Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.
Abstract
NM ביומימטי פותחה כדי לשמש פיגום ביולוגי הנדסת רקמות, אשר יכול לשפר את עגינה תאי גזע. ה- NM הביומימטי נוצר מ- JBNTs ו- FN באמצעות הרכבה עצמית בתמיסה מימית. JBNTs למדוד 200-300 מיקרומטר אורך עם ערוצי חלול הידרופובי פנימי משטחים הידרופיליים החיצוניים. JBNTs מחויבים באופן חיובי ו- FNs מחויבים באופן שלילי. לכן, כאשר מוזרק לתוך פתרון מימית ניטרלי, הם מלוכדים יחד באמצעות מליטה noncovalent כדי ליצור את חבילות NM. תהליך ההרכבה העצמית הושלם תוך שניות ספורות ללא יוזמים כימיים, מקור חום או אור UV. כאשר רמת ה- pH של פתרון NM נמוכה מהנקודה האיזואלקטרית של FNs (pI 5.5-6.0), חבילות NM יופצו באופן עצמאי עקב נוכחות של FN טעון באופן חיובי.
NM ידוע לחקות את המטריצה חוץ תאית (ECM) מורפולוגית ולכן, יכול לשמש פיגום להזרקה, אשר מספק פלטפורמה מצוינת כדי לשפר את הידבקות hMSC. ניתוח צפיפות התא וניסויי הדמיית פלואורסצנטיות הצביעו על כך שה- NMs הגדילו באופן משמעותי את העיגון של רכיבי HMSCs בהשוואה לבקרה השלילית.
Introduction
תאי גזע mesenchymal האנושי (hMSCs) הראו את הפוטנציאל להתחדשות עצמית ובידול עצמי לאורך שושלת mesenchymal שונים, אשר מסייע התחדשות ותחזוקה שלרקמות 1. בהתבסס על פוטנציאל הבידול, hMSCs נחשבים כמועמדים לפציעות רקמה mesenchymal וטיפול בהפרעה hematopoietic2. hMSCs הראו את היכולת לקדם ריפוי פצעים על ידי הגדלת תיקון רקמות, אנגיוגנזה, והפחתת דלקת3. עם זאת, ללא סיוע ביוכימי או ביו-חומרים, היעילות של hMSCs להגיע לרקמת יעד ולתפקד במיקום הרצוי היא נמוכה4. למרות פיגומים מהונדסים שונים נוצלו כדי למשוך hMSCs לדבוק בנגעים, אתרים מסוימים כגון שבר צלחת צמיחה, באמצע עצם ארוכה, אינם נגישים בקלות על ידי פיגומים קונבנציונליים מראש מפוברק, אשר לא יכול להתאים באופן מושלם לתוך אתר פצוע בצורה לא סדירה.
כאן, פיתחנו ננו-חומר ביו-מימטי שיכול להרכיב את עצמו במקום ולהזריק אותו לאזור מטרה שקשה להגיע אליו. NM ביו פיגום להזרקה מורכב צינורות בסיס יאנוס (JBNTs) ו פיברונקטין (FN). JBNTs, הידוע גם בשם צינורות רוזט (RNTs), נגזרים זוגות בסיס DNA, במיוחד תימין אדנין, כאן5,6,7. כפי שניתן לראות באיור 1, הננו-צינוריות נוצרות כאשר שש מולקולות של בסיס הדנ"א הנגזר מרכיבות את עצמן באמצעות קשרי מימן ויוצרותמישור 6. שש מולקולות נערמות זו על זו במישור באמצעות אינטראקציית pi-stacking חזקה7, אשר יכול להיות עד 200-300 מיקרומטר אורך. JBNTs נועדו לחקות מורפולוגית סיבי קולגן כך FN יגיב איתם.
FN הוא דבק במשקל מולקולרי גבוה גליקופרוטאין, אשר ניתן למצוא במטריצה חוץ תאית (ECM)9. אלה יכולים לתווך את ההחזקה של תאי גזע לרכיבים אחרים של ECM, במיוחד קולגן10. עיצבנו JBNTs לחקות סיבי קולגן באופן מורפולוגי כך FN יכול להגיב איתם כדי ליצור NM בעוד כמה שניות באמצעות מליטה noncovalent. לכן, NM הוא ביו פיגום מבטיח להיות מוזרק לתוך אתר שבר עצם כי לא יכול להיות נגיש על ידי פיגומים מפוברק קונבנציונלי. כאן, NM להזרקה מציג יכולת מצוינת כדי לשפר את מעגן hMSC במבחנה, מציג את הפוטנציאל שלהם לשמש פיגום עבור התחדשות רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של JBNTs
הערה: מונומר JBNT הוכן כפי שפורסם בעבר11.
- סינתזה של תרכובת A1
- הכן פתרון המכיל 8.50 גרם של חומצה 2-ציאנואצטית ו 9.80 גרם של אתילקרבמאט ב 25 מ"ל של טולואן ו 2.5 מ"ל של N, N-dimethylformamide. הוסף 4.90 מ"ל של זרחן כלוריד dropwise. לאחר מכן מחממים את התערובת ל 70 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 1.5 שעות.
- מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ויוצקים פנימה 100 גרם מי קרח. לחלץ את השכבה מימית עם אצטט אתיל (3 x 250 מ"ל), ולשטוף עם 100 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים נדיפים תחת ואקום כדי לקבל מוצק צהוב חיוור.
- הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (3% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 15.61 גרם של תרכובת A1 כאבקה לבנה.
- סינתזה של תרכובת A2
- מערבבים 3.12 גרם של תרכובת A1 ו 2.75 גרם של אשלגן פחמתי ב 50 מ"ל של N, N-דימתילפורממיד. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.
- הוסף 2.6 מ"ל של פחמן דיסולפיד להשעיית התגובה. ממשיכים לבחוש במשך 4 שעות.
- מוסיפים אתנול מוחלט לתערובת התגובה ב 0 מעלות צלזיוס. מסננים את הצהוב מזרזים החוצה ולשטוף עם אתר diethyl. יבש תחת ואקום בן לילה כדי להניב 6.18 גרם של תרכובת A2 כמו מוצק צהוב חיוור.
- סינתזה של תרכובת A3
- הוסף 2.7 מ"ל של מתיל יודיד ב 15 מ"ל של אצטוניטריל. כמו כן, בנפרד להכין פתרון של תרכובת A2 על ידי הוספת 6.18 גרם של A2 כדי 80 מ"ל של מים / אצטוניטריל (יחס 7:3). מערבבים את שני הפתרונות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- מחממים את תערובת התגובה ל 95 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 3 שעות.
- מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר, ואז מתאדים את הנדיפים תחת ואקום.
- לחלץ את השאריות 3x עם 100 מ"ל של אתיל אצטט ולשטוף עם מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג מוצק צהוב.
- הכפיף את מוצק צהוב כדי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (30% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 4.52 גרם של המתחם A3 כמו מוצק צהוב בהיר.
- סינתזה של תרכובת A4
- הכן פתרון אליאמין על ידי הוספת 925 μL של אליאמין ב 20 מ"ל של אתנול. הוסף פתרון זה dropwise לפתרון של תרכובת A3, מוכן על ידי הוספת 3.14 גרם של A3 ב 75 מ"ל של אתנול מוחלט, מעל 30 דקות. לאחר מכן מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.
- מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ומאדים את הנדיפים כדי לתת מוצק צהוב.
- הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (50% אתיל אצטט/הקסנים ל-2% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.80 גרם של תרכובת A4 כקריסטל לבן.
- סינתזה של תרכובת A5
- הוסף 2.05 גרם של גואנידיניום הידרוכלוריד ו 7.8 מ"ל של נתרן אתוקסיד (21 wt% באתנול) ב 14 מ"ל של אתנול מוחלט. מחממים את התערובת ל 45 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- לסנן את החומר מסיס ולהוסיף את הסינון ישירות לתוך הפתרון של תרכובת A4, מוכן על ידי הוספת 2.70 גרם של A4 ב 40 מ"ל אתנול מוחלט. מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.
- לסנן את המשקעים החוצה כדי לקבל 2.65 גרם של תרכובת A5 כמו מוצק לבן.
- סינתזה של תרכובת A6
- הוסף 24.9 מ"ל של טריאתילאמין לאט לתערובת תרחיף המתקבל על ידי הוספת 2.11 גרם של תרכובת A5 ו 1.10 גרם של 4-דימתילאמינופירידין ב 120 מ"ל של טטרהידרופורן מעל 1 דקות. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
- מוסיפים 20.7 מ"ל של די-טרט-בוטיל דיקרבונט לתערובת התגובה וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 40 שעות.
- הוסף 20 מ"ל של מים כדי להרוות את התגובה. לאדות את volatiles תחת ואקום.
- לחלץ את שאריות צמיג אדום עם 500 מ"ל של אתיל אצטט. לאחר מכן, לשטוף אותו עם 250 מ"ל של מים, 75 מ"ל של 10% חומצת לימון, 2x עם 200 מ"ל של מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצק אדום/כתום.
- הכפיף את מוצק chromatography עמוד פלאש ג'ל סיליקה (0-20% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 3.87 גרם של תרכובת A6 כמו קצף לבן.
- סינתזה של תרכובת A7
- הוסף N-מתילמורפוליין N-תחמוצת (50 wt.% במים, 1.64 מ"ל) dropwise לפתרון של תרכובת A6 (2.93 גרם) באצטון / מים (8:1, 58.5 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- מוסיפים אוסמיום טטראוקסיד (4% פתרון מימי) טיפה לתערובת על פני תקופה של 3 דקות וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.
- להרוות את התגובה עם 1.0 M מימית נתרן גופרתי עד הפתרון הופך חסר צבע. הסר את volatiles תחת ואקום כדי לגרום תרחיף לבן במים. לחלץ את השאריות עם 350 מ"ל של dichloromethane ולאחר מכן לשטוף עם 150 מ"ל של מים ואחריו לשטוף עם 150 מ"ל של מלח.
- יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להניב 2.45 גרם של תרכובת A7 כמוצק לבן.
- סינתזה של תרכובת A8
- הוסף 760 גרם של תקופת נתרן לתערובת של 1.36 גרם של תרכובת A7 ב 35 מ"ל של דיכלורומתאן / מים (6:1, 35 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 42 שעות.
- מסננים את החומר הבלתי מסיס ומרכזים את הסינון תחת ואקום. לחלץ את השאריות וכתוצאה מכך עם 250 מ"ל של dichloromethane, ולאחר מכן לשטוף עם 100 מ"ל של מים ו 100 מ"ל של מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת את המוצר הגולמי.
- הכפפ את המוצר הגולמי לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (5-40% אתיל אצטט/הקסנים, ולאחר מכן 5% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.08 גרם של תרכובת A8.
- סינתזה של תרכובת A9
- הכן פתרון של 830 מ"ג של תרכובת A8 ב 15 מ"ל של 1,2-dichloroethane. הוסף את הפתרון של dropwise לתערובת של 6-בנזילוקסיקקרבונילמינו-2-L-אמינו-hexanoic חומצה טרימתילסיליל אתיל אסתר (649.5 מ"ג) ו N,N-diisopropylethylamine (591 μL) ב 24 מ"ל של 1,2-dichloroethane מעל 3 דקות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
- מוסיפים 360.3 מ"ג נתרן triacetoxyborohydride לפתרון וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.
- להרוות את תערובת התגובה עם 6 מ"ל של מים. לחלץ את תערובת התגובה 3x עם 200 מ"ל של דיכלורומתאן ולשטוף עם 200 מ"ל של 10% חומצת לימון במים, 2x עם 200 מ"ל מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח בסדר זה. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג את המוצר הגולמי.
- הכפיפה את המוצר הגולמי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (5-30% אתיל אצטט / הקסנים) להניב 885 תרכובת מ"ג A9.
- סינתזה של מונומר JBNT
- להמיס 0.54 גרם של תרכובת A9 (0.54 גרם) ב 10 מ"ל של 94% תמיסת חומצה trifluoroacetic / thioanisole ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 72 שעות.
- מוסיפים אתר diethyl (80 מ"ל) לתערובת התגובה וצנטריפוגה משקעים למטה. יוצקים את החומצה trifluoroacetic ברור המכיל supernatant החוצה ולשטוף את המשקעים הלבנים עם אתר diethyl ומתנול להניב 168.6 מ"ג מונומר JBNT גס (קובץ משלים 1).
- טיהור מונומר JBNT גולמי על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) עם עמודת פאזה הפוכה. תוכנית הבידוד מפורטת להלן: ממס A: 100% מים; ממס B: 100% אצטוניטריל; ממס C: pH = 1 פתרון מים HCl; קצב זרימה: 3 מ"ל / דקה (ראה טבלה 1).
- לאסוף את הפסגה הגדולה ביותר בערך 7.2 דקות.
2. ייצור עבור JBNT / FN
- הוסף 80 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNT פתרון מימית 40 μL של 1 מ"ג / מ"ל FN פתרון מימית פיפטה מספר פעמים.
- בדוק אם יש נוכחות של מתלה מוצק לבן לאחר pipetting במשך כ 10 s.
הערה: סרטון צולם כדי ללכוד את תהליך ההרכבה העצמית של NM (קובץ משלים 2).
3. התבוננות בדגימות לויאופיליות
הערה: שלב זה מבוצע כדי להציג את מבנה הפיגומים של NM עשוי JBNTs ו- FN.
- הכן פתרונות FN, JBNT ו- FN / JBNT NM לתצפית חומרים ליאופיליים. לדלל 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של FN עם 40 μL של מים מזוקקים לעשות פתרון 20 מיקרוגרם / מ"ל של FN.
- הכן 100 מ"ג / מ"ל פתרון של JBNTs על ידי דילול 5 μL של 1 JBNTs מ"ג / מ"ל ב 45 μL של מים DI.
- מערבבים 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs ב 35 μL של מים DI כדי ליצור את הפתרון NM.
- מעיל שלוש בארות של מיקרופלטות עגולות עגולות ברורות 96-היטב עם FN, פתרון JBNT ופתרון NM, בהתאמה. כל באר מקבלת 50 μL של הפתרון.
- בצע lyophilization, כמתואר להלן, כדי לדמיין את מבנה הפיגומים של NM.
- להקפיא את הצלחת ב -80 מעלות צלזיוס לילה.
- הפעל את המכשיר lyophilized ומשאבת ואקום.
- לחץ על כפתור הקירור כדי להפחית את הטמפרטורה של המערכת ל -50 מעלות צלזיוס.
- מכניסים את הצלחת הקפואה לתוך המכשיר lyophilized ולסגור את כל פתחי המכשירים.
- לחץ על לחצן התחל כדי להפחית את לחץ המערכת ל- 0.9 mbar.
- לאחר 4 שעות, לחץ על כפתור aerate ולפתוח את השסתום כדי להגביר את לחץ המערכת ללחץ האטמוספרי.
- תוציא את הצלחת מהמכשיר הליאופילי.
- השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן ב- FN, JBNTs וב- NM שהרכיב את עצמו. צלם מספר תמונות עם מצלמה לחומרים.
4. מדידת ספקטרום ספיגה
הערה: השתמש בשינוי הספקטרום עבור FN ו- JBNTs כדי להציג את JBNT / FN NM12שהרכיב את עצמו .
- מערבבים 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 15 μL של מים מזוקקים ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNTs להכין את הפתרון JBNT / FN NM. השעיה מוצקה לבנה ניתן לראות לאחר pipetting הפתרון מספר פעמים.
הערה: הריכוזים הסופיים של JBNTs ו- FN בתמיסה הם 100 מיקרוגרם / מ"ל ו 60 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה. פתרונות JBNTs ו- FN באותו ריכוז לזה המשמש בפתרון NM הוכנו גם כפתרונות בקרה. - לדלל 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs עם 45 μL של מים מזוקקים כדי להכין פתרון בקרת JBNT.
- לדלל 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 20 μL של מים מזוקקים כדי להכין את פתרון בקרת FN.
- למדוד את ספקטרום הספיגה UV-vis של פתרונות FN, JBNT ו JBNT / FN NM עם ספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים)כדי לאפיין את ההרכבה של NM.
- לחץ על לחצן UV-Vis. לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של מים מזוקקים על זה. למדוד אותו ריק מ 190-850 ננומטר.
- לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון FN על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה UV-Vis של פתרון FN מ 190 ננומטר עד 850 ננומטר.
- לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.
- לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT / FN NM על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT / FN NM מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.
5. הכנת JBNT / FN NM להעברת מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM)
- נקה מספר רשתות לפני כתמים שליליים עם מנקה פלזמה בסיסי (ראה טבלת חומרים).
- בצע את הכתמים השליליים לדגימות לאחר שני תהליכים שונים.
- שחרר 3 μL של 1 מ"ג / מ"ל של פתרון מימי JBNTs ו 3 μL של פתרון JBNT / FN NM על רשתות מופרדות ולהשאיר אותו במשך 2 דקות. לאחר מכן לשטוף כל רשת עם 100 μL של 0.5% Uranyl אצטט (UA) פתרון. מסננים את הפתרון העודף עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשתות.
- לערבב 9 μL של פתרון JBNT / FN NM עם 3 μL של 2.0% פתרון UA ופיפט אותו מספר פעמים. פיפטה הפתרון המעורב על הרשתות ולשמור אותו על הרשתות במשך 2 דקות. השתמש בנייר סינון כדי להסיר את הפתרון המעורב מהרשתות ולייבש את הרשתות בטמפרטורת החדר.
- לבסוף, לאפיין את הדגימה עבור JBNTs, JBNT / FN NM מוכתם בשלב 5.2.1, ו JBNT / FN NM מוכתם עם שלב 5.2.2 עם TEM.
6. במבחנה ביולוגית פונקציה מבחנה
- הוסף 200 μL של פקדים שליליים (NC, PBS), JBNTs, FN ופתרונות JBNT / FN NM לבאר אחת של שקופית 8 בארות, בהתאמה.
- להקפיא לייבש את כיסוי 8-היטב תאים עם המכשיר lyophilized לציפוי חומרים בתחתית בארות. הפרוטוקול לייבוש הקפאה זהה לשלב 3.5.
- לאחר מכן להוסיף 10,000 תאים / בארות hMSCs (מעבר 3) לתוך הבארות ולהדגיר אותם במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2.
- לאחר הדגירה, פיפטה את מדיום תרבות התא מן הבארות ולשטוף את התרבות עם פתרון 1x PBS.
- הוסף 100 μL של הפתרון המתקן לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 5 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.
- מדללים 1% טריטון-X 100 עד 0.1%. הוסף 100 μL של 0.1% טריטון-X 100 לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 10 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.
- לדלל את הרודמין Phalloidin ל 1.65 מיקרומטר. להוסיף 100 μL של רודמין Phalloidin לכל באר עם תאים דגירה כיסוי התאי שמירה על אור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.
- לכוד את תמונות התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- ספירת מספרי התאים בתמונות פלואורסצנטיות עבור כל קבוצה. לחשב את צפיפות הידבקות התא על ידי ממוצע של שלושה אזורים אקראיים בכל באר.
- הצג את כל הנתונים כסטיית תקן (SD) ± ממוצעת. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t חד-זנבי, ואחריו ניתוח שונות (ANOVA) עם p<0.05, הנחשב מובהק סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המחקרים שלנו גילו כי היווצרות NM של JBNTs ו FN הוא מהיר, אשר קרה ב 10 שניות. כפי שמוצג באיור 2, פלוקולה לבנה הושגה כאשר פתרון JBNT היה מעורבב עם פתרון FN ו pipetted מספר פעמים. תהליך היווצרות של NM הוא ביומימטי לחלוטין. אין צורך בגירויים חיצוניים. תהליך הייצור הוא הרבה יותר קל מזה של כמה biomaterials המתעוררים, אשר מבוסס על אור אולטרה סגול או יוזם כימי עבור crosslinking13.
צילמנו וניתחנו את תמונות המצלמה של FN, JBNTs וה-NM(איור 3). עבור קבוצת FN, למעט כתמים לבנים קצרים, לא נצפו סיבים ארוכים. האשכולות הקצרים היו אגלומברציות החלבון המורכבות מ- FN, מה שמצביע על כך שלא ניתן להקים את מבנה הפיגומים עם FN לבדו ללא JBNTs(איור 3A). כפי שמוצג באיור 3B, הסיבים הארוכים והדקים יותר מצביעים על קיומם של JBNTs. רוחב הגדילים הלבנים של ה- NM רחב יותר בהשוואה ל- JBNTs, מה שמצביע על כך שה- JBNTs וה- FN מקושרים זה לזה ויוצרים NM. סיבי ה-NM יכולים לגדול עד כמה סנטימטרים באורך (איור 3C).
השגנו את ספקטרום UV-Vis כדי לציין את ההרכבה בין JBNTs ו- FN. כפי שניתן לראות באיור 4, JBNTs מציג שתי פסגות ספיגה ב 220 ננומטר ו 280 ננומטר, בהתאמה. בהשוואה ל- JBNTs, ל- JBNT / FN NM יש שתי פסגות ספיגה באותו מיקום עם ערך מופחת באופן משמעותי, אשר היה מ- JBNTs אך הושפע מ- JBNTs ו- FN שאינם קוולנטיים בין לבין.
TEM שימש לאפיון המורפולוגיה של JBNTs ו- NM. כפי שמוצג באיור 5A, ה-JBNTs הם צינורות דקים בקוטר אחיד. בתנאים ניטרליים, JBNTs מחויבים באופן חיובי בעוד FN מחויבים באופן שלילי. כאשר הם מעורבים, הם יצרו NM שרירן ארוך באמצעות אינטראקציות טעינה (איור 5B). כאשר רמת ה- pH נמוכה מהנקודה האיסואלקטרית של ה- FN (pI של 5.5-6.0), חבילות NM מציגות שחרור עצמי עקב FN הטעון באופן חיובי. כפי שמוצג באיור 5C, כאשר נשמר בתמיסה עם pH נמוך (4.0), NM היה מפורק, והרבה FN שוחרר מן NM. FN מופץ לצד צינורית היא גם עדות חזקה כי NM היה מפוברק על ידי JBNTs ו FN10.
בחנו את ההשפעה של JBNT / FN NM על הידבקות בתאים. כפי שמוצג באיור 6, צפיפות הידבקות התאים של קבוצת NM הראתה הבדל משמעותי (p-value <0.05) בהשוואה לפקד השלילי. ההבדל יכול להיות בגלל NM נועדו לחקות מורפולוגית ECM, אשר מספקים פיגום עבור הידבקות התא14. ה- ECM היה מורכב קולגנים ודבק תאים גליקופרוטאינים, כגון פיברונקטין15. קולגן הוצג עם היכולת לקדם הידבקות גבוהה יותר והתפשטות של hMSCs16. בנוסף, fibronectin הוכח לשפר את הידבקות hMSCs באתר הפצוע, כמו גם15. הדמיית פלואורסצנטיות גם הראתה כי דבקות ה- HMSCs בקבוצת NM גדלה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת השלילית (איור 7)15,17.
איור 1: איור סכמטי של ההרכבה העצמית ההירארכית של JBNTs עם שרשרת צד ליצינית.
איור זה מודפס מחדש עם הרשאה מהפרסום הקודם12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדגמה לתהליך ההרכבה העצמית של ה-NM.
(A)פתרון FN. (B)JBNTs מעורבב עם FN. איור זה מודפס מחדש עם הרשאה מהפרסום הקודם12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות של ברייטפילד.
תצלומי ברייטפילד של (A) FN (B) JBNTs ו -( C) NM שנוצרו על ידי JBNTs ו- FN. לכל אזור קוטר של 2 ס"מ. איור זה מודפס מחדש עם הרשאה מהפרסום הקודם12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ספקטרום ספיגה של FN, JBNTs ו- JBNT/FN NM.
איור זה מודפס מחדש מהפרסום הקודם12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות TEM.
תמונות TEM של (A) JBNTs (B) JBNT / FN NM, ו -( C) פרסמו JBNT / FN NM. איור זה מודפס מחדש עם הרשאה מהפרסום הקודם12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח סטטיסטי של הידבקות סלולרית.
צפיפות הדבקה של תאים נרשמה בניסוי זה. *p<0.01 בהשוואה לבקרות שליליות. **p<0.05 בהשוואה ל- JBNT בלבד. נ=3. איור זה מודפס מחדש עם הרשאה מהפרסום הקודם12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות פלואורסצנטיות.
תמונות פלואורסצנטיות של (A) hMSCs ו - (B) hMSC דגירה עם JBNTs. (C) hMSC דגירה עם FN. (D) hMSC דגירה עם JBNT / FN NM. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. איור זה מודפס מחדש עם הרשאה מהפרסום הקודם12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| זמן | אחוז אחד | B% | C% |
| 0.00 דק' | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 דק' | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 דק' | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 דק' | 0 | 100 | 0 |
טבלה 1: זמן ההסתעףות של מעבר הצבע.
קובץ משלים 1: ערכה לסינתזה של מונומר JBNT. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
קובץ משלים 2: וידאו להרכבה עצמית של FN / JBNT NM. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה פיתחנו NM ביומימטי בהרכבה עצמית, אשר נוצר עם JBNTs בהשראת DNA ו- FN. בעת הכנת פתרון JBNT, אבקת lyophilized JBNT צריך להיות מומס לתוך המים במקום PBS כי PBS יגרום agglomeration של JBNTs, אשר מעכב את ההרכבה שלהם. יתר על כן, NM צריך גם להיות מורכב במים אם אנחנו רוצים לבחון את המבנים ננו סיבי של NM, כי המלח ב- PBS יהיה צרור עם סיבי NM, אשר יכול להפחית מאוד את הרזולוציה של התמונות.
NM הראה פוטנציאל גדול לשמש פיגום הנדסת רקמות חדשני למרות הרבה מאמצים נעשו כדי להמציא פיגומים רגנרטיביים רקמות, אשר שימשו כדי להקל על הידבקות hMSCs ובידול. עם זאת, רוב החומרים האלה מוכנים מראש עם צורה ספציפית, כגון פיגום מודפס 3D18,19. ככזה, לא קל להשתיל אותן באתרים פצועים שנמצאים עמוק במפרק. עם זאת, פתרון NM כאן יכול להיות מוזרק כנוזל ולאחר מכן לשמש פיגום עבור הידבקות התא.
מגבלה אחת היא כי NM אינו חזק מכנית. שלא כמו פולימרים, הם מפוברקים באמצעות הרכבה עצמית של אינטראקציות לא קוולנטיות, ולכן הם לא יכולים לשאת הרבה טעינה מכנית או מתח. מצד שני, המבנה הלא-קוולנטי מציג גם מתכלות טובה מאוד ואי-תאימות ביולוגית המתאימה לתפקודים ביולוגיים8,20,21.
NM להזרקה הראה פוטנציאל גדול לספק מיקום היעד פיגום עבור MSC ביות כדי לשפר את ריפוי שבר העצם בגוף. עם זאת, כאשר מוזרק לתוך האתר הפצוע, NM noncovalent לא יכול להישאר במקום במשך זמן רב, אשר עשוי להפחית את ההשפעה הטיפולית. בעתיד, נחקור לשלב חומרים אחרים (כגון הידרוג'לים) או להחליף את מבני NM כדי לייעל עוד יותר את המאפיינים של פיגום NM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר יופנג צ'ן הוא מייסד שותף של NanoDe Therapeutics בע"מ.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת כספית על ידי NIH (מענקים 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), פרס הקריירה של NSF (1653702) ואוניברסיטת קונטיקט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
