Het doel van dit protocol is om de assemblage van een biomimetische nanomatrix (NM) met Janus basis nanobuisjes (JBNT’s) en fibronectine (FN) te tonen. Wanneer ze worden gekweekt met menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs), vertonen de NMs uitstekende bioactiviteit bij het aanmoedigen van hMSCs-adhesie.
Een biomimetische NM werd ontwikkeld om te dienen als een weefsel-engineering biologische steiger, die stamcelverankering kan verbeteren. De biomimetische NM wordt gevormd uit JBNT’s en FN door zelfassemblage in een waterige oplossing. JBNT’s meten 200-300 μm lang met binnenste hydrofobe holle kanalen en buitenste hydrofiele oppervlakken. JBNT’s worden positief geladen en FN’s worden negatief geladen. Daarom worden ze, wanneer ze in een neutrale waterige oplossing worden geïnjecteerd, aan elkaar gebonden via niet-covalente binding om de NM-bundels te vormen. Het zelfassemblageproces is binnen enkele seconden voltooid zonder chemische initiators, warmtebron of UV-licht. Wanneer de pH van de NM-oplossing lager is dan het iso-elektrische punt van FN’s (pI 5,5-6,0), zullen de NM-bundels zichzelf vrijgeven vanwege de aanwezigheid van positief geladen FN.
NM staat erom bekend de extracellulaire matrix (ECM) morfologisch na te bootsen en kan daarom worden gebruikt als een injecteerbare steiger, die een uitstekend platform biedt om de hMSC-hechting te verbeteren. Celdichtheidsanalyse en fluorescentiebeeldvormingsexperimenten wezen erop dat de NMs de verankering van hMS’s aanzienlijk verhoogden in vergelijking met de negatieve controle.
Menselijke mesenchymale stamcellen (hMC’s) hebben het potentieel voor zelfvernieuwing en zelfdifferentiatie langs verschillende mesenchymale afstammingen aangetoond, wat helpt bij de regeneratie en het onderhoud van weefsels1. Op basis van het differentiatiepotentieel worden hMC’s beschouwd als kandidaten voor mesenchymale weefselletsels en hematopoietische stoornistherapie2. hMC’s hebben het vermogen aangetoond om wondgenezing te bevorderen door weefselherstel, angiogenese en ontsteking te verminderen3. Zonder hulp van biochemische of biomaterialen is de efficiëntie voor de hMC’s om een doelweefsel te bereiken en op de gewenste locatie te functioneren echter laag4. Hoewel verschillende ontworpen steigers zijn gebruikt om hMC’s aan te trekken om zich aan de laesies te hechten, zijn sommige plaatsen zoals groeiplaatbreuk, in het midden van een lang bot, niet gemakkelijk toegankelijk door de conventionele voorgefabriceerde steigers, die mogelijk niet perfect passen in een onregelmatig gevormde gewonde plaats.
Hier hebben we een biomimetisch nanomateriaal ontwikkeld dat zichzelf in situ kan assembleren en kan worden geïnjecteerd in een moeilijk te bereiken doelgebied. De injecteerbare biosteiger NM bestaat uit Janus base nanotubes (JBNTs) en fibronectine (FN). JBNT’s, ook bekend als de Rosette Nanotubes (RNT’s), zijn afgeleid van DNA-basisparen, met name thymine en adenine, hier5,6,7. Zoals te zien is in figuur 1, worden de nanobuisjes gevormd wanneer zes moleculen van de afgeleide DNA-basisparen zichzelf assembleren via waterstofbindingen om een vlak te vormen6. Zes moleculen worden vervolgens op elkaar gestapeld in een vlak via een sterke pi-stapelinteractie7, die tot 200-300 μm lang kan zijn. De JBNT’s zijn ontworpen om collageenvezels morfologisch na te bootsen, zodat FN ermee zal reageren.
FN is een lijmglycoproteïne met een hoog molecuulgewicht, dat te vinden is in de extracellulaire matrix (ECM)9. Deze kunnen de aanhechting van stamcellen aan andere componenten van het ECM bemiddelen, met name collageen10. We hebben JBNT’s ontworpen om collageenvezels morfologisch na te bootsen, zodat FN ermee kan reageren om NM in een paar seconden te vormen via niet-covalente binding. Daarom is NM een veelbelovende biosteiger die in een botbreukplaats wordt geïnjecteerd die niet toegankelijk is voor de conventioneel vervaardigde steigers. Hier biedt de injecteerbare NM een uitstekend vermogen om hMSC-verankering in vitro te verbeteren, waarbij ze hun potentieel vertonen om te dienen als een steiger voor weefselregeneratie.
In deze studie ontwikkelden we een zelfgemonteerde biomimetische NM, die werd gevormd met DNA-geïnspireerde JBNT’s en FN. Bij het bereiden van de JBNT-oplossing moet het JBNT-gelyophiliseerde poeder in het water worden opgelost in plaats van PBS, omdat PBS agglomeratie van JBNT’s zal veroorzaken, wat hun assemblage remt. Bovendien moet de NM ook in water worden geassembleerd als we de nanofibrillerende structuren van de NM willen observeren, omdat het zout in PBS zal bundelen met NM-vezels, wat de resolutie van de beeld…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt financieel ondersteund door NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) en University of Connecticut.
1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
96-well plate | Corning | 353072 | |
absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
silica gel | TCI America | S0821 | |
sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |