Summary
Målet med denne protokollen er å vise montering av en biomimetisk nanomatrix (NM) med Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). Når de er samkulturert med humane mesenchymale stamceller (hMSCer), viser NMs utmerket bioaktivitet i oppmuntrende hMSCer vedheft.
Abstract
En biomimetisk NM ble utviklet for å tjene som et vev-engineering biologisk stillas, som kan forbedre stamcelle forankring. Biomimetisk NM er dannet fra JBNTs og FN gjennom selvmontering i en vandig løsning. JBNTs måler 200-300 μm i lengde med indre hydrofobe hule kanaler og ytre hydrofile overflater. JBNTs belastes positivt og FNs belastes negativt. Derfor, når de injiseres i en nøytral vandig løsning, bindes de sammen via ikke-kovalent binding for å danne NM-buntene. Selvmonteringsprosessen fullføres i løpet av få sekunder uten kjemiske initiativtakere, varmekilde eller UV-lys. Når pH av NM-løsningen er lavere enn isoelektrisk punkt av FNs (pI 5.5-6.0), NM bunter vil selv-release på grunn av tilstedeværelsen av positivt ladet FN.
NM er kjent for å etterligne den ekstracellulære matrisen (ECM) morfologisk og dermed kan brukes som et injiserbart stillas, noe som gir en utmerket plattform for å forbedre hMSC vedheft. Celletetthetsanalyse og fluorescensavbildningseksperimenter indikerte at NMs økte ankerplassen til HMSCer betydelig sammenlignet med den negative kontrollen.
Introduction
Humane mesenchymale stamceller (hMSCer) har vist potensialet for selvfornyelse og selvdiensisjon langs forskjellige mesenchymale avstamninger, noe som bidrar til regenerering og vedlikehold avvev 1. Basert på differensieringspotensialet, anses hMSCer som kandidater for mesenchymale vevsskader og hematopoetisk lidelsesterapi2. hMSCs har vist evnen til å fremme sårheling ved å øke vevreparasjon, angiogenese og redusere betennelse3. Men uten biokjemisk eller biomaterialer assistanse, effektiviteten for hMSCs å nå et mål vev og funksjon på ønsket sted er lav4. Selv om ulike konstruerte stillas har blitt benyttet til å tiltrekke seg hMSCer for å holde seg på lesjonene, er noen steder som vekstplatebrudd, midt i et langt bein, ikke lett tilgjengelig av de konvensjonelle prefabrikkerte stillasene, som kanskje ikke passer perfekt inn i et uregelmessig formet skadet sted.
Her har vi utviklet et biomimetisk nanomateriale som selv kan montere in situ og injiseres til et vanskelig tilgjengelig målområde. Injiserbare bio-stillas NM består av Janus base nanorør (JBNTs) og fibronectin (FN). JBNTs, også kjent som Rosette Nanotubes (RNTs), er avledet fra DNA base par, spesielt thymine og adenin, her5,6,7. Som vist i figur 1dannes nanorørene når seks molekyler av den avledede DNA-basen parer seg selv montere via hydrogenbindinger for å danne et plan6. Seks molekyler stables deretter på hverandre i et plan via en sterk pi-stabling interaksjon7, som kan være opp til 200-300 μm i lengde. JBNTs er designet for å morfologisk etterligne kollagenfibre slik at FN vil reagere med dem.
FN er et høymolekylært klebemiddel glykoprotein, som finnes i den ekstracellulære matrisen (ECM)9. Disse kan megle vedlegg av stamceller til andre komponenter i ECM, spesielt kollagen10. Vi designet JBNTs for å morfologisk etterligne kollagenfibre slik at FN kan reagere med dem for å danne NM om noen få sekunder via ikke-kovalent binding. Derfor er NM et lovende biostillas som skal injiseres i et beinbruddssted som ikke kunne være tilgjengelig av de konvensjonelt fabrikkerte stillasene. Her presenterer injiserbare NM en utmerket evne til å forbedre hMSC forankring in vitro, viser sitt potensial til å tjene som et stillas for vev regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av JBNTs
MERK: JBNT monomer ble utarbeidet som publisert tidligere11.
- Syntese av sammensattE A1
- Forbered en oppløsning som inneholder 8,50 g 2-cyanoacetisk syre og 9,80 g etylkarbamat i 25 ml toluen og 2,5 ml N, N-dimetylformamid. Tilsett 4,90 ml fosforylkloriddråpevis. Varm deretter blandingen til 70 °C og fortsett å røre i 1,5 timer.
- Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur og hell i 100 g isvann. Trekk ut vandig lag med etylacetat (3 x 250 ml), og vask med 100 ml saltlake. Tørk det organiske laget over vannfri natriumsulfat, filter og fordampe flyktige under vakuum for å få en blekgul fast stoff.
- Utsett det gule faste for silikagel flash kolonne kromatografi (3% metanol / diklormetan) for å gi 15,61 g sammensatt A1 som et hvitt pulver.
- Syntese av sammensatt A2
- Bland 3,12 g sammensatt A1 og 2,75 g kaliumkarbonat i 50 ml N, N-dimetylformamid. Rør ved romtemperatur i 2 timer.
- Tilsett 2,6 ml karbondisulfid til reaksjonsfjæringen. Fortsett å røre i 4 timer.
- Tilsett absolutt etanol til reaksjonsblandingen ved 0 °C. Filtrer det gule utfellingsut og vask med dietyleter. Tørk under vakuum over natten for å gi 6,18 g sammensatt A2 som blekgul fast stoff.
- Syntese av sammensatt A3
- Tilsett 2,7 ml metyljodid i 15 ml acetonitril. Også separat forberede en løsning av sammensatte A2 ved å legge til 6,18 g A2 til 80 ml vann / acetonitril (7:3 ratio). Bland både løsningene og rør ved romtemperatur i 30 min.
- Varm reaksjonsblandingen til 95 °C og fortsett å røre i 3 timer.
- Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur, og fordamp deretter flyktige under vakuum.
- Trekk ut rester 3x med 100 ml etylacetat og vask med saltlake. Tørk det organiske laget over vannfri natriumsulfat, filtrer og fordamp de flyktige under vakuum for å oppnå et gult fast stoff.
- Utfør det gule fast stoff til silikagel flash kolonne kromatografi (30% etylacetat / hexanes) for å gi 4,52 g av forbindelsen A3 som en lys-gul fast stoff.
- Syntese av sammensatt A4
- Forbered allylaminoppløsningen ved å tilsette 925 μL av allylamin i 20 ml etanol. Legg denne løsningen dropwise til løsningen av sammensattE A3, utarbeidet ved å legge til 3.14 g A3 i 75 ml absolutt etanol, over 30 min. Varm deretter reaksjonsblandingen til refluks i 16 timer.
- Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur og fordampe flyktige for å gi et gult fast stoff.
- Utsett det gule faste for silikagel flash kolonne kromatografi (50% etylacetat / hexanes til 2% metanol / diklormetan) for å gi 1,80 g sammensatt A4 som en hvit krystall.
- Syntese av sammensatt A5
- Tilsett 2,05 g guanidiniumhydroklorid og 7,8 ml natriumethoxide (21 wt% i etanol) i 14 ml absolutt etanol. Varm blandingen til 45 °C i 15 min.
- Filtrer av det uoppløselige materialet og legg filtratet direkte inn i løsningen av sammensatt A4, tilberedt ved å legge til 2,70 g A4 i 40 ml absolutt etanol. Varm reaksjonsblandingen til refluks i 16 timer.
- Filtrer utfellingsanlegget for å få 2,65 g sammensatt A5 som en off-white fast stoff.
- Syntese av sammensatt A6
- Tilsett 24,9 ml trietyamin sakte til slamblandingen oppnådd ved å tilsette 2,11 g sammensatt A5 og 1,10 g 4-Dimethylaminopyridin i 120 ml tetrahydrofuran over 1 min. Rør ved romtemperatur i 2 min.
- Tilsett 20,7 ml di-tert-butylgkarbonat dråpevis til reaksjonsblandingen og fortsett å røre ved romtemperatur i 40 timer.
- Tilsett 20 ml vann for å slukke reaksjonen. Fordampe flyktige under vakuum.
- Trekk ut de røde viskøs rester med 500 ml etylacetat. Deretter vasker du den inn med 250 ml vann, 75 ml 10% sitronsyre, 2x med 200 ml vann, 200 ml mettet natriumbikarbonat og 200 ml saltlake. Tørk det organiske laget over vannfri natriumsulfat, filtrer og fordamp flyktige under vakuum for å gi en rød / oransje fast.
- Utfør fast for silika gel flash kolonne kromatografi (0-20% etylacetat / hexanes) for å gi 3,87 g sammensatt A6 som et hvitt skum.
- Syntese av sammensatt A7
- Tilsett N-metylmorfolin N-oksid (50 wt.% i vann, 1,64 ml) dråpe til løsningen av sammensattE A6 (2,93 g) i aceton / vann (8:1, 58,5 ml) og rør ved romtemperatur i 5 min.
- Tilsett osmium tetraoksid (4% vandig løsning) dråpe til blandingen over en periode på 3 min og fortsett å røre ved romtemperatur i 24 timer.
- Slukke reaksjonen med 1,0 M vandig natriumsulfitt til oppløsningen blir fargeløs. Fjern flyktige under vakuum for å resultere i en hvit slurry i vann. Trekk ut rester med 350 ml diklormetan og vask deretter med 150 ml vann etterfulgt av en vask med 150 ml saltlake.
- Tørk det organiske laget over vannfri natriumsulfat, filtrer og fordamp flyktige under vakuum for å gi 2,45 g sammensatt A7 som et hvitt fast stoff.
- Syntese av sammensattE A8
- Tilsett 760 g natrium periodid til blandingen av 1,36 g sammensatt A7 i 35 ml diklormetan/vann (6:1, 35 ml) og rør ved romtemperatur i 42 timer.
- Filtrer det uoppløselige materialet og konsentrat filtratet under vakuum. Trekk ut de resulterende rester med 250 ml diklormetan, og vask deretter med 100 ml vann og 100 ml saltlake. Tørk det organiske laget over vannfri natriumsulfat, filtrer og fordamp flyktige under vakuum for å gi råoljeproduktet.
- Utsett råproduktet for silikagel flash kolonne kromatografi (5-40% etylacetat / hexanes, deretter 5% metanol / diklormetan) for å gi 1,08 g sammensatt A8.
- Syntese av sammensattE A9
- Forbered en løsning på 830 mg sammensatt A8 i 15 ml 1,2-dikloretan. Tilsett løsningen av dråpe til blandingen av 6-benzyloksykarbonylamino-2-L-amino-hekananosyre trimetylsilyletyl ester (649,5 mg) og N,N-diisopropylethylamine (591 μL) i 24 ml 1,2-dikloretan over 3 min og rør ved romtemperatur i 15 min.
- Tilsett 360,3 mg natriumtriacetoxyborohydride i oppløsningen og fortsett å røre ved romtemperatur i 24 timer.
- Slukke reaksjonsblandingen med 6 ml vann. Trekk ut reaksjonsblandingen 3x med 200 ml diklormetan og vask med 200 ml 10% sitronsyre i vann, 2x med 200 ml vann, 200 ml mettet natriumbikarbonat og 200 ml saltlake i den rekkefølgen. Tørk det organiske laget over vannfri natriumsulfat, filtrer og fordamp flyktige under vakuum for å oppnå råoljeproduktet.
- Utfør råproduktet for silika gel flash kolonne kromatografi (5-30% etylacetat / hexanes) for å gi 885 mg sammensattE A9.
- Syntese av JBNT monomer
- Oppløs 0,54 g sammensatt A9 (0,54 g) i 10 ml 94 % trifluorotaktisk syre/tianisoloppløsning og rør ved romtemperatur i 72 timer.
- Tilsett dietyleter (80 ml) til reaksjonsblandingen og sentrifuge bunnspissen ned. Hell den klare trifluorotaketiske syren som inneholder supernatant ut og vask det hvite bunnet med dietyleter og metanol for å gi 168,6 mg rå JBNT monomer (Supplerende fil 1).
- Rens den rå JBNT-monomeren med en væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) med en omvendt fasekolonne. Isolasjonsprogrammet er oppført nedenfor: Løsningsmiddel A: 100% vann; løsningsmiddel B: 100% acetonitril; løsningsmiddel C: pH=1 HCl vannoppløsning; strømningshastighet: 3 ml/min (se tabell 1).
- Samle den største toppen på ca 7,2 min.
2. Fabrikasjon for JBNT/FN
- Tilsett 80 μL μL av 1 mg/ml JBNT vandig oppløsning til 40 μL μL 1 mg/ml FN vandig oppløsning og pipette flere ganger.
- Kontroller at det er mulig å få hvit fast suspensjon etter pipettering i ca. 10 s.
MERK: En video ble tatt opp for å fange selvmonteringsprosessen til NM (Tilleggsfil 2).
3. Observasjon av lyofiliserte prøver
MERK: Dette trinnet utføres for å vise stillasstrukturen til NM laget av JBNTs og FN.
- Forbered FN,JBNT og FN/JBNT NM-løsninger for lyofilisert materialobservasjon. Fortynn 10 μL av 100 μg/ml FN med 40 μL destillert vann for å lage en 20 μg/ml oppløsning av FN.
- Forbered 100 mg/ml oppløsning av JBNTs ved å fortynne 5 μL μL på 1 mg/ml JBNTs i 45 μL DI vann.
- Bland 10 μL av 100 μg/ml FN og 5 μL 1 mg/ml JBNTs i 35 μL DI-vann for å danne NM-oppløsningen.
- Coat tre brønner med 96-brønns klare runde bunnmikroplater med FN, JBNT-løsning og NM-løsning. Hver brønn mottar 50 μL av oppløsningen.
- Utfør lyofilisering, som beskrevet nedenfor, for å visualisere stillasstrukturen til NM.
- Frys platen ved -80 °C over natten.
- Slå på det lyofiliserte instrumentet og vakuumpumpen.
- Trykk på avkjølingsknappen for å redusere temperaturen på systemet til -50 °C.
- Sett den frosne platen inn i det lyofiliserte instrumentet og lukk alle åpningene på instrumentene.
- Klikk startknappen for å redusere systemtrykket til 0,9 mbar.
- Etter 4 timer trykker du på lufteknappen og åpner ventilen for å øke systemtrykket til det atmosfæriske trykket.
- Ta platen ut av det lyofiliserte instrumentet.
- Bruk et mikroskop for å observere FN, JBNTs og den resulterende selvmonterte NM. Ta flere bilder med et kamera for materialene.
4. Måling av absorpsjonsspektra
MERK: Bruk endringen av spectra for FN og JBNTs til å presentere den selvmonterte JBNT / FN NM12.
- Bland 30 μL på 100 μg/ml FN med 15 μL destillert vann og 5 μL 1 mg/ml JBNTs for å klargjøre JBNT/FN NM-løsningen. Hvit fast suspensjon kan sees etter pipettering av løsningen flere ganger.
MERK: De endelige konsentrasjonene av JBNTs og FN i oppløsningen er henholdsvis 100 μg/ml og 60 μg/ml. JBNTs og FN-løsninger med samme konsentrasjon som den som ble brukt i NM-løsningen ble også utarbeidet som kontrollløsninger. - Fortynn 5 μL 1 mg/ml JBNTs med 45 μL destillert vann for å forberede JBNT kontrollløsning.
- Fortynn 30 μL på 100 μg/ml FN med 20 μL destillert vann for å forberede FN-kontrollløsning.
- Mål UV-vis absorpsjon spektra av FN, JBNT og JBNT / FN NM løsninger med spektrofotometeret (se Table of Materials) for å karakterisere montering av NM.
- Klikk på UV-Vis-knappen. Rengjør testoverflaten til spektrofotometeret og slipp 2 μL destillert vann på den. Mål den som tom fra 190-850 nm.
- Rengjør testoverflaten til spektrofotometeret og slipp 2 μL FN-løsning på den. Mål UV-Vis absorpsjon spektra av FN løsning fra 190 nm til 850 nm.
- Rengjør testoverflaten til spektrofotometeret og slipp 2 μL JBNT-oppløsning på den. Mål absorpsjonsspektraet til JBNT-oppløsningen fra 190 nm til 850 nm.
- Rengjør testoverflaten til spektrofotometeret og slipp 2 μL JBNT/FN NM-oppløsning på den. Mål absorpsjonsspektraet til JBNT/FN NM-løsningen fra 190 nm til 850 nm.
5. Utarbeidelse av JBNT/FN NM for overføring av elektronisk mikroskopi (TEM)
- Rengjør flere gitter før negativ farging med en grunnleggende plasmarenser (se Materialtabell).
- Utfør den negative fargingen for prøvene etter to forskjellige prosesser.
- Slipp 3 μL med 1 mg/ml JBNTs vandig oppløsning og 3 μL JBNT/FN NM-oppløsning på separerte rutenett og la den stå i 2 min. Skyll deretter hvert gitter med 100 μL på 0,5 % uranylacetat (UA) oppløsning. Tøm overflødig oppløsning med filterpapir og luft tørk gitteret.
- Bland 9 μL JBNT/FN NM-oppløsning med 3 μL 2,0 % UA-oppløsning og pipetter den flere ganger. Pipette den blandede løsningen på gitteret og hold den på gitteret i 2 min. Bruk et filterpapir til å fjerne den blandede løsningen fra gitteret og tørke gitteret ved romtemperatur.
- Til slutt karakteriserer du prøven for JBNTs, JBNT / FN NM farget med trinn 5.2.1, og JBNT / FN NM farget med trinn 5.2.2 med TEM.
6. In vitro biologisk funksjon analyse
- Legg til 200 μL med negative kontroller (NC, PBS), JBNTs, FN og JBNT / FN NM-løsningene i en brønn av en 8-brønns kamret lysbilde, henholdsvis.
- Frys det 8-brønns kamret dekkglasset med det lyofiliserte instrumentet for å belegge materialer på bunnen av brønnene. Protokollen for frysetørking er den samme som trinn 3.5.
- Deretter legger du til 10 000 celler/brønner hMSCer (passasje 3) i brønnene og inkuber dem i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
- Etter inkubasjon, pipette ut cellekulturmediet fra brønnene og skyll kulturen med 1x PBS-løsning.
- Tilsett 100 μL av fikseringsløsningen til hver brønn med celler og la stå i 5 min. Skyll cellene forsiktig med 1x PBS to ganger.
- Fortynn 1% Triton-X 100 til 0,1%. Tilsett 100 μL på 0,1% Triton-X 100 til hver brønn med celler og la stå i 10 min. Skyll cellene forsiktig med 1x PBS to ganger.
- Fortynn Rhodamine Phalloidin til 1,65 μM. Tilsett 100 μL rhodaminfallosin til hver brønn med celler og inkuber det kamret dekkglasset som holder seg fra lys ved romtemperatur i 30 min. Skyll cellene forsiktig med 1x PBS to ganger.
- Ta cellebildene med et fluorescerende mikroskop.
- Telle cellenumrene på fluorescerende bilder for hver gruppe. Beregn celleadhesjonstettheten ved å i snitt tre tilfeldige områder i hver brønn.
- Presentere alle data som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Utfør statistiske analyser ved hjelp av en t-test med én hale, etterfulgt av analyse av varians (ANOVA) med p<0,05, som anses som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre studier oppdaget at dannelsen av NM av JBNTs og FN er rask, som skjedde i 10 sekunder. Som vist i figur 2ble hvit floccule oppnådd da JBNT-løsningen ble blandet med FN-løsningen og pipetted flere ganger. Dannelsesprosessen av NM er helt biomimetisk. Ingen ytre stimuli er nødvendig. Prosessen med fabrikasjon er mye enklere enn for noen nye biomaterialer, som er basert på ultrafiolett lys eller kjemisk initiativtaker for krysskobling13.
Vi fanget og analyserte kamerabildene av FN, JBNTs og NM (figur 3). For FN-gruppen, med unntak av korte hvite flekker, ble det ikke observert lange fibre. De korte klyngene var protein agglomerasjoner bestående av FN, noe som indikerer at stillasstrukturen ikke kan dannes med FN alene uten JBNTs (Figur 3A). Som vist i figur 3B,indikerer de lange og tynnere fibrene eksistensen av JBNTs. Bredden på de hvite trådene i NM er bredere sammenlignet med JBNTs, noe som indikerer at JBNTs og FN krysset med hverandre danner NM. NM-fiberen kan vokse opp til flere centimeter i lengde (figur 3C).
Vi fikk UV-Vis-spektraen for å indikere monteringen mellom JBNTs og FN. Som vist i figur 4viser JBNTs to absorpsjonstopper på henholdsvis 220 nm og 280 nm. Sammenlignet med JBNTs har JBNT / FN NM to absorpsjonstopper på samme sted med en betydelig redusert verdi, som var fra JBNTs, men påvirket av de ikke-kovalente selvmonterte JBNTs og FN i mellom.
TEM ble brukt til å karakterisere morfologien til JBNTs og NM. Som vist i figur 5Aer JBNTs slanke rør med ensartede diametre. Under nøytrale forhold belastes JBNTs positivt mens FN belastes negativt. Når de blandes, dannet de lang fibroid NM via ladeinteraksjoner (figur 5B). Når pH er lavere enn det isoelektriske punktet til FN (pI på 5,5-6,0), presenterer NM-buntene selvutgivelse på grunn av den positivt ladede FN. Som vist i figur 5C, når det bevares i en løsning med lav pH (4.0), ble NM dissembled, og mye FN ble utgitt fra NM. FN distribuert sammen med nanotuben er også et sterkt bevis på at NM ble fabrikkert av JBNTs og FN10.
Vi utforsket effekten av JBNT / FN NM på celle vedheft. Som vist i figur 6viste celleamhesjonstettheten for NM-gruppen signifikant forskjellsverdi (p-verdi <0,05) sammenlignet med den negative kontrollen. Forskjellen kan være fordi NM er utformet for å morfologisk etterligne ECM, som gir et stillas for celle vedheft14. ECM var sammensatt av kollagen og cellelim glykoproteiner, som fibronectin15. Kollagen har blitt presentert med evnen til å fremme høyere vedheft og spredning av hMSCer16. I tillegg har fibronectin vist seg å forbedre hMSCs vedheft i det skadede området, samt15. Fluorescensavbildning viste også at hMSCs overholdelse av NM-gruppen økte betydelig sammenlignet med den negative kontrollgruppen (figur 7)15,17.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av den hierarkiske selvmonteringen av JBNTs med en lysinsidekjede.
Dette tallet skrives ut på nytt med tillatelse fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Demonstrasjon for den selvmonterte prosessen til NM.
(A) FN-løsning. (B) JBNTs blandet med FN. Dette tallet skrives ut på nytt med tillatelse fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Brightfield-fotografier.
Brightfield fotografier av (A) FN (B) JBNTs og (C) NM dannet av JBNTs og FN. Hvert område har en diameter på 2 cm. Dette tallet skrives ut på nytt med tillatelse fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Absorpsjon spektra av FN, JBNTs, og JBNT / FN NM.
Dette tallet skrives ut på nytt fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TEM-bilder.
TEM-bilder av (A) JBNTs (B) JBNT/FN NM, og (C) utgitt JBNT/FN NM. Dette tallet skrives ut på nytt med tillatelse fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Statistisk analyse av cellulær vedheft.
Celleadhesjonstetthet ble registrert i dette eksperimentet. *p<0,01 sammenlignet med negative kontroller. **p<0,05 sammenlignet med JBNT alene. N=3. Dette tallet skrives ut på nytt med tillatelse fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Fluorescensbilder.
Fluorescens bilder av (A) hMSCs og (B) hMSC inkubert med JBNTs. (C) hMSC inkubert med FN. (D) hMSC inkubert med JBNT / FN NM. Vektstangen: 100 μm. Dette tallet skrives ut på nytt med tillatelse fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tid | A% | B% | C% |
| 0.00 min. | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 min. | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 min. | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 min. | 0 | 100 | 0 |
Tabell 1: Graderingstiden.
Tilleggsfil 1: Ordning for syntese av JBNT monomer. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfil 2: Video for selvmontering av FN/JBNT NM. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien utviklet vi en selvmontert biomimetisk NM, som ble dannet med DNA-inspirerte JBNTs og FN. Ved fremstilling av JBNT-løsningen skal JBNT lyofilisert pulver oppløses i vannet i stedet for PBS fordi PBS vil forårsake agglomerasjon av JBNTs, noe som hemmer deres montering. Videre bør NM også monteres i vann hvis vi ønsker å observere nano-fibril strukturer av NM, fordi saltet i PBS vil pakke med NM-fibre, noe som i stor grad kan redusere oppløsningen på bildene.
NM har vist stort potensial til å tjene som en ny vev engineering stillas selv om mye arbeid har blitt gjort for å fremstille vev regenerative stillas, som ble brukt til å lette hMSCs vedheft og differensiering. De fleste av disse materialene er imidlertid forhåndsskapt med en bestemt form, for eksempel et 3D-trykt stillas18,19. Som sådan er de ikke lett å bli implantert i skadede steder som er dypt i leddet. NM-løsningen her kan imidlertid injiseres som væske og deretter tjene som stillas for celleadhesjon.
En begrensning er at NM ikke er mekanisk sterk. I motsetning til polymerer, er de fabrikkert via selvmontering av ikke-kovalente interaksjoner, slik at de ikke kan bære mye mekanisk belastning eller spenning. På den annen side presenterer den ikke-kovalente strukturen også meget god biologisk nedbrytbarhet og biokompatibilitet egnet for biologiske funksjoner 8,20,21 .
Injiserbare NM har vist stort potensial til å gi et mål plassering og et stillas for MSC homing å forbedre bein brudd healing i kroppen. Men når det injiseres på det skadede stedet, kan det hende at det ikke-kovalente NM ikke holder seg på plass i lang tid, noe som kan redusere den terapeutiske effekten. I fremtiden vil vi utforske å innlemme andre materialer (som hydrogeler) eller å veksle NM-strukturene for å optimalisere egenskapene til NM-stillaset ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Yupeng Chen er en av grunnleggerne av NanoDe Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes økonomisk av NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) og University of Connecticut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
