Summary
Målet med denne protokol er at vise samling af en biomimetisk nanomatrix (NM) med Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). Når co-dyrket med menneskelige mesenchymale stamceller (hMSCs), NMs udviser fremragende bioaktivitet i at tilskynde hMSCs vedhæftning.
Abstract
En biomimetisk NM blev udviklet til at fungere som et vævsteknisk biologisk stillads, som kan forbedre stamcelleforankring. Den biomimetiske NM er dannet af JBNTs og FN gennem selvmontering i en vandig løsning. JBNT'er måler 200-300 μm i længden med indre hydrofobe hule kanaler og ydre hydrofile overflader. JBNT'er er positivt ladet, og FNs er negativt opkrævet. Derfor, når de injiceres i en neutral vandig opløsning, bindes de sammen via ikke-ækvivalent binding for at danne NM-bundterne. Selvmonteringsprocessen afsluttes inden for få sekunder uden kemiske initiatorer, varmekilde eller UV-lys. Når NM-opløsningens pH-opløsning er lavere end det isoelektriske punkt i FNs (pI 5.5-6.0), vil NM-bundterne selvudløse på grund af tilstedeværelsen af positivt ladet FN.
NM er kendt for at efterligne den ekstracellulære matrix (ECM) morfologisk og dermed kan bruges som et injicerbart stillads, som giver en fremragende platform til at forbedre hMSC vedhæftning. Celletæthedsanalyse og fluorescensbilledbilledforsøg viste, at NMs øgede forankringen af hMSC'er betydeligt sammenlignet med den negative kontrol.
Introduction
Humane mesenchymale stamceller (hMSCs) har vist potentialet for selvfornyelse og selvdifferentiering langs forskellige mesenchymale afstamninger, som hjælper med regenerering og vedligeholdelse af væv1. Baseret på differentieringspotentialet betragtes hMSC'er som kandidater til mesenchymale vævsskader og hæmatopoietisk lidelsesterapi2. hMSCs har vist evnen til at fremme sårheling ved at øge væv reparation, angiogenese, og reducereinflammation 3. Men uden biokemiske eller biomaterialer bistand, effektiviteten for hMSCs at nå et mål væv og funktion på det ønskede sted er lav4. Selvom forskellige manipulerede stilladser er blevet brugt til at tiltrække hMSC'er til at klæbe til læsionerne, er nogle steder som vækstpladebrud midt i en lang knogle ikke let tilgængelige af de konventionelle præfabrikerede stilladser, som måske ikke passer perfekt ind i et uregelmæssigt formet skadet sted.
Her har vi udviklet et biomimetisk nanomateriale, der kan samle sig på stedet og blive injiceret til et svært tilgængeligt målområde. Det injicerbare biostillads NM består af Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). JBNTs, også kendt som Rosette Nanotubes (RNTs), er afledt af DNA base par, specielt thymine og adenin, her5,6,7. Som det ses i figur 1, dannes nanorørene , når seks molekyler af den afledte DNA-base parrer sig selv via brintbindinger for at danne et plan6. Seks molekyler stables derefter på hinanden i et plan via en stærk pi-stabling interaktion7, som kan være op til 200-300 μm i længden. JBNT'erne er designet til morfologisk at efterligne kollagenfibre, så FN vil reagere med dem.
FN er et klæbemiddelglycoprotein med høj molekylvægt, som findes i den ekstracellulære matrix (ECM)9. Disse kan mægle i fastgørelse af stamceller til andre komponenter i ECM, især kollagen10. Vi designede JBNT'er til morfologisk at efterligne kollagenfibre, så FN kan reagere med dem for at danne NM på få sekunder via ikke-ækvivalent binding. Derfor er NM et lovende biostillads, der skal injiceres i et knoglebrudssted, der ikke kunne være tilgængeligt for de konventionelt fremstillede stilladser. Her præsenterer den injicerbare NM en fremragende evne til at forbedre hMSC-forankring in vitro, der udviser deres potentiale til at tjene som stillads til vævsregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sammenfatning af JBNT'er
BEMÆRK: JBNT monomer blev udarbejdet som offentliggjort tidligere11.
- Syntese af sammensatte A1
- Der fremstilles en opløsning indeholdende 8,50 g 2 cyanoeddikesyre og 9,80 g ethylcarbamat i 25 ml toluen og 2,5 ml N, N-dimethylformamid. Der tilsættes 4,90 mL phosphorylchlorid på dråbe. Derefter opvarmes blandingen til 70 °C, og der omrørs under omrøring i 1,5 timer.
- Afkøl reaktionsblandingen til stuetemperatur og hæld i 100 g isvand. Ekstrakt det vandige lag med ethylacetat (3 x 250 ml), og vask med 100 ml saltlage. Tør det organiske lag over vandfri natriumsulfat, filtrere og fordampe flygtige stoffer under vakuum for at få et lysegult fast stof.
- Det gule faststof udsættes for silicagelsøjlekromatografi (3% methanol/dichlormethan) for at give 15,61 g sammensat A1 som hvidt pulver.
- Syntese af sammensatte A2
- Der blandes 3,12 g sammensatte A1 og 2,75 g kaliumcarbonat i 50 mL N, N-dimethylformamid. Rør ved stuetemperatur i 2 timer.
- Der tilsættes 2,6 mL kulstofafstand til reaktionsaffjedringen. Hold omrøring i 4 timer.
- Der tilsættes absolut ethanol til reaktionsblandingen ved 0 °C. Filtrer det gule bundfald ud og vask med diethyl æter. Tør under vakuum natten over for at give 6,18 g sammensat A2 som lysegult fast stof.
- Syntese af sammensatte A3
- Der tilsættes 2,7 ml methyljodid i 15 ml acetonistril. Forbered også separat en opløsning af forbindelse A2 ved at tilføje 6,18 g A2 til 80 ml vand / acetonitrile (7:3-forhold). Bland både opløsningerne og rør ved stuetemperatur i 30 min.
- Reaktionsblandingen opvarmes til 95 °C, og der omrørs under omrøring i 3 timer.
- Afkøl reaktionsblandingen til stuetemperatur, og fordamper derefter flygtige under vakuum.
- Remanensen ekstraheres 3x med 100 ml ethylacetat, og der vaskes med saltlage. Tør det organiske lag over vandfri natriumsulfat, filtrere og fordampe flygtige stoffer under vakuum for at opnå et gult fast stof.
- Det gule faststof udsættes for silicagelglimtkromatografi (30% ethylacetat/hexaner) for at give 4,52 g af forbindelsen A3 som lysegult fast stof.
- Syntese af sammensatte A4
- Allylaminopløsningen fremstilles ved at tilsætte 925 μL allylamin i 20 ml ethanol. Denne opløsning tilsættes dråbevis til opløsningen af forbindelsen A3, tilberedt ved at tilsætte 3,14 g A3 i 75 ml absolut ethanol over 30 min. Derefter opvarmes reaktionsblandingen for at reflukse i 16 timer.
- Afkøl reaktionsblandingen til stuetemperatur og fordampe flygtige for at give et gult fast stof.
- Det gule faststof udsættes for silicagelspaltekolonnekromatografi (50% ethylacetat/hexaner til 2% methanol/dichlormethan) for at give 1,80 g forbindelse A4 som en hvid krystal.
- Syntese af sammensatte A5
- Der tilsættes 2,05 g guanidiniumhydrochlorid og 7,8 ml natriumethoxid (21 wt% i ethanol) i 14 ml absolut ethanol. Blandingen opvarmes til 45 °C i 15 min.
- Det uopløselige materiale filtreres af, og filtratet tilsættes direkte til opløsningen af forbindelsen A4, fremstillet ved tilsætning af 2,70 g A4 i 40 ml absolut ethanol. Varm reaktionsblandingen til tilbagesvaling i 16 timer.
- Bundfaldet filtreres ud for at opnå 2,65 g sammensat A5 som et off-white fast stof.
- Syntese af sammensatte A6
- Der tilsættes langsomt 24,9 mL trietylamin til gylleblandingen ved at tilsætte 2,11 g sammensatte A5 og 1,10 g 4-Dimethylaminopyridin i 120 mL tetrahydrofuran over 1 min. Rør ved stuetemperatur i 2 min.
- Der tilsættes 20,7 mL di-tert-butyldicarbonat dropwise til reaktionsblandingen og under omrøring ved stuetemperatur i 40 timer.
- Tilsæt 20 mL vand for at slukke reaktionen. Fordampe flygtige stoffer under vakuum.
- Den røde tyktflydende rest udvindes med 500 ml ethylacetat. Derefter vaskes det ind med 250 mL vand, 75 mL 10% citronsyre, 2x med 200 mL vand, 200 mL mL mL mMættet natriumbicarbonat og 200 mL saltlage. Tør det organiske lag over vandfri natriumsulfat, filtrere og fordampe flygtige stoffer under vakuum for at give en rød / orange fast.
- Det faste stof for silicagel flash kolonnekromatografi (0-20% ethylacetat/hexaner) udsættes for at give 3,87 g sammensat A6 som hvidt skum.
- Syntese af sammensatte A7
- N-methylmorpholin N-oxid (50 wt.% i vand, 1,64 ml) dråbevis til opløsningen af forbindelsen A6 (2,93 g) i acetone/vand (8:1, 58,5 ml) og rør ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilsættes osmium tetraoxid (4% vandig opløsning) dråbevis til blandingen over en periode på 3 minutter og under omrøring ved stuetemperatur i 24 timer.
- Sluk reaktionen med 1,0 M vandig natriumsulfit, indtil opløsningen bliver farveløs. Fjern flygtige stoffer under vakuum for at resultere i en hvid gylle i vand. Remanensen ekstraheres med 350 ml dichlormethan, og der vaskes derefter med 150 ml vand efterfulgt af en vask med 150 ml saltlage.
- Tør det organiske lag over vandfrit natriumsulfat, filtrer og fordamp flygtige stoffer under vakuum for at give 2,45 g sammensat A7 som et hvidt fast stof.
- Syntese af sammensatte A8
- Der tilsættes 760 g natriumperid til blandingen af 1,36 g forbindelse A7 i 35 ml dichlormethan/vand (6:1, 35 ml) og omrøres ved stuetemperatur i 42 timer.
- Filtrer det uopløselige materiale af og koncentrer filtratet under vakuum. Ekstrakt den resulterende rest med 250 ml dichlormethan, og vask derefter med 100 ml vand og 100 ml saltlage. Det organiske lag tørres over vandfrit natriumsulfat, filtreres og fordampes flygtige stoffer under vakuum for at give råproduktet.
- Råproduktet underkastes silicagel flash kolonnekromatografi (5-40% ethylacetat/hexaner, derefter 5% methanol/dichlormethan) for at give 1,08 g forbindelse A8.
- Syntese af sammensatte A9
- Der fremstilles en opløsning på 830 mg sammensatte A8 i 15 ml 1,2-dichlorethan. Opløsningen af dropwise tilsættes til blandingen af 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-hexanosyre trimethylsilyl ethylester (649,5 mg) og N N-diisopropylethylamin (591 μL) i 24 ml 1,2-dichlorethan over 3 minutter og omrøres ved stuetemperatur i 15 min.
- Der tilsættes 360,3 mg natriumtriacetoxyborohydrid til opløsningen, og der omrørs under stuetemperatur i 24 timer.
- Sluk for reaktionsblandingen med 6 mL vand. Reaktionsblandingen ekstraheres 3x med 200 ml dichlormethan, og der vaskes med 200 ml 10% citronsyre i vand, 2x med 200 ml vand, 200 ml mL m Mættet natriumbicarbonat og 200 ml saltlage i nævnte rækkefølge. Det organiske lag tørres over vandfrit natriumsulfat, filtreres og fordampes flygtige stoffer under vakuum for at opnå råproduktet.
- Råproduktet underkastes silicagel flash kolonnekromatografi (5-30% ethylacetat/hexaner) for at give 885 mg forbindelse A9.
- Syntese af JBNT monomer
- 0,54 g forbindelse A9 (0,54 g) opløses i 10 ml af 94% trifluorodikesyre/thianisålopløsning, og der omrøres ved stuetemperatur i 72 timer.
- Der tilsættes diethylether (80 mL) til reaktionsblandingen, og bundfaldet centrifuges ned. Den klare trifluorodikesyre, der indeholder supernatant, hældes ud og vaskes det hvide bundfald med diethylether og methanol for at give 168,6 mg rå JBNT monomer (Supplerende fil 1).
- Den rå JBNT-monomer renses ved hjælp af en højtydende væskekromatografi (HPLC) med en omvendt fasekolonne. Isolationsprogrammet er angivet nedenfor: Solvent A: 100% vand; opløsningsmiddel B: 100% acetonitril; opløsningsmiddel C: pH=1 HCl vandopløsning; strømningshastighed: 3 mL/min (se tabel 1).
- Saml den største top på ca 7,2 min.
2. Fremstilling af JBNT/FN
- Der tilsættes 80 μL 1 mg/mL JBNT vandig opløsning til 40 μL 1 mg/mL FN vandig opløsning og pipette flere gange.
- Kontroller, om der er hvid fast affjedring efter pipettering i ca. 10 s.
BEMÆRK: En video blev optaget for at fange selvmonteringsprocessen for NM (Supplerende fil 2).
3. Observation af lyofile enheder
BEMÆRK: Dette trin udføres for at vise stilladsstrukturen af NM lavet af JBNTs og FN.
- Forbered FN-, JBNT- og FN/JBNT NM-løsninger til lyofileret materialeobservation. 10 μL FN fortyndes med 40 μL destilleret vand for at fremstille en FN-opløsning på 20 μg/mL.
- Der fremstilles 100 mg/mL opløsning af JBNT'er ved at fortynde 5 μL på 1 mg/mL JBNT'er i 45 μL DI-vand.
- Der blandes 10 μL 100 μg/mL FN og 5 μL 1 mg JBNT'er i 35 μL DI-vand for at danne NM-opløsningen.
- Coat tre brønde af 96-godt klare runde bundmikroplader med henholdsvis FN, JBNT-opløsningen og NM-opløsningen. Hver brønd modtager 50 μL af opløsningen.
- Udfør lyofilisering, som beskrevet nedenfor, for at visualisere NM's stilladsstruktur.
- Pladen fryses ved -80 °C natten over.
- Tænd for det lyofile instrument og vakuumpumpen.
- Tryk på afkølingsknappen for at reducere systemets temperatur til -50 °C.
- Sæt den frosne plade i det lyofile instrument og luk alle åbninger af instrumenterne.
- Klik på startknappen for at reducere systemtrykket til 0,9 mbar.
- Efter 4 timer skal du trykke på luftknappen og åbne ventilen for at øge systemtrykket til det atmosfæriske tryk.
- Tag pladen ud af det lyofile instrument.
- Brug et mikroskop til at observere FN, JBNTs og den resulterende selvsamlede NM. Tag flere fotografier med et kamera til materialerne.
4. Måling af absorptionsspektre
BEMÆRK: Brug ændringen af spektre for FN og JBNTs til at præsentere den selvsamlede JBNT / FN NM12.
- Der blandes 30 μL på 100 μg/mL FN med 15 μL destilleret vand og 5 μL på 1 mg/mL JBNT'er til klargøring af JBNT/FN NM-opløsningen. Hvid fast affjedring kan ses efter pipettering af opløsningen flere gange.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer af JBNT'er og FN i opløsningen er henholdsvis 100 μg/mL og 60 μg/mL. JBNT'er og FN-løsninger i samme koncentration som den, der blev anvendt i NM-løsningen, blev også fremstillet som styringsløsninger. - 5 μL JBNT'er på 1 mg/mL fortyndes med 45 μL destilleret vand for at forberede JBNT-kontrolopløsningen.
- 30 μL fortyndes af 100 μg/mL FN med 20 μL destilleret vand for at forberede FN-kontrolopløsningen.
- Uv-vis absorptionsspektre fra FN-, JBNT- og JBNT/FN NM-løsninger måles med spektrofotometeret (se Materialetabel) for at karakterisere samlingen af NM.
- Klik på UV-Vis-knappen. Testfladen på spektrofotometeret rengøres, og der tabes 2 μL destilleret vand på det. Mål det som tomt fra 190-850 nm.
- Testoverfladen på spektrofotometeret rengøres, og der tabes 2 μL FN-opløsning på det. UV-Vis absorptionsspektre af FN-opløsning fra 190 nm til 850 nm.
- Testfladen på spektrofotometeret rengøres, og der tabes 2 μL JBNT-opløsning på den. Absorptionsspektre fra JBNT-opløsning fra 190 nm til 850 nm måles.
- Testoverfladen på spektrofotometeret rengøres, og JBNT/FN NM-opløsningen tabes på den. Absorptionsspektre fra JBNT/FN NM-opløsning fra 190 nm til 850 nm måles.
5. Udarbejdelse af JBNT/FN NM til elektronisk transmissionsmikroskopi (TEM)
- Rengør flere gitre før negativ farvning med en grundlæggende plasmarenser (se Materialetabel).
- Udfør den negative farvning for prøverne efter to forskellige processer.
- 3 μL JBNT/FN NM-opløsningen tabes 3 μL af 1 mg/mL JBNT-vandig opløsning og efterlades i 2 min. Skyl derefter hvert gitter med 100 μL 0,5% uranylacetatopløsning (UA). Dræn den overskydende opløsning med filterpapir og lufttørre gitrene.
- Der blandes 9 μL JBNT/FN NM-opløsning med 3 μL 2,0% UA-opløsning og pipettes flere gange. Pipetter den blandede opløsning på gitrene og hold den på gitrene i 2 min. Brug et filterpapir til at fjerne den blandede opløsning fra gitrene og tørre gitrene ved stuetemperatur.
- Endelig karakterisere prøven for JBNTs, JBNT / FN NM farves med trin 5.2.1, og JBNT / FN NM farves med trin 5.2.2 med TEM.
6. In vitro biologisk funktion assay
- Der tilsættes 200 μL negative styringer (NC, PBS), JBNT'er, FN og JBNT/FN NM-løsningerne til en brønd af henholdsvis et 8-brønds dias.
- Frys 8-godt chambered coverglass med lyophilized instrument til pels materialer på bunden af brønde. Protokollen for frysetørring er den samme som trin 3.5.
- Derefter tilsættes 10.000 celler/brønde hMSCs (Passage 3) i brøndene og inkuber dem i 24 timer ved 37 °C med 5% CO2.
- Efter inkubation pipettes cellekulturmediet ud af brøndene og skylles kulturen med 1x PBS-opløsning.
- Der tilsættes 100 μL af fikseringsopløsningen til hver brønd med celler og efterlades i 5 min. Skyl cellerne forsigtigt med 1x PBS to gange.
- Fortynd 1% Triton-X 100 til 0,1%. Tilsæt 100 μL på 0,1% Triton-X 100 til hver brønd med celler og lad i 10 min. Skyl cellerne forsigtigt med 1x PBS to gange.
- Rhodamin-falloidinen fortyndes til 1,65 μM. Der tilsættes 100 μL Rhodamin Phalloidin til hver brønd med celler og inkuberes det chambererede dækglas, der holder sig fra lys ved stuetemperatur i 30 min. Skyl cellerne forsigtigt med 1x PBS to gange.
- Tag cellebillederne med et fluorescerende mikroskop.
- Tæl cellenumrene på fluorescerende billeder for hver gruppe. Beregn celle vedhæftningstætheden ved at beregne gennemsnittet af tre tilfældige områder i hver brønd.
- Præsenter alle data som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Udfør statistiske analyser ved hjælp af en one-tailed t-test, efterfulgt af variansanalyse (ANOVA) med p<0,05, som anses for statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores undersøgelser opdagede, at dannelsen af NM af JBNTs og FN er hurtig, hvilket skete på 10 sekunder. Som vist i figur 2blev der opnået hvid floccule, da JBNT-opløsningen blev blandet med FN-opløsningen og pipetteret flere gange. Dannelsen af NM er helt biomimetisk. Ingen eksterne stimuli er nødvendige. Fremstillingsprocessen er meget lettere end for nogle nye biomaterialer, som er baseret på ultraviolet lys eller kemisk initiator til krydsning13.
Vi fangede og analyserede kamerabillederne af FN, JBNTs og NM (Figur 3). For FN-gruppen, bortset fra korte hvide pletter, blev der ikke observeret lange fibre. De korte klynger var protein agglomerationer bestående af FN, hvilket indikerer, at stilladsstrukturen ikke kan dannes med FN alene uden JBNTs (Figur 3A). Som vist i figur 3Bangiver de lange og tyndere fibre eksistensen af JBNT'er. Bredden af NM's hvide tråde er bredere sammenlignet med JBNT'er, hvilket indikerer, at JBNT'erne og FN krydsede hinanden og dannede NM. NM-fiberen kan vokse op til flere centimeter i længden (Figur 3C).
Vi fik UV-Vis spektre til at angive samlingen mellem JBNTs og FN. Som det fremgår af figur 4, udviser JBNT'er to absorptionstoppe ved henholdsvis 220 nm og 280 nm. Sammenlignet med JBNT'er har JBNT/FN NM to absorptionstoppe på samme sted med en betydeligt reduceret værdi, som var fra JBNT'er, men påvirket af de ikke-kovalent selvsamlede JBNT'er og FN derimellem.
TEM blev brugt til at karakterisere morfologien af JBNT'erne og NM. Som vist i figur 5Aer JBNT'erne slanke rør med ensartede diametre. Under neutrale forhold bliver JBNT'er positivt opladet, mens FN er negativt opladet. Når de blev blandet, dannede de lang fibroid NM via opladningsinteraktioner (Figur 5B). Når pH er lavere end det isoelektriske punkt i FN (pI på 5,5-6,0), NM bundter nuværende selvudgivelse på grund af positivt ladede FN. Som vist i figur 5C, når bevaret i en opløsning med lav pH (4.0), NM blev dissembled, og en masse FN blev frigivet fra NM. FN distribueret sammen med nanorør er også et stærkt bevis på, at NM blev fremstillet af JBNTs og FN10.
Vi undersøgte effekten af JBNT / FN NM på celle vedhæftning. Som vist i figur 6viste celletilhæftningstætheden i NM-gruppen signifikant forskelsværdi (p-værdi <0,05) sammenlignet med den negative kontrol. Forskellen kan skyldes, at NM er designet til morfologisk at efterligne ECM, som giver et stillads til cellevedhæftning14. ECM bestod af kollagener og celleklæbende glycoproteiner, såsom fibronectin15. Kollagen er blevet præsenteret for evnen til at fremme højere vedhæftning og spredning af hMSCs16. Derudover har fibronectin vist sig at forbedre hMSCs vedhæftning i det skadede sted samt15. Fluorescensbilleddannelse viste også , at NM-gruppens overholdelse af HMSCs steg betydeligt i forhold til den negative kontrolgruppe (figur 7)15,17.
Figur 1: Skematisk illustration af JBNT'ernes hierarkiske selvsamling med en lysinsidekæde.
Dette tal udskrives igen med tilladelse fra den forrige publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Demonstration for NM's selvsamlede proces.
(A)FN-løsning. (B) JBNTs blandet med FN. Dette tal udskrives igen med tilladelse fra den forrige publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Brightfield fotografier.
Brightfield fotografier af (A) FN (B) JBNTs og (C) NM dannet af JBNTs og FN. Hvert område har en diameter på 2 cm. Dette tal udskrives igen med tilladelse fra den forrige publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Absorptionsspektre af FN, JBNT'er og JBNT/FN NM.
Dette tal genoptrykkes fra den forrige publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: TEM-billeder.
TEM billeder af (A) JBNTs (B) JBNT / FN NM, og (C) frigivet JBNT / FN NM. Dette tal udskrives igen med tilladelse fra den forrige publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Statistisk analyse af cellulær vedhæftning.
Celle vedhæftningstætheden blev registreret i dette eksperiment. *p<0,01 sammenlignet med negative kontrolelementer. **p<0,05 sammenlignet med JBNT alene. N=3. Dette tal udskrives igen med tilladelse fra den forrige publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Fluorescensbilleder.
Fluorescensbilleder af (A) hMSC'erne og (B) hMSC inkuberet med JBNTs. (C) hMSC inkuberet med FN. (D) hMSC inkuberet med JBNT / FN NM. Skalastang: 100 μm. Dette tal udskrives igen med tilladelse fra den forrige publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tidspunkt | A% | B% | C% |
| 0,00 min. | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 min. | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 min. | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 min. | 0 | 100 | 0 |
Tabel 1: Gradueringstid.
Supplerende fil 1: Ordning for syntese af JBNT monomer. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende fil 2: Video til selvmontering af FN/JBNT NM. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse udviklede vi en selvsamlet biomimetisk NM, som blev dannet med DNA-inspirerede JBNT'er og FN. Ved tilberedning af JBNT-opløsningen skal det JBNT-lyofile pulver opløses i vandet i stedet for PBS, fordi PBS vil forårsage agglomeration af JBNT'er, hvilket hæmmer deres samling. Desuden bør NM også samles i vand, hvis vi ønsker at observere nano-fibril strukturer NM, fordi saltet i PBS vil bundt med NM fibre, hvilket i høj grad kan reducere opløsningen af billederne.
NM har vist et stort potentiale til at fungere som et nyt vævsteknisk stillads, selv om der er gjort en stor indsats for at fremstille vævsregenerative stilladser, som blev brugt til at lette hMSCs vedhæftning og differentiering. Men de fleste af disse materialer er præ-made med en bestemt form, såsom en 3D printet stillads18,19. Som sådan er de ikke nemme at blive implanteret i skadede steder, der er dybt i leddet. NM-opløsningen her kan dog injiceres som en væske og derefter tjene som stillads til celle vedhæftning.
En begrænsning er, at NM ikke er mekanisk stærk. I modsætning til polymerer fremstilles de via selvmontering af ikke-ækvivalente interaktioner, så de kan ikke bære meget mekanisk belastning eller spænding. På den anden side præsenterer den ikke-ækvivalente struktur også meget god bionedbrydelighed og biokompatibilitet egnet til biologiske funktioner8,20,21.
Den injicerbare NM har vist et stort potentiale for at give et mål placering og et stillads for MSC homing at forbedre knoglebrud healing i kroppen. Når NM injiceres på det skadede sted, må det ikke-ækvivalente NM dog ikke blive på plads i lang tid, hvilket kan reducere den terapeutiske virkning. I fremtiden vil vi udforske at indarbejde andre materialer (såsom hydrogels) eller at skifte NM strukturer til yderligere at optimere egenskaberne af NM stilladset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Yupeng Chen er medstifter af NanoDe Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Dette arbejde er økonomisk støttet af NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) og University of Connecticut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
