Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.
Ein biomimetisches NM wurde entwickelt, um als gewebetechnisches biologisches Gerüst zu dienen, das die Stammzellverankerung verbessern kann. Das biomimetische NM wird aus JBNTs und FN durch Selbstmontage in wässriger Lösung gebildet. JBNTs messen 200-300 m lang mit inneren hydrophoben Hohlkanälen und äußeren hydrophilen Oberflächen. JBNTs sind positiv geladen und FNs sind negativ geladen. Daher werden sie, wenn sie in eine neutrale wässrige Lösung injiziert werden, über nicht kovalente Bindungen zu den NM-Bündeln zusammengebunden. Der Selbstmontageprozess wird innerhalb weniger Sekunden ohne chemische Initiatoren, Wärmequelle oder UV-Licht abgeschlossen. Wenn der pH-Wert der NM-Lösung niedriger ist als der isoelektrische Punkt von FNs (pI 5.5-6.0), werden sich die NM-Bundles aufgrund des Vorhandenseins von positiv geladenem FN selbst freisetzen.
NM ist dafür bekannt, die extrazelluläre Matrix (ECM) morphologisch nachzuahmen und kann daher als injizierbares Gerüst verwendet werden, das eine hervorragende Plattform zur Verbesserung der hMSC-Haftung bietet. Zelldichteanalysen und Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente zeigten, dass die NMs die Verankerung von hMSCs im Vergleich zur Negativkontrolle signifikant erhöhten.
Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) haben das Potenzial für Selbsterneuerung und Selbstdifferenzierung entlang verschiedener mesenchymaler Abstammunggezeigt, was bei der Regeneration und Erhaltung von Geweben hilft1. Basierend auf dem Differenzierungspotenzial werden hMSCs als Kandidaten für mesenchymale Gewebeverletzungen und hämatopoetische Störungstherapie2betrachtet. hMSCs haben die Fähigkeit gezeigt, die Wundheilung durch Erhöhung der Gewebereparatur, Angiogenese und Verringerung der Entzündung3zu fördern. Ohne hilfe durch biochemische oder biomaterialien ist die Effizienz der hMSCs, ein Zielgewebe zu erreichen und am gewünschten Ort zu funktionieren, gering4. Obwohl verschiedene technische Gerüste verwendet wurden, um hMSCs anzuziehen, um an den Läsionen festzuhängen, sind einige Stellen wie Wachstumsplattenfrakturen in der Mitte eines langen Knochens nicht leicht zugänglich durch die herkömmlichen vorgefertigten Gerüste, die möglicherweise nicht perfekt in eine unregelmäßig geformte verletzte Stelle passen.
Hier haben wir ein biomimetisches Nanomaterial entwickelt, das sich vor Ort selbst zusammenbauen und in ein schwer erreichbares Zielgebiet injiziert werden kann. Das injizierbare Biogerüst NM besteht aus Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN). JBNTs, auch bekannt als Rosette Nanotubes (RNTs), werden aus DNA-Basenpaaren abgeleitet, insbesondere Thymin und Adenin, hier5,6,7. Wie in Abbildung 1dargestellt, bilden sich die Nanoröhren, wenn sich sechs Moleküle der abgeleiteten DNA-Basenpaare selbst über Wasserstoffbindungen zu einer Ebene6zusammensetzen. Sechs Moleküle werden dann über eine starke Pi-Stacking-Wechselwirkung7,die bis zu 200-300 m lang sein kann, in einer Ebene übereinander gestapelt. Die JBNTs wurden entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagiert.
FN ist ein hochmolekulares Klebeglykoprotein, das in der extrazellulären Matrix (ECM)9zu finden ist. Diese können die Befestigung von Stammzellen an anderen Komponenten des ECM, insbesondere Kollagen10, vermitteln. Wir haben JBNTs entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagieren kann, um NM in wenigen Sekunden durch nicht kovalente Bindung zu bilden. Daher ist NM ein vielversprechendes Biogerüst, das in eine Knochenbruchstelle injiziert werden kann, die von den konventionell gefertigten Gerüsten nicht zugänglich ist. Hier präsentiert das injizierbare NM eine hervorragende Fähigkeit, die hMSC-Verankerung in vitro zu verbessern und zeigt ihr Potenzial, als Gerüst für die Geweberegeneration zu dienen.
In dieser Studie entwickelten wir ein selbstzusammengesetztes biomimetisches NM, das mit DNA-inspirierten JBNTs und FN gebildet wurde. Bei der Herstellung der JBNT-Lösung sollte das lyophilisierte JBNT-Pulver anstelle von PBS ins Wasser aufgelöst werden, da PBS eine Agglomeration von JBNTs verursacht, was ihre Montage hemmt. Darüber hinaus sollte das NM auch in Wasser montiert werden, wenn wir die nanofibrilen Strukturen des NM beobachten wollen, da das Salz in PBS mit NM-Fasern gebündelt wird, was die Auflösung der…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird finanziell unterstützt durch NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) und University of Connecticut.
1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
96-well plate | Corning | 353072 | |
absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
silica gel | TCI America | S0821 | |
sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |