
- Preparare una soluzione di 830 mg di composto A8 in 15 mL di 1,2-dicloroetano. Aggiungere la soluzione di dropwise alla miscela di 6-benzilossicarbonilamino-2-L-acido ammino-esanoico trimetilsilil estere etilico (649,5 mg) e N N-diisopropiletililammina (591 μL) in 24 mL di 1,2-dicloroetano oltre 3 min e mescolare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere 360,3 mg di triacetossiboroidro di sodio alla soluzione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.
- Dissetare la miscela di reazione con 6 mL di acqua. Estrarre la miscela di reazione 3x con 200 mL di diclorometano e lavare con 200 mL di acido citrico 10% in acqua, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia in questo ordine. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere il prodotto grezzo.
- Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani etilico al 5-30%) per produrre 885 mg di composto A9.
- Sintesi del monomero JBNT
- Sciogliere 0,54 g di composto A9 (0,54 g) in 10 mL di acido trifluoroacetico/soluzione di tioanisole al 94% e mescolare a temperatura ambiente per 72 ore.
- Aggiungere l'etere dietile (80 mL) alla miscela di reazione e centrifugare il precipitato verso il basso. Versare l'acido trifluoroacetico chiaro contenente supernatante e lavare il precipitato bianco con etere dietile e metanolo per produrre monomero JBNT grezzo da 168,6 mg(File supplementare 1).
- Purificare il monomero JBNT grezzo da una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con una colonna in fase inversa. Il programma di isolamento è elencato di seguito: SolventE A: 100% acqua; solvente B: acetonitrile al 100%; solvente C: pH=1 soluzione d'acqua HCl; portata: 3 mL/min (cfr. tabella 1).
- Raccogli il picco più grande a circa 7,2 minuti.
2. Fabbricazione per JBNT/FN
- Aggiungere 80 μL di soluzione acquosa JBNT da 1 mg/mL a 40 μL di soluzione acquosa FN da 1 mg/mL e pipetta più volte.
- Verificare la presenza di sospensioni solide bianche dopo pipettazione per circa 10 s.
NOTA: è stato girato un video per acquisire il processo di auto-assemblaggio di NM (Supplemental File 2).
3. Osservazione di esemplari lyophilizzati
NOTA: Questo passaggio viene eseguito per mostrare la struttura dell'impalcatura della MN realizzata con JBNT e FN.
- Preparare soluzioni FN, JBNT e FN/JBNT NM per l'osservazione dei materiali lyophilizzati. Diluire 10 μL di 100 μg/mL di FN con 40 μL di acqua distillata per fare una soluzione di 20 μg/mL di FN.
- Preparare 100 mg/mL di soluzione di JBNT diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 45 μL di acqua DI.
- Mescolare 10 μL di 100 μg/mL FN e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 35 μL di acqua DI per formare la soluzione di MN.
- Rivestire tre pozzi di micropiatte inferiori rotonde a 96 ben chiare rispettivamente con la soluzione FN, JBNT e NM. Ogni pozzo riceve 50 μL della soluzione.
- Eseguire la liofilizzazione, come descritto di seguito, per visualizzare la struttura dell'impalcatura della MN.
- Congelare la piastra a -80 °C durante la notte.
- Accendere lo strumento lyophilized e la pompa per vuoto.
- Premere il pulsante di raffreddamento per ridurre la temperatura del sistema a -50 °C.
- Mettere la piastra congelata nello strumento liofilizzato e chiudere tutte le aperture degli strumenti.
- Fare clic sul pulsante start per ridurre la pressione del sistema a 0,9 mbar.
- Dopo 4 ore, premere il pulsante di aerazione e aprire la valvola per aumentare la pressione del sistema alla pressione atmosferica.
- Estraere il piatto dal lyophilized instrument.
- Utilizzare un microscopio per osservare l'FN, i JBNT e la MN autoassemblata risultante. Scatta diverse fotografie con una fotocamera per i materiali.
4. Misurazione degli spettri di assorbimento
NOTA: utilizzare la modifica degli spettri per FN e JBNT per presentare il JBNT/FN NM12 autoassemblato.
- Mescolare 30 μL di 100 μg/mL FN con 15 μL di acqua distillata e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT per preparare la soluzione JBNT/FN NM. Le sospensioni solide bianche possono essere viste più volte dopo aver pipettato la soluzione.
NOTA: Le concentrazioni finali di JBNT e FN nella soluzione sono rispettivamente di 100 μg/mL e 60 μg/mL. Sono state inoltre preparate come soluzioni di controllo le soluzioni JBNT e FN alla stessa concentrazione a quella utilizzata nella soluzione NM. - Diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT con 45 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo JBNT.
- Diluire 30 μL di 100 μg/mL FN con 20 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo FN.
- Misurare gli spettri di assorbimento UV-vis delle soluzioni FN, JBNT e JBNT/FN NM con lo spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali)per caratterizzare l'assemblaggio di NM.
- Fate clic sul pulsante UV-Vis. Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarvi 2 μL di acqua distillata. Misuralo come vuoto da 190-850 nm.
- Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione FN. Misurare gli spettri di assorbimento UV-Vis della soluzione FN da 190 nm a 850 nm.
- Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione JBNT. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione JBNT da 190 nm a 850 nm.
- Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione di NM JBNT/FN. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione di NM JBNT/FN da 190 nm a 850 nm.
5. Preparazione della MN JBNT/FN per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
- Pulire diverse griglie prima della colorazione negativa con un detergente al plasma di base (vedere Tabella dei materiali).
- Eseguire la colorazione negativa per i campioni seguendo due diversi processi.
- Far cadere 3 μL di 1 mg/mL di soluzione acquosa di JBNT e 3 μL di soluzione di MN JBNT/FN su griglie separate e lasciarlo per 2 min. Quindi sciacquare ogni griglia con soluzione di 100 μL di acetato di uranile (UA) 0,5%. Scolare la soluzione in eccesso con carta da filtro e asciugare all'aria le griglie.
- Mescolare 9 μL di soluzione di NM JBNT/FN con 3 μL di soluzione di UA al 2,0% e pipettarla più volte. Pipettare la soluzione mista sulle griglie e tenerla sulle griglie per 2 minuti. Utilizzare una carta da filtro per rimuovere la soluzione mista dalle griglie e asciugare le griglie a temperatura ambiente.
- Infine, caratterizzare l'esemplare per JBNT, JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.1 e JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.2 con il TEM.
6. Saggio di funzione biologica in vitro
- Aggiungere 200 μL di controlli negativi (NC, PBS), JBNT, FN e le soluzioni NM JBNT/FN in un unico pozzo di una diapositiva a camera a 8 pozzi, rispettivamente.
- Congelare asciugare il coverglass a camera a 8 elementi con lo strumento liofilizzato per rivestire i materiali sul fondo dei pozzi. Il protocollo per la liofilizzazione è lo stesso del passaggio 3.5.
- Quindi aggiungere 10.000 cellule/pozzi hSPC (Passaggio 3) nei pozzi e incubarli per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2.
- Dopo l'incubazione, pipettare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi e risciacquare la coltura con soluzione 1x PBS.
- Aggiungere 100 μL della soluzione fissante ad ogni bene con le cellule e lasciare per 5 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.
- Diluire dall'1% Triton-X 100 allo 0,1%. Aggiungere 100 μL dello 0,1% di Tritone-X 100 ad ogni pozzo con le cellule e lasciare per 10 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.
- Diluire la rodimina Phalloidin a 1,65 μM. Aggiungere 100 μL di rodimina Phalloidin ad ogni pozzo con cellule e incubare il vetro di copertura a camera tenuto lontano dalla luce a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.
- Cattura le immagini cellulari con un microscopio fluorescente.
- Contare i numeri di cella nelle immagini fluorescenti per ogni gruppo. Calcolare la densità di adesione cellulare calcolando in media tre aree casuali in ogni pozzo.
- Presentare tutti i dati come ± deviazione standard (SD). Eseguire analisi statistiche utilizzando un test t a una coda, seguito da un'analisi della varianza (ANOVA) con p<0.05, che è considerata statisticamente significativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I nostri studi hanno scoperto che la formazione della MN di JBNT e FN è veloce, cosa che è avvenuta in 10 secondi. Come illustrato nella figura 2, il floccule bianco è stato ottenuto quando la soluzione JBNT è stata miscelata con la soluzione FN e pipettata più volte. Il processo di formazione della MN è completamente biomimetico. Non sono necessari stimoli esterni. Il processo di fabbricazione è molto più facile di quello di alcuni biomateriali emergenti, che si basa sulla luce ultravioletta o sull'iniziatore chimico per il collegamento incrociato13.
Abbiamo acquisito e analizzato le immagini della fotocamera di FN, JBNT e NM(Figura 3). Per il gruppo FN, ad eccezione delle brevi macchie bianche, non sono state osservate fibre lunghe. Gli ammassi corti erano gli agglomerati proteici costituiti da FN, il che indica che la struttura dell'impalcatura non può essere formata con FN da sola senza JBNT(Figura 3A). Come mostrato nella figura 3B, le fibre lunghe e più sottili indicano l'esistenza dei JBNT. La larghezza dei filamenti bianchi della MN è più ampia rispetto ai JBNT, il che indica che i JBNT e gli FN si sono incrociati formando la MN. La fibra di NM può crescere fino a diversi centimetri di lunghezza (Figura 3C).
Abbiamo ottenuto gli spettri UV-Vis per indicare l'assieme tra JBNT e FN. Come mostrato nella figura 4, I JBNT presentano due picchi di assorbimento rispettivamente a 220 nm e 280 nm. Rispetto ai JBNT, la MN JBNT/FN ha due picchi di assorbimento nella stessa posizione con un valore significativamente ridotto, che era proveniente da JBNT ma influenzato dai JBNT e FN auto-assemblati non covalenti nel mezzo.
Il TEM è stato utilizzato per caratterizzare la morfologia dei JBNT e della MN. Come mostrato nella figura 5A, i JBNT sono tubi sottili con diametri uniformi. In condizioni neutre, i JBNT vengono caricati positivamente mentre fn sono caricati negativamente. Quando miscelati, formavano una MN fibrosa lunga tramite interazioni di carica (Figura 5B). Quando il pH è inferiore al punto isoelettrico del FN (pI di 5.5-6.0), i bundle NM presentano l'auto-release a causa del FN caricato positivamente. Come illustrato nella figura 5C, se conservato in una soluzione con pH basso (4.0), la MN è stata sezionata e molti FN sono stati rilasciati dalla NM. L'FN distribuito insieme al nanotubo è anche una forte prova che la MN è stata fabbricata da JBNT e FN10.
Abbiamo esplorato l'effetto della MN JBNT/FN sull'adesione cellulare. Come illustrato nella figura 6, la densità di adesione delle celle del gruppo NM ha mostrato una differenza significativa (valore p <0,05) rispetto al controllo negativo. La differenza può essere che la MN è progettata per imitare morfologicamente ECM, che fornisce un'impalcatura per l'adesione cellulare14. L'ECM era composto da collageni e glicoproteine adesive cellulari, come la fibronectina15. Il collagene è stato presentato con la capacità di promuovere una maggiore adesione e proliferazione di hMSC16. Inoltre, la fibronectina ha dimostrato di migliorare l'adesione degli HMSC anche nel sito ferito15. L'imaging a fluorescenza ha inoltre dimostrato che l'aderenza agli hMSC del gruppo NM è aumentata in modo significativo rispetto al gruppo di controllo negativo (Figura 7)15,17.
Figura 1: Illustrazione schematica dell'auto-assemblaggio gerarchico dei JBNT con catena laterale di lysine.
Questa cifra viene ristampata con l'autorizzazione della pubblicazione precedente12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dimostrazione per il processo autoassemblato della MN.
(A) Soluzione FN. (B) JBNT mescolati con FN. Questa cifra viene ristampata con l'autorizzazione della pubblicazione precedente12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fotografie di Brightfield.
Fotografie brightfield di (A) FN (B) JBNT e (C) NM formate da JBNT e FN. Ogni area ha un diametro di 2 cm. Questa cifra viene ristampata con l'autorizzazione della pubblicazione precedente12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spettri di assorbimento di FN, JBNT e JBNT/FN NM.
Questa cifra è ristampata dalla pubblicazione precedente12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini TEM.
Immagini TEM di (A) JBNT (B) JBNT/FN NM e (C) rilasciate JBNT/FN NM. Questa cifra viene ristampata con l'autorizzazione della pubblicazione precedente12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi statistica dell'adesione cellulare.
La densità di adesione cellulare è stata registrata in questo esperimento. *p<0,01 rispetto ai controlli negativi. **p<0,05 rispetto al solo JBNT. N=3. Questa cifra viene ristampata con l'autorizzazione della pubblicazione precedente12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagini a fluorescenza.
Immagini a fluorescenza di (A) gli hSPC e (B) dell'hMSC incubato con i JBNT. (C) l'hMSC incubato con l'FN. (D) l'hMSC incubato con la MN JBNT/FN. Barra di scala: 100 μm. Questa cifra viene ristampata con l'autorizzazione della pubblicazione precedente12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ore | A% | B% | C% |
| 0,00 min | 98 | 0 | 2 |
| 15,00 min | 68 | 30 | 2 |
| 25,00 min | 8 | 90 | 2 |
| 26,00 min | 0 | 100 | 0 |
Tabella 1: Tempo di eluizione della sfumatura.
File supplementare 1: Schema per la sintesi del monomero JBNT. Clicca qui per scaricare questa cifra.
File supplementare 2: Video per l'auto-assemblaggio della NM FN/JBNT. Clicca qui per scaricare questo video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato una MN biomimetica auto-assemblata, che è stata formata con JBNT e FN ispirati al DNA. Durante la preparazione della soluzione JBNT, la polvere liofilizzata JBNT deve essere sciolta nell'acqua al posto del PBS perché pbs causerà l'agglomerazione di JBNT, che inibisce il loro assemblaggio. Inoltre, la MN dovrebbe anche essere assemblata in acqua se vogliamo osservare le strutture nano-fibrille della MN, perché il sale in PBS si impacchelerà con le fibre nm, il che può ridurre notevolmente la risoluzione delle immagini.
La MN ha mostrato un grande potenziale per servire come una nuova impalcatura di ingegneria tissutale, anche se sono stati fatti molti sforzi per fabbricare impalcature rigenerative tissutali, che sono state utilizzate per facilitare l'adesione e la differenziazione degli HMSC. Tuttavia, la maggior parte di questi materiali sono pre-realizzati con una forma specifica, come un'impalcatura stampata in 3D18,19. Come tale, non sono facili da impiantare in siti feriti che si trovano in profondità nell'articolazione. Tuttavia, la soluzione di MN qui può essere iniettata come liquido e quindi fungere da impalcatura per l'adesione cellulare.
Una limitazione è che la MN non è meccanicamente forte. A differenza dei polimeri, sono fabbricati tramite l'auto-assemblaggio di interazioni non covalenti, quindi non possono sopportare molto carico meccanico o tensione. D'altra parte, la struttura non covalente presenta anche un'ottima biodegradabilità e biocompatibilità adatta alle funzionibiologiche8,20,21 .
La MN iniettabile ha dimostrato un grande potenziale per fornire una posizione target e un'impalcatura per l'homing MSC per migliorare la guarigione delle fratture ossee nel corpo. Tuttavia, se iniettato nel sito ferito, la MN non covalente potrebbe non rimanere in vigore per molto tempo, il che può ridurre l'effetto terapeutico. In futuro, esploreremo per incorporare altri materiali (come gli idrogel) o per alternare le strutture nm per ottimizzare ulteriormente le proprietà dell'impalcatura NM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Il Dr. Yupeng Chen è co-fondatore di NanoDe Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto finanziariamente da NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e University of Connecticut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
