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Bioengineering

स्टेम सेल आसंजन के लिए जानस बेस नैनोट्यूब और फाइब्रोनेक्टिन के साथ बायोमिमेटिक नैनो-मैट्रिक्स का निर्माण

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61317
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य जानस बेस नैनोट्यूब (जेबीएनटी) और फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के साथ बायोमिमेटिक नैनोमेट्रिक्स (एनएम) की असेंबली दिखाना है। जब मानव मेसेन्चिमल स्टेम सेल (एचएमएससी) के साथ सह-संस्कारी होते हैं, तो एनएमएससी आसंजन को प्रोत्साहित करने में उत्कृष्ट जैव सक्रियता प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

एक बायोमिमेटिक एनएम को ऊतक-इंजीनियरिंग जैविक पाड़ के रूप में सेवा करने के लिए विकसित किया गया था, जो स्टेम सेल एंकोरेज को बढ़ा सकता है। बायोमिमेटिक एनएम एक जलीय समाधान में स्वयं-असेंबली के माध्यम से जेबीआरटी और एफएन से बनता है। JBNTs आंतरिक हाइड्रोफोबिक खोखले चैनलों और बाहरी हाइड्रोफिलिक सतहों के साथ लंबाई में 200-300 माइक्रोन उपाय । जेबीएनटी पर सकारात्मक शुल्क लिया जाता है और एफएन पर नकारात्मक रूप से शुल्क लिया जाता है। इसलिए, जब एक तटस्थ जलीय समाधान में इंजेक्शन, वे एनएम बंडलों के रूप में गैर-सरकारी संबंध के माध्यम से एक साथ बंधुआ हैं । सेल्फ असेंबली प्रक्रिया किसी भी रासायनिक सर्जक, गर्मी स्रोत, या यूवी प्रकाश के बिना कुछ सेकंड के भीतर पूरी हो जाती है। जब एनएम समाधान का पीएच एफएनएस (पीआई 5.5-6.0) के आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट से कम होता है, तो सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए एफएन की उपस्थिति के कारण एनएम बंडल स्वयं जारी होंगे।

एनएम को एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) रूपात्मक रूपांतरित रूपात्मक रूप से नकल करने के लिए जाना जाता है और इसलिए, एक इंजेक्शन पाड़ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एचएमएससी आसंजन को बढ़ाने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है। सेल घनत्व विश्लेषण और फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रयोगों ने संकेत दिया कि एनएमएस ने नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में एचएमएससी के एंकोरेज में काफी वृद्धि की ।

Introduction

मानव मेसेंचिमल स्टेम सेल (एचएमएससी) ने विभिन्न मेसेंचिमल वंशों के साथ आत्म-नवीकरण और आत्म-भेदभाव की क्षमता दिखाई है, जो ऊतकों के उत्थान और रखरखाव में मदद करता है1। भेदभाव क्षमता के आधार पर, एचएमएससी को मेसेंचिमल ऊतक चोटों और हेमेटोपोइटिक डिसऑर्डर थेरेपी 2 के लिए उम्मीदवार मानाजाताहै। एचएमएससी ने ऊतक की मरम्मत, एंजियोजेनेसिस में वृद्धि और सूजन3को कम करके घाव भरने को बढ़ावा देने की क्षमता दिखाई है। हालांकि, जैव रासायनिक या बायोमैटेरियल्स सहायता के बिना, एचएमएससी के लिए लक्षित ऊतक तक पहुंचने और वांछित स्थान पर कार्य करने की दक्षता कम4है। यद्यपि घावों पर पालन करने के लिए एचपीएससी को आकर्षित करने के लिए विभिन्न इंजीनियर मचानों का उपयोग किया गया है, लेकिन लंबी हड्डी के बीच में विकास प्लेट फ्रैक्चर जैसी कुछ साइटें पारंपरिक पूर्व-निर्मित मचानों द्वारा आसानी से सुलभ नहीं हैं, जो पूरी तरह से अनियमित आकार की घायल साइट में फिट नहीं हो सकती हैं।

यहां, हमने एक बायोमिमेटिक नैनोमैटेरियल विकसित किया है जो सीटू में स्वयं को इकट्ठा कर सकता है और लक्ष्य क्षेत्र तक पहुंचने के लिए एक कठिन इंजेक्शन दिया जा सकता है। इंजेक्शन जैव पाड़ एनएम Janus आधार नैनोट्यूब (JBNTs) और फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) से बना है । JBNTs, भी रोसेट नैनोट्यूब (RNTs) के रूप में जाना जाता है, डीएनए आधार जोड़े, विशेष रूप से थाइमाइन और एडेनिन से प्राप्त कर रहे हैं, यहां5,6,7। जैसा कि चित्र 1में देखा गया है, नैनोट्यूब तब बनते हैं जब व्युत्पन्न डीएनए बेस के छह अणु हाइड्रोजन बांड के माध्यम से स्वयं इकट्ठा होते हैं ताकि एक विमान 6 बनसके। छह अणुओं तो एक मजबूत pi-स्टैकिंग बातचीत7के माध्यम से एक विमान में एक दूसरे पर खड़ी कर रहे हैं, जो लंबाई में 200-300 μm तक हो सकता है । जेबीएनटी को कोलेजन फाइबर की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ताकि एफएन उनके साथ प्रतिक्रिया देगा।

एफएन एक उच्च आणविक वजन चिपकने वाला ग्लाइकोप्रोटीन है, जो एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम)9में पाया जा सकता है। ये स्टेम सेल के लगाव को ईसीएम के अन्य घटकों, विशेष रूप से कोलेजन10में मध्यस्थता कर सकते हैं। हमने जेबीएनटी को कोमोलॉजिकल रूप से कोलेजन फाइबर की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया है ताकि एफएन उनके साथ एनएम बनाने के लिए प्रतिक्रिया कर सके। इसलिए, एनएम एक आशाजनक जैव-पाड़ है जिसे हड्डी फ्रैक्चर साइट में इंजेक्ट किया जाना है जो पारंपरिक रूप से निर्मित पाड़ों द्वारा सुलभ नहीं हो सकता है। यहां, इंजेक्शन एनएम विट्रो में एचएमएससी एंकरेज को बढ़ाने की एक उत्कृष्ट क्षमता प्रस्तुत करता है, जो ऊतक उत्थान के लिए पाड़ के रूप में सेवा करने की उनकी क्षमता का प्रदर्शन करता है।

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Protocol

1. जेबीएनटी का संश्लेषण

नोट: जेबीएनटी मोनोमर पहले11प्रकाशित के रूप में तैयार किया गया था ।

  1. यौगिक A1 का संश्लेषण
    1. टोल्यून के 25 एमएल और एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड के 2.5 एमएल में 8.50 ग्राम 2-साइनोएसेटिक एसिड और 9.80 ग्राम एथिलकार्बैमेट युक्त समाधान तैयार करें। फॉस्फोरिल क्लोराइड ड्रॉपवाइज के 4.90 एमएल जोड़ें। फिर मिश्रण को 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और 1.5 घंटे तक हिलाते रहें।
    2. कमरे के तापमान के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण ठंडा और बर्फ के पानी के १०० ग्राम में डालना । एथिल एसीटेट (3 x 250 एमएल) के साथ जलीय परत निकालें, और नमकीन के 100 एमएल के साथ धोएं। निर्जल सोडियम सल्फेट पर कार्बनिक परत को सुखाएं, एक पीला-पीला ठोस प्राप्त करने के लिए वैक्यूम के नीचे वाष्पित होते हैं।
    3. सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमेटोग्राफी (3% मेथनॉल/डाइक्लोरोमेथेन) के लिए पीले ठोस विषय एक सफेद पाउडर के रूप में यौगिक A1 के 15.61 ग्राम उपज के लिए।
  2. यौगिक A2 का संश्लेषण
    1. एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड के 50 एमएल में 3.12 ग्राम यौगिक A1 और 2.75 ग्राम पोटेशियम कार्बोनेट मिलाएं। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिलाओ ।
    2. प्रतिक्रिया निलंबन के लिए कार्बन डिसल्फाइड के 2.6 एमएल जोड़ें। 4 घंटे के लिए सरगर्मी रखें।
    3. 0 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण में पूर्ण इथेनॉल जोड़ें। पीले रंग को बाहर निकालें और डाईथाइल ईथर से धोएं। वैक्यूम के नीचे रात भर सूखी 6.18 ग्राम यौगिक A2 को पीला-पीला ठोस के रूप में पैदा करें।
  3. यौगिक A3 का संश्लेषण
    1. एसीटोनिट्रिल के 15 एमएल में मिथाइल आयोडाइड का 2.7 एमएल जोड़ें। इसके अलावा, अलग से 6.18 ग्राम A2 से 80 एमएल पानी/एसीटोनिट्रिल (7:3 अनुपात) जोड़कर यौगिक A2 का समाधान तैयार करें। दोनों समाधान मिलाएं और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हलचल करें।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण को 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और 3 घंटे के लिए सरगर्मी रखें।
    3. कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण को ठंडा करें, और फिर वैक्यूम के तहत वेलैटल्स को वाष्पित करें।
    4. एथिल एसीटेट के 100 एमएल के साथ अवशेष 3x निकालें और नमकीन के साथ धोएं। निर्जल सोडियम सल्फेट पर कार्बनिक परत को सुखाएं, एक पीले ठोस प्राप्त करने के लिए वैक्यूम के तहत volatiles को फ़िल्टर करें और वाष्पित करें।
    5. सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमेटोग्राफी (30% एथिल एसीटेट/हेक्सानेस) के लिए पीले ठोस विषय एक हल्के पीले ठोस के रूप में यौगिक A3 के ४.५२ ग्राम उपज के लिए ।
  4. यौगिक A4 का संश्लेषण
    1. इथेनॉल के 20 एमएल में 925 माइक्रोनेमाइन जोड़कर एलेलमाइन सॉल्यूशन तैयार करें। 30 मिनट से अधिक पूर्ण इथेनॉल के 75 एमएल में ए3 के 3.14 ग्राम जोड़कर तैयार यौगिक A3 के समाधान में इस समाधान को ड्रॉपवाइज जोड़ें। फिर प्रतिक्रिया मिश्रण को 16 घंटे के लिए भाटा करने के लिए गर्म करें।
    2. कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण को ठंडा करें और पीले ठोस देने के लिए इनवैटल्स को वाष्पित करें।
    3. सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमेटोग्राफी (50% एथिल एसीटेट/हेक्सेन्स से 2% मेथनॉल/डाइक्लोरोमेथेन) के लिए पीले ठोस विषय में एक सफेद क्रिस्टल के रूप में यौगिक A4 के 1.80 ग्राम उपज के लिए।
  5. यौगिक A5 का संश्लेषण
    1. पूर्ण इथेनॉल के 14 मिलील में 2.05 ग्राम ग्वानिनियम हाइड्रोक्लोराइड और सोडियम एथॉक्साइड (इथेनॉल में 21 डब्ल्यूटी%) का 7.8 एमएल जोड़ें। इस मिश्रण को 15 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. अघुलनशील सामग्री को फ़िल्टर करें और 40 एमएल पूर्ण इथेनॉल में A4 के 2.70 ग्राम जोड़कर तैयार यौगिक A4 के समाधान में सीधे फिलट्रेट जोड़ें। 16 घंटे के लिए भाटा करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण गर्म करें।
    3. एक ऑफ-व्हाइट सॉलिड के रूप में 2.65 ग्राम यौगिक A5 प्राप्त करने के लिए वर्षा को फ़िल्टर करें।
  6. यौगिक A6 का संश्लेषण
    1. 1 मिनट से अधिक टेट्राहाइड्रोफुरन के 120 मिलील में 2.11 ग्राम यौगिक ए 5 और 4-डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन के 1.10 ग्राम जोड़कर प्राप्त घोल मिश्रण में धीरे-धीरे ट्राइथाइलमाइन के 24.9 एमएल जोड़ें। 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिलाओ ।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण में डीआई-वेटर्ट-ब्यूटिल डिकार्बोनेट ड्रॉपवाइज का 20.7 एमएल जोड़ें और 40 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सरगर्मी रखें।
    3. रिएक्शन को बुझाने के लिए 20 एमएल पानी डालें। वैक्यूम के नीचे इन्सैटलैटल्स को वाष्पित करें।
    4. एथिल एसीटेट के 500 एमएल के साथ लाल चिपचिपा अवशेष निकालें। फिर, इसे 250 मिलील पानी, 10% साइट्रिक एसिड के 75 एमएल, 200 मिलियन पानी के साथ 2x, संतृप्त सोडियम बाइकार्बोनेट की 200 मिलील, और नमकीन के 200 मिलील के साथ धोएं। एक लाल/नारंगी ठोस देने के लिए वैक्यूम के नीचे वैटलेट को छानकर, फिल्टर करें और वाष्पित करें।
    5. सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमेटोग्राफी (0-20% एथिल एसीटेट/हेक्सेन) के लिए ठोस विषय एक सफेद फोम के रूप में यौगिक A6 के ३.८७ ग्राम उपज के लिए ।
  7. यौगिक A7 का संश्लेषण
    1. एसीटोन/पानी (8:1, 58.5 मिलीएल) में यौगिक A6 (2.93 ग्राम) के समाधान के लिए एन-मिथाइलमॉर्फोलिन एन-ऑक्साइड (पानी में 50 wt.%, 1.64 एमएल) ड्रॉपवाइज जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हलचल करें।
    2. 3 मिनट की अवधि में मिश्रण में ऑस्मियम टेट्राऑक्साइड (4% जलीय समाधान) ड्रॉपवाइज जोड़ें और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सरगर्मी रखें।
    3. 1.0 मीटर जलीय सोडियम सल्फाइट के साथ प्रतिक्रिया को बुझाएं जब तक कि समाधान बेरंग न हो। पानी में एक सफेद घोल में परिणाम के लिए वैक्यूम के तहत volatiles निकालें। डाइक्लोरोमेथेन के 350 एमएल के साथ अवशेष निकालें और फिर 150 मिलीएल पानी से धोएं और उसके बाद 150 एमएल नमकीन के साथ धोएं।
    4. निर्जल सोडियम सल्फेट पर कार्बनिक परत को सुखाएं, फिल्टर करें और वैक्यूम के तहत अस्थिर को वाष्पित करें ताकि एक सफेद ठोस के रूप में 2.45 ग्राम यौगिक A7 निकलेगा।
  8. यौगिक A8 का संश्लेषण
    1. डाइक्लोरोमेथेन/पानी (6:1, 35 एमएल) के 35 एमएल में 1.36 ग्राम यौगिक A7 के मिश्रण में 760 ग्राम सोडियम पीरियोडाइड जोड़ें और 42 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हलचल करें।
    2. अघुलनशील सामग्री को फ़िल्टर करें और वैक्यूम के नीचे फिल्ट्रेट को केंद्रित करें। परिणामी अवशेषों को डाइक्लोरोमेथेन के 250 एमएल के साथ निकालें, और फिर 100 एमएल पानी और 100 एमएल नमकीन से धोएं। निर्जल सोडियम सल्फेट पर कार्बनिक परत को सुखाएं, कच्चे उत्पाद को देने के लिए वैक्यूम के तहत वेलटल्स को फ़िल्टर करें और वाष्पित करें।
    3. कच्चे उत्पाद को सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमेटोग्राफी (5-40% एथिल एसीटेट/हेक्सेन, फिर 5% मेथनॉल/डाइक्लोरोमेथेन) के अधीन करने के लिए 1.08 ग्राम यौगिक A8 उपज।
  9. यौगिक A9 का संश्लेषण
    1. 1,2-डाइक्लोरोएथेन के 15 एमएल में 830 मिलीग्राम यौगिक ए8 का समाधान तैयार करें। 6-बेंजीलोकीकार्बोनिलमिनो-2-एल-अमीनो-हेक्सानोइक एसिड ट्राइमेथिलिलिल एथिल एस्टर (649.5 मिलीग्राम) और के मिश्रण में ड्रॉपवाइज का घोल जोड़ें और एन, एन-डाइसोप्रोपिलेथिलमाइन (591 माइक्रोन) 3 मिनट से अधिक 1,2-डाइक्लोरोथेने के 24 एमएल में और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हलचल।
    2. समाधान के लिए 360.3 मिलीग्राम सोडियम ट्राइसेटॉक्सीबोरोहाइड्राइड जोड़ें और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सरगर्मी रखें।
    3. प्रतिक्रिया मिश्रण को 6 एमएल पानी से बुझाएं। डिक्लोरोमेथेन के 200 मिलील के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण 3x निकालें और पानी में 10% साइट्रिक एसिड के 200 मिलील के साथ धोएं, 200 मिली पानी के साथ 2x, संतृप्त सोडियम बाइकार्बोनेट के 200 मिलील, और उस क्रम में नमकीन के 200 मिलील। निर्जल सोडियम सल्फेट पर कार्बनिक परत को सुखाएं, कच्चे उत्पाद को प्राप्त करने के लिए वैक्यूम के तहत वेलैटलेट को फ़िल्टर करें और वाष्पित करें।
    4. 885 मिलीग्राम यौगिक A9 उपज के लिए सिलिका जेल फ्लैश कॉलम क्रोमेटोग्राफी (5-30% एथिल एसीटेट/हेक्सेन) के लिए कच्चे उत्पाद के अधीन।
  10. जेबीएनटी मोनोमर का संश्लेषण
    1. 94% ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड/थिओनिसोल समाधान के 10 एमएल में 0.54 ग्राम यौगिक A9 (0.54 ग्राम) को भंग करें और 72 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हलचल करें।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण में डाईथाइल ईथर (80 एमएल) जोड़ें और अपकेशन को नीचे रखें। स्पष्ट ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड डालें जिसमें सुपरनैंट होता है और 168.6 मिलीग्राम क्रूड जेबीटी मोनोमर(पूरक फ़ाइल 1)उपज के लिए डाईथाइल ईथर और मेथनॉल के साथ सफेद वर्षा को धोएं।
    3. रिवर्स चरण कॉलम के साथ एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा क्रूड जेबीएनटी मोनोमर को शुद्ध करें। अलगाव कार्यक्रम नीचे सूचीबद्ध है: सॉल्वेंट ए: 100% पानी; सॉल्वेंट बी: 100% एसीटोनीट्री; सॉल्वेंट सी: पीएच = 1 एचसीएल पानी समाधान; प्रवाह दर: 3 एमएल/न्यूनतम (तालिका 1देखें) ।
    4. लगभग 7.2 मिनट पर सबसे बड़ी चोटी ले लीजिए।

2. जेबीएनटी/एफएन के लिए निर्माण

  1. 1 मिलीग्राम/एमएल जेबीएनटी जलीय समाधान के 80 माइक्रोन को 1 मिलीग्राम/एमएल एफएन जलीय समाधान और पिपेट के 40 माइक्रोन में कई बार जोड़ें।
  2. लगभग 10 एस के लिए पाइपिंग के बाद सफेद ठोस निलंबन की उपस्थिति की जांच करें।
    नोट: एनएम(पूरक फ़ाइल 2)की आत्म-असेंबली प्रक्रिया पर कब्जा करने के लिए एक वीडियो शूट किया गया था।

3. लियोफिलाइज्ड नमूनों का अवलोकन

नोट: यह कदम JBNTs और एफएन से बने एनएम की पाड़ संरचना को दिखाने के लिए किया जाता है।

  1. लिओफिलाइज्ड मैटेरियल ऑब्जर्वेशन के लिए एफएन, जेबीएनटी और एफएनटी/जेबीएनटी एनएम सॉल्यूशंस तैयार करें। एफएन का 20 माइक्रोन/एमएल समाधान बनाने के लिए 40 माइक्रोन आसुत पानी के साथ एफएन के 10 माइक्रोन/10 μL को पतला करें।
  2. डीआई वाटर के 45 माइक्रोन में 1 मिलीग्राम/एमएल जेबीआरटी के 5 माइक्रोन को कमजोर करके जेबीआरटी का 100 मिलीग्राम/एमएल घोल तैयार करें।
  3. एनएम समाधान बनाने के लिए डीआई वाटर के 35 माइक्रोन में 100 माइक्रोन/एमएल एफएन के 10 माइक्रोन और 1 मिलीग्राम/एमएल के डीआई वाटर में मिलाएं।
  4. कोट क्रमशः एफएन, जेबीएनटी समाधान और एनएम समाधान के साथ 96-अच्छी तरह से स्पष्ट गोल नीचे माइक्रोप्लेट के तीन कुओं। प्रत्येक कुएं को समाधान के 50 माइक्रोन प्राप्त होते हैं।
  5. एनएम की पाड़ संरचना की कल्पना करने के लिए नीचे वर्णित lyophilization प्रदर्शन करें।
    1. रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट फ्रीज करें।
    2. ल्योफिलाइज्ड इंस्ट्रूमेंट और वैक्यूम पंप चालू करें।
    3. सिस्टम के तापमान को -50 डिग्री सेल्सियस तक कम करने के लिए कूल डाउन बटन दबाएं।
    4. लिओफिलाइज्ड इंस्ट्रूमेंट में फ्रोजन प्लेट लगाएं और उपकरणों के सभी उद्घाटन बंद करें।
    5. सिस्टम प्रेशर को 0.9 mbar तक कम करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
    6. 4 घंटे के बाद, वातारे बटन दबाएं और वायुमंडलीय दबाव के लिए सिस्टम दबाव बढ़ाने के लिए वाल्व खोलें।
    7. प्लेट को ल्योफिलाइज्ड इंस्ट्रूमेंट से बाहर निकाल लें।
    8. एफएन, जेबीएनटी और परिणामी स्वयं-इकट्ठे एनएम का निरीक्षण करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। सामग्री के लिए एक कैमरे के साथ कई तस्वीरें ले लो।

4. अवशोषण स्पेक्ट्रा माप

नोट: एफएन और जेबीआरटी के लिए स्पेक्ट्रा के परिवर्तन का उपयोग स्वयं इकट्ठे जेबीएनटी/एफएन एनएम12पेश करने के लिए ।

  1. जेबीएनटी/एफएन एनएम सॉल्यूशन तैयार करने के लिए 100 माइक्रोन/एमएल एफएन के 15 माइक्रोन के साथ डिस्टिल्ड वाटर के 15 माइक्रोन और 1 मिलीग्राम/एमएल जेबीबीटी के 5 माइक्रोन मिक्स करें। कई बार समाधान को पाइपिंग करने के बाद सफेद ठोस निलंबन देखा जा सकता है।
    नोट: समाधान में JBNTs और एफएन की अंतिम सांद्रता क्रमशः १०० μg/ml और ६० μg/mL हैं । एनएम समाधान में उपयोग किए जाने वाले एक ही एकाग्रता पर जेबीएनटी और एफएन समाधान भी नियंत्रण समाधान के रूप में तैयार किए गए थे।
  2. जेबीएनटी नियंत्रण समाधान तैयार करने के लिए 45 माइक्रोन आसुत पानी के साथ जेबीबीटी के 1 मिलीग्राम/एमएल के 5 माइक्रोन।
  3. एफएन नियंत्रण समाधान तैयार करने के लिए आसुत पानी के 20 माइक्रोन के साथ 100 μg/mL एफएन के 30 μL पतला करें।
  4. एनएम की असेंबली की विशेषता के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एफएन, जेबीएनटी और जेबीएनटी/एफएन एनएम समाधानों के यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा को मापें।
    1. यूवी-विस बटन पर क्लिक करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की परीक्षण सतह को साफ करें और उस पर आसुत पानी के 2 माइक्रोन ड्रॉप करें। 190-850 एनएम से खाली के रूप में इसे मापें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की परीक्षण सतह को साफ करें और उस पर एफएन समाधान के 2 माइक्रोन को छोड़ दें। 190 एनएम से 850 एनएम तक एफएन समाधान के यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा को मापें।
    3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की टेस् ट सरफेस को साफ करें और उस पर जेबीएनटी सॉल्यूशन के 2 माइक्रोन ड्रॉप करें। 190 एनएम से 850 एनएम तक जेबीएनटी समाधान के अवशोषण स्पेक्ट्रा को मापें।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की टेस् ट सरफेस को साफ करें और उस पर जेबीएनटी/एफएन एनएम सॉल्यूशन के 2 माइक्रोन ड्रॉप करें। 190 एनएम से 850 एनएम तक जेबीएनटी/एफएन एनएम समाधान के अवशोषण स्पेक्ट्रा को मापें।

5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (TEM) के लिए जेबीएनटी/एफएन एनएम की तैयारी

  1. एक बुनियादी प्लाज्मा क्लीनर के साथ नकारात्मक धुंधला से पहले कई ग्रिड साफ (सामग्री की मेजदेखें) ।
  2. दो अलग-अलग प्रक्रियाओं के बाद नमूनों के लिए नकारात्मक धुंधला प्रदर्शन करें।
    1. जेबीएनटी जलीय समाधान के 1 मिलीग्राम/एमएल के 3 माइक्रोन और अलग ग्रिडों पर जेबीएनटी/एफएन एनएम समाधान के 3 माइक्रोन ड्रॉप करें और इसे 2 मिनट के लिए छोड़ दें । फिर प्रत्येक ग्रिड को 0.5% यूरेबिल एसीटेट (यूए) समाधान के 100 माइक्रोन के साथ कुल्ला करें। फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त समाधान नाली और हवा ग्रिड सूखी।
    2. जेबीएनटी/एफएन एनएम सॉल्यूशन के 9 माइक्रोन को 2.0% यूए सॉल्यूशन के 3 माइक्रोन के साथ मिलाएं और इसे कई बार पिपेट करें। ग्रिडों पर मिश्रित समाधान को पिपेट करें और इसे 2 मिनट के लिए ग्रिड पर रखें। ग्रिड से मिश्रित समाधान को हटाने और कमरे के तापमान पर ग्रिड सूखी करने के लिए एक फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
  3. अंत में, JBNTs के लिए नमूना विशेषता, जेबीएनटी/एफएन एनएम कदम ५.२.१ के साथ दाग, और JBNT/FN एनएम TEM के साथ कदम ५.२.२ के साथ दाग ।

6. इन विट्रो जैविक समारोह परख

  1. नकारात्मक नियंत्रण (एनसी, पीबीएस), जेबीएनटी, एफएन और जेबीएनटी/एफएन एनएम समाधानों के 200 माइक्रोन को क्रमशः 8-अच्छी तरह से कक्षित स्लाइड के एक कुएं में जोड़ें।
  2. कुओं के तल पर सामग्री कोट करने के लिए lyophilized साधन के साथ 8 अच्छी तरह से कक्षित कवरग्लास को फ्रीज करें। फ्रीज सुखाने के लिए प्रोटोकॉल चरण 3.5 के समान है।
  3. फिर कुओं में 10,000 कोशिकाओं/कुओं एचएमएससी (मार्ग 3) जोड़ें और उन्हें 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर24घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, कुओं से सेल संस्कृति माध्यम को बाहर निकालें और 1x पीबीएस समाधान के साथ संस्कृति को कुल्ला करें।
  5. कोशिकाओं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से फिक्सेटिव समाधान के 100 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए छोड़ दें। दो बार 1x पीबीएस के साथ धीरे से कोशिकाओं कुल्ला।
  6. तनु 1% ट्राइटन-एक्स 100 से 01%। कोशिकाओं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 के 100 माइक्रोल जोड़ें और 10 मिनट के लिए छोड़ दें। दो बार 1x पीबीएस के साथ धीरे से कोशिकाओं कुल्ला।
  7. रोडामाइन फालोइडिन को 1.65 माइक्रोन में पतला करें। 100 माइक्रोन रोडामाइन फालोडिन को कोशिकाओं के साथ प्रत्येक कुएं में डालें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रकाश से ध्यान में रखते हुए कक्षों के कवरग्लास को इनक्यूबेट करें। दो बार 1x पीबीएस के साथ धीरे से कोशिकाओं कुल्ला।
  8. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ सेल छवियों को कैप्चर करें।
  9. प्रत्येक समूह के लिए फ्लोरोसेंट छवियों पर सेल नंबरों की गणना करें। प्रत्येक कुएं में तीन यादृच्छिक क्षेत्रों के औसत से सेल आसंजन घनत्व की गणना करें।
  10. सभी डेटा को औसत ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत करें। एक पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें, जिसके बाद पीएंडटी;0.05 के साथ विचरण (एनोवा) का विश्लेषण किया जाता है, जिसे सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है।

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Representative Results

हमारे अध्ययनों से पता चला कि जेबीएनटी और एफएन के एनएम का गठन तेजी से होता है, जो 10 सेकंड में हुआ। जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, जब जेबीएनटी समाधान को एफएन समाधान के साथ मिलाया गया था और कई बार पाइपेट किया गया था। एनएम की गठन प्रक्रिया पूरी तरह से बायोमिमेटिक है। किसी बाहरी उत्तेजना की जरूरत नहीं है। निर्माण की प्रक्रिया कुछ उभरते बायोमैटेरियल्स की तुलना में बहुत आसान है, जो क्रॉसलिंकिंग13के लिए पराबैंगनी प्रकाश या रासायनिक सर्जक पर आधारित है।

हमने एफएन, जेबीएनटी और एनएम(चित्रा 3)की कैमरा छवियों पर कब्जा कर लिया और उनका विश्लेषण किया। एफएन समूह के लिए, छोटे सफेद धब्बे को छोड़कर, कोई लंबे फाइबर नहीं देखे गए। छोटे समूह प्रोटीन समूह थे जिनमें एफएन शामिल थे, जो इंगित करता है कि पीपाड़ संरचना को जेबीएनटी(चित्रा 3 ए)के बिना अकेले एफएन के साथ नहीं बनाया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 3Bमें दिखाया गया है, लंबे और पतले फाइबर जेबीएनटी के अस्तित्व का संकेत देते हैं। एनएम के सफेद किस्में की चौड़ाई JBNTs की तुलना में व्यापक है, यह दर्शाता है कि JBNTs और एफएन एक दूसरे के साथ क्रॉसलिंक एनएम बनाने । एनएम फाइबर लंबाई में कई सेंटीमीटर तक बढ़सकता है (चित्रा 3 सी)।

हमने जेबीएनटीएस और एफएन के बीच असेंबली को इंगित करने के लिए यूवी-विस स्पेक्ट्रा प्राप्त किया। जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है, जेबीएनटी क्रमशः 220 एनएम और 280 एनएम पर दो अवशोषण चोटियों को प्रदर्शित करता है। जेबीबीट्स की तुलना में, जेबीएनटी/एफएन एनएम में एक ही स्थान पर दो अवशोषण चोटियां हैं, जो काफी कम मूल्य के साथ हैं, जो जेबीआरटी से थे लेकिन बीच में गैर-सहसंयोजक स्वयं-इकट्ठे जेबीएनटी और एफएन से प्रभावित थे।

ईएम का उपयोग जेबीएनटी और एनएम की आकृति विज्ञान की विशेषता के लिए किया गया था। जैसा कि चित्रा 5Aमें दिखाया गया है, जेबीआरटी एक समान व्यास के साथ पतली ट्यूब हैं। तटस्थ परिस्थितियों में, जेबीआरटी पर सकारात्मक रूप से शुल्क लिया जाता है जबकि एफएन पर नकारात्मक रूप से शुल्क लिया जाता है। जब मिश्रित, वे चार्ज इंटरैक्शन(चित्रा 5B)के माध्यम से लंबे समय तक फाइब्रॉइड एनएम का गठन किया । जब पीएच एफएन (5.5-6.0 के पीएच) के आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट से कम होता है, तो एनएम बंडल सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए एफएन के कारण स्वयं-रिलीज प्रस्तुत करते हैं। जैसा कि चित्रा 5 सीमें दिखाया गया है, जब कम पीएच (4.0) के समाधान में संरक्षित किया गया था, एनएम को अस्वीकार कर दिया गया था, और एनएम से बहुत सारे एफएन जारी किए गए थे। नैनोट्यूब के साथ वितरित एफएन इस बात का भी पुख्ता सबूत है कि एनएम को जेएनबीटी और एफएन10ने गढ़ा था ।

हमने सेल आसंजन पर जेबीएनटी/एफएन एनएम के प्रभाव का पता लगाया । जैसा कि चित्र 6में दिखाया गया है, एनएम समूह के सेल आसंजन घनत्व ने नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में महत्वपूर्ण अंतर (पी-वैल्यू और लेफ्टिनेंट;0.05) मूल्य दिखाया। अंतर यह हो सकता है क्योंकि एनएम को मॉर्फोलॉजिकल रूप से ईसीएम की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो सेल आसंजन14के लिए एक पाड़ प्रदान करता है। ईसीएम कोलेजन और सेल चिपकने वाले ग्लाइकोप्रोटीन से बना था, जैसे फाइब्रोनेक्टिन15। कोलेजन को एचएमएससी16के उच्च आसंजन और प्रसार को बढ़ावा देने की क्षमता के साथ प्रस्तुत किया गया है । इसके अतिरिक्त, घायल स्थल में एचएमएससी आसंजन को बढ़ाने के साथ-साथ15को फाइब्रोनेक्टिन दिखाया गया है । फ्लोरेसेंस इमेजिंग ने यह भी दर्शाया कि नकारात्मक नियंत्रण समूह ( चित्र 7 )15,17की तुलना में एनएम समूह का एचएमएससी पालन में उल्लेखनीय वृद्धि हुई .

Figure 1
चित्रा 1: एक lysine पक्ष श्रृंखला के साथ JBNTs के पदानुक्रमित आत्म विधानसभा के योजनाबद्ध चित्रण ।
यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन12से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एनएम की स्वयं-इकट्ठा प्रक्रिया के लिए प्रदर्शन।
(A)एफएन सॉल्यूशन। (B)जेबीआरटी एफएन के साथ मिलाया गया । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन12से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ब्राइटफील्ड तस्वीरें।
जेबीएनटी और एफएन द्वारा गठित(ए)एफएन (बी)जेबीबीटी और(सी)एनएम की ब्राइटफील्ड तस्वीरें। प्रत्येक क्षेत्र का व्यास 2 सेमी है। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन12से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एफएन, जेबीबीटी, और जेबीएनटी/एफएन एनएम का अवशोषण स्पेक्ट्रा।
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Figure 5
चित्रा 5: TEM छवियां।
जेएनबीएनटी(बी)जेबीएनटी/एफएन एनएम, और(सी)जारी जेबीएनटी/एफएन एनएम की TEM छवियां । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन12से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: सेलुलर आसंजन का सांख्यिकीय विश्लेषण।
इस प्रयोग में सेल आसंजन घनत्व दर्ज किया गया था। नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना में * पीएंड एलटी;0.01। अकेले जेबीएनटी की तुलना में * * पीएंड एलटी;0.05। एन = 3। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन12से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: फ्लोरेसेंस छवियां।
जेएनबीएनटी के साथ इनक्यूबेटेड एचएमएससी(ए)एचएमएससी और(बी)की फ्लोरेसेंस इमेज जेबीएनटीकेसाथ इनक्यूबेटेड ।(C)एचएमएससी ने एफएनटी/एफएन एनएम के साथ इनक्यूबेटेड किया । स्केल बार: 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन12से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

समय एक% बी% सी%
0.00 मिनट 98 0 2
15.00 मिनट 68 30 2
25.00 मिनट 8 90 2
26.00 मिनट 0 100 0

तालिका 1: रेडिएंट एल्यूशन समय।

पूरक फाइल 1: जेबीएनटी मोनोमर के संश्लेषण के लिए योजना। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल 2: एफएन/जेबीएनटी एनएम की आत्म-असेंबली के लिए वीडियो। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने एक सेल्फ-असेंबल बायोमिमेटिक एनएम विकसित किया, जिसका गठन डीएनए से प्रेरित जेबीबीट और एफएन के साथ किया गया था। जेबीएनटी सॉल्यूशन तैयार करते समय जेबीएनटी ल्योफिलाइज्ड पाउडर को पीबीएस के बजाय पानी में घोल देना चाहिए क्योंकि पीबीएस के कारण जेबीबीटी का समूह बनेगा, जो उनकी विधानसभा को रोकता है। इसके अलावा, एनएम को पानी में भी इकट्ठा किया जाना चाहिए यदि हम एनएम की नैनो-फिब्रिल संरचनाओं का निरीक्षण करना चाहते हैं, क्योंकि पीबीएस में नमक एनएम फाइबर के साथ बंडल करेगा, जो छवियों के संकल्प को बहुत कम कर सकता है।

एनएम ने एक उपन्यास ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ के रूप में सेवा करने की काफी क्षमता दिखाई है, हालांकि ऊतक पुनर्योजी मचान बनाने के लिए बहुत प्रयास किए गए हैं, जिनका उपयोग एचएमएससी आसंजन और भेदभाव को सुविधाजनक बनाने के लिए किया गया था। हालांकि, इनमें से अधिकांश सामग्री एक विशिष्ट आकार के साथ पूर्व-निर्मित हैं, जैसे कि 3 डी मुद्रित पाड़18,19। इस प्रकार, उन्हें घायल स्थलों में प्रत्यारोपित करना आसान नहीं है जो संयुक्त में गहरे हैं। हालांकि, एनएम समाधान यहां एक तरल के रूप में इंजेक्शन दिया जा सकता है और फिर सेल आसंजन के लिए एक पाड़ के रूप में सेवा करते हैं ।

एक सीमा यह है कि एनएम यांत्रिक रूप से मजबूत नहीं है । बहुलक के विपरीत, वे गैर-सहस्रीय बातचीत के आत्म-असेंबली के माध्यम से गढ़े जाते हैं, इसलिए वे बहुत सारे यांत्रिक लोडिंग या तनाव को सहन नहीं कर सकते हैं। दूसरी ओर, गैर-जैविक संरचना भी बहुत अच्छी बायोडिग्रेडेबिलिटी और बायोकंप्लाटिबिलिटी प्रस्तुत करती है जो जैविक कार्यों के लिए उपयुक्त है8,20,21।

इंजेक्शन एनएम शरीर में हड्डी फ्रैक्चर चिकित्सा को बढ़ाने के लिए एमएससी होमिंग के लिए एक लक्ष्य स्थान और एक पाड़ प्रदान करने के लिए महान क्षमता दिखाई गई है । हालांकि, जब घायल साइट में इंजेक्शन, गैर-सहर्मानक एनएम लंबे समय तक जगह में नहीं रह सकता है, जिससे चिकित्सीय प्रभाव कम हो सकता है। भविष्य में, हम एनएम पाड़ के गुणों को और अनुकूलित करने के लिए अन्य सामग्रियों (जैसे हाइड्रोगेल) को शामिल करने या एनएम संरचनाओं को वैकल्पिक करने का पता लगाएंगे।

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Disclosures

डॉ Yupeng चेन नैनोडे चिकित्सा विज्ञान, इंक के सह-संस्थापक हैं ।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच (अनुदान 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), एनएसएफ कैरियर पुरस्कार (1653702) और कनेक्टिकट विश्वविद्यालय द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dichloroethane Alfa Aesar 39121
2-cyanoacetic acid Sigma-Aldrich C88505
4-Dimethylaminopyridine TCI America D1450
8 wells Chambered Coverglass Thermo Fisher 155409
96-well plate Corning 353072
absolute ethanol Thermo Fisher BP2818500
acetone Sigma-Aldrich 179124
acetonitrile Sigma-Aldrich 34851
allylamine Sigma-Aldrich 145831
Basic Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC32G
citric acid Sigma-Aldrich 251275
concentrated hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Deionized water Thermo Fisher 15230147
dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
diethyl ether Sigma-Aldrich 296082
Di-tert-butyl dicarbonate Sigma-Aldrich 361941
ethyl acetate Sigma-Aldrich 319902
ethylcarbamate Sigma-Aldrich U2500
Fibronectin Thermo Fisher PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) Thermo Fisher R37814
guanidinium hydrochloride Alfa Aesar A13543
hexanes Sigma-Aldrich 227064
Human mesenchymal stem cells Lonza PT-2501
methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl iodide Sigma-Aldrich 289566
N,N-Diisopropylethylamine Alfa Aesar A17114
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
N-Methylmorpholine N-oxide Alfa Aesar A19802
Osmium tetraoxide Alfa Aesar 45385
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140163
Phosphate Buffer Solution Thermo Fisher 20012050
phosphoryl chloride Sigma-Aldrich 201170
potassium carbonate Sigma-Aldrich 347825
reverse phase column Thermo Fisher 25305-154630
Rhodamine Phalloidin Thermo Fisher R415
silica gel TCI America S0821
sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
sodium ethoxide Alfa Aesar L13083
sodium periodide Sigma-Aldrich 71859
sodium sulfate Sigma-Aldrich 239313
sodium sulfite Sigma-Aldrich S0505
sodium triacetoxyborohydride Alfa Aesar B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) Thermo Fisher ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit Lonza PT-3001
tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757
thioanisole Sigma-Aldrich T28002
toluene Sigma-Aldrich 179418
triethylamine Alfa Aesar A12646
trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198
Triton X-100 Thermo Fisher HFH10
Trypsin-EDTA solution Thermo Fisher 25200056

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References

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Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen,… More

Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (159), e61317, doi:10.3791/61317 (2020).

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