Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabricación de una nano-matriz biomimética con nanotubos base Janus y fibronectina para adherencia a células madre

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61317
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

Summary

El objetivo de este protocolo es mostrar el montaje de una nanomatrix biomimética (NM) con nanotubos base Janus (JBNT) y fibronectina (FN). Cuando se co-cultivan con células madre mesenquimales humanas (hMSCs), los NMs exhiben una excelente bioactividad en el fomento de la adhesión a los hMSCs.

Abstract

Un NM biomimético fue desarrollado para servir como un andamio biológico de ingeniería de tejidos, que puede mejorar el anclaje de las células madre. El NM biomimético se forma a partir de JBNT y FN a través del autoensamblaje en una solución acuosa. Los JBNT miden 200-300 μm de longitud con canales huecos hidrofóbicos internos y superficies hidrófilos externas. Los JBNT se cobran positivamente y los FNs se cobran negativamente. Por lo tanto, cuando se inyectan en una solución acuosa neutral, se unen a través de la unión novalente para formar los paquetes NM. El proceso de autoensamblaje se completa en pocos segundos sin ningún iniciador químico, fuente de calor o luz UV. Cuando el pH de la solución NM es menor que el punto isoeléctrico de los FN (pI 5.5-6.0), los paquetes NM se auto-liberarán debido a la presencia de FN cargado positivamente.

NM es conocido por imitar la matriz extracelular (ECM) morfológicamente y por lo tanto, se puede utilizar como un andamio inyectable, que proporciona una excelente plataforma para mejorar la adhesión hMSC. El análisis de densidad celular y los experimentos de imágenes de fluorescencia indicaron que los NMs aumentaron significativamente el anclaje de los hMSC en comparación con el control negativo.

Introduction

Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) han demostrado el potencial de autorretración y auto-diferenciación a lo largo de diferentes linajes mesenquimales, lo que ayuda en la regeneración y mantenimiento de los tejidos1. Sobre la base del potencial de diferenciación, hMSCs se consideran como candidatos para lesiones de tejido mesenquimal y terapia de trastorno hematopoyético2. hMSCs han demostrado la capacidad de promover la cicatrización de heridas mediante el aumento de la reparación de tejidos, la angiogénesis, y la reducción de la inflamación3. Sin embargo, sin asistencia bioquímica o biomateriales, la eficiencia para que los hMSCs alcancen un tejido objetivo y funcionen en la ubicación deseada es baja4. Aunque se han utilizado varios andamios de ingeniería para atraer hMSCs para adherirse a las lesiones, algunos sitios como la fractura de placas de crecimiento, en medio de un hueso largo, no son fácilmente accesibles por los andamios prefabricados convencionales, que pueden no caber perfectamente en un sitio lesionado de forma irregular.

Aquí, hemos desarrollado un nanomaterial biomimético que puede autoensamblarse in situ y ser inyectado a un área objetivo de difícil acceso. El nm bio-andamio inyectable se compone de nanotubos base Janus (JBNT) y fibronectina (FN). Los JBNT, también conocidos como los Rosette Nanotubes (RNTs), se derivan de pares de bases de ADN, específicamente timina y adenina, aquí5,6,7. Como se ve en la Figura 1,los nanotubos se forman cuando seis moléculas de la base de ADN derivada se autoensamblan a través de enlaces de hidrógeno para formar un plano6. Seis moléculas se apilan unas sobre otras en un plano a través de una fuerte interacción de pi-stacking7,que puede ser de hasta 200-300 μm de longitud. Los JBNT están diseñados para imitar morfológicamente las fibras de colágeno para que el FN reaccione con ellas.

FN es una glicoproteína adhesiva de alto peso molecular, que se puede encontrar en la matriz extracelular (ECM)9. Estos pueden mediar el apego de las células madre a otros componentes del ECM, particularmente el colágeno10. Diseñamos JBNT para imitar morfológicamente las fibras de colágeno para que FN pueda reaccionar con ellas para formar NM en pocos segundos a través de la unión no covalente. Por lo tanto, NM es un prometedor bio-andamio para ser inyectado en un sitio de fractura ósea que no podría ser accesible por los andamios fabricados convencionalmente. Aquí, el NM inyectable presenta una excelente capacidad para mejorar el anclaje hMSC in vitro, exhibiendo su potencial para servir como un andamio para la regeneración de tejidos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Síntesis de JBNT

NOTA: El monómero JBNT se preparó como se publicó anteriormente11.

  1. Síntesis del compuesto A1
    1. Preparar una solución que contenga 8,50 g de ácido cianoacético de 2 y 9,80 g de etilcarbamato en 25 ml de tolueno y 2,5 ml de N, N-dimetilformamida. Añadir 4,90 ml de cloruro de fósforo en sentido dropwise. A continuación, caliente la mezcla a 70 °C y siga revolviendo durante 1,5 h.
    2. Enfríe la mezcla de reacción a temperatura ambiente y vierta 100 g de agua helada. Extraiga la capa acuosa con acetato de etilo (3 x 250 ml) y lave con 100 ml de salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore volátiles bajo vacío para obtener un sólido de color amarillo pálido.
    3. Someta la cromatografía de columna flash de gel amarillo a sílice (3% metanol/diclorometano) para producir 15,61 g del compuesto A1 como polvo blanco.
  2. Síntesis del compuesto A2
    1. Mezclar 3,12 g del compuesto A1 y 2,75 g de carbonato de potasio en 50 ml de N, N-dimetilformamida. Revuelva a temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Añadir 2,6 ml de disulfuro de carbono a la suspensión de reacción. Sigue revolviendo durante 4 h.
    3. Añadir etanol absoluto a la mezcla de reacción a 0 °C. Filtre el precipitado amarillo hacia fuera y lave con éter de dietil. Secar bajo vacío durante la noche para producir 6,18 g del compuesto A2 como sólido de color amarillo pálido.
  3. Síntesis del compuesto A3
    1. Añadir 2,7 ml de yoduro de metilo en 15 ml de acetonitrilo. Además, preparar por separado una solución del compuesto A2 añadiendo 6,18 g de A2 a 80 ml de agua/acetonitrilo (relación 7:3). Mezcle las dos soluciones y revuelva a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    2. Caliente la mezcla de reacción a 95 °C y siga revolviendo durante 3 h.
    3. Enfríe la mezcla de reacción a temperatura ambiente y luego evapore los volátiles bajo vacío.
    4. Extraiga el residuo 3x con 100 ml de acetato de etilo y lávelo con salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo vacío para obtener un sólido amarillo.
    5. Someta la cromatografía de columna flash de gel amarillo a sílice (30% acetato etílico/hexanes) para producir 4,52 g del compuesto A3 como sólido amarillo claro.
  4. Síntesis del compuesto A4
    1. Preparar solución de allylamina mediante la adición de 925 μL de allylamina en 20 ml de etanol. Añada esta solución gota a gota a la solución del compuesto A3, preparado añadiendo 3,14 g de A3 en 75 ml de etanol absoluto, más de 30 min. A continuación, caliente la mezcla de reacción para reflujo durante 16 h.
    2. Enfríe la mezcla de reacción a temperatura ambiente y evapore los volátiles para dar un sólido amarillo.
    3. Someta la cromatografía de columna flash de gel amarillo a sílice (50% acetato de etilo/hexanes al 2% de metanol/diclorometano) para producir 1,80 g del compuesto A4 como cristal blanco.
  5. Síntesis del compuesto A5
    1. Añadir 2,05 g de clorhidrato de guanidinio y 7,8 ml de etóxido de sodio (21% en etanol) en 14 ml de etanol absoluto. Caliente la mezcla a 45 °C durante 15 min.
    2. Filtre el material insoluble y agregue el filtrado directamente a la solución del compuesto A4, preparado añadiendo 2,70 g de A4 en etanol absoluto de 40 ml. Caliente la mezcla de reacción para reflujo durante 16 h.
    3. Filtre el precipitado hacia fuera para obtener 2,65 g del compuesto A5 como un sólido blanquecino.
  6. Síntesis del compuesto A6
    1. Añadir 24,9 ml de trietiltamina lentamente a la mezcla de purines obtenida añadiendo 2,11 g de compuesto A5 y 1,10 g de 4-Dimetilminopyridina en 120 ml de tetrahidrofurano durante 1 min. Revuelva a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    2. Añadir 20,7 ml de di-tert-butyl dicarbonato gota a gota a la mezcla de reacción y seguir revolviendo a temperatura ambiente durante 40 h.
    3. Agregue 20 ml de agua para apagar la reacción. Evaporar los volátiles bajo vacío.
    4. Extraiga el residuo viscoso rojo con 500 ml de acetato de etilo. A continuación, lávalo con 250 ml de agua, 75 ml de ácido cítrico al 10%, 2 veces con 200 ml de agua, 200 ml de bicarbonato sódico saturado y 200 ml de salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo el vacío para dar un sólido rojo/naranja.
    5. Someta la cromatografía de columna flash de gel sólido a sílice (0-20% acetato de etilo/hexanes) para producir 3,87 g del compuesto A6 como espuma blanca.
  7. Síntesis del compuesto A7
    1. Añadir N-metilmorfina N-óxido (50 wt.% en agua, 1,64 ml) en sentido dropwise a la solución del compuesto A6 (2,93 g) en acetona / agua (8:1, 58,5 mL) y revolver a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    2. Añadir tetraóxido de osmio (4% solución acuosa) a la mezcla durante un período de 3 minutos y seguir revolviendo a temperatura ambiente durante 24 h.
    3. Encienda la reacción con sulfito de sodio acuoso de 1,0 M hasta que la solución se vuelva incolora. Retire los volátiles bajo vacío para dar lugar a un purines blancos en agua. Extraiga el residuo con 350 ml de diclorometano y luego lave con 150 ml de agua seguido de un lavado con 150 ml de salmuera.
    4. Secar la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtrar y evaporar los volátiles bajo vacío para producir 2,45 g del compuesto A7 como un sólido blanco.
  8. Síntesis del compuesto A8
    1. Añadir 760 g de perioduro de sodio a la mezcla de 1,36 g del compuesto A7 en 35 ml de diclorometano/agua (6:1, 35 ml) y revuelva a temperatura ambiente durante 42 h.
    2. Filtre el material insoluble y concentre el filtrado bajo vacío. Extraiga el residuo resultante con 250 ml de diclorometano, y luego lave con 100 ml de agua y 100 ml de salmuera. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo vacío para dar el producto crudo.
    3. Someta el producto crudo a cromatografía de columna flash de gel de sílice (5-40% acetato de etilo/hexanes, luego 5% metanol/diclorometano) para producir 1,08 g del compuesto A8.
  9. Síntesis del compuesto A9
    1. Preparar una solución de 830 mg del compuesto A8 en 15 ml de 1,2-dicloroetano. Añadir la solución de gota a gota a la mezcla de 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-ácido hexanoico trimetilsilyl éster etílico (649.5 mg) y N,N-diisopropylethylamine (591 μL) en 24 ml de 1,2-dicloroetano durante 3 min y revuelve a temperatura ambiente durante 15 min.
    2. Añadir 360,3 mg de triacetoxyborohidrato sódico a la solución y seguir revolviendo a temperatura ambiente durante 24 h.
    3. Saciar la mezcla de reacción con 6 ml de agua. Extraer la mezcla de reacción 3x con 200 ml de diclorometano y lavar con 200 ml de ácido cítrico al 10% en agua, 2x con 200 ml de agua, 200 ml de bicarbonato sódico saturado y 200 ml de salmuera en ese orden. Seque la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtre y evapore los volátiles bajo vacío para obtener el producto crudo.
    4. Someta el producto crudo a cromatografía de columna flash de gel de sílice (5-30% acetato de etilo/hexanes) para producir 885 mg compuesto A9.
  10. Síntesis del monómero JBNT
    1. Disolver 0,54 g del compuesto A9 (0,54 g) en 10 ml de solución de ácido trifluoroacético/tioanisole al 94% y agitar a temperatura ambiente durante 72 h.
    2. Agregue el éter de dietil (80 ml) a la mezcla de reacción y centrífuga el precipitado hacia abajo. Vierta el ácido trifluoroacético claro que contiene sobrenadante y lave el precipitado blanco con éter de dietil y metanol para producir 168,6 mg de monómero crudo JBNT(Archivo Suplementario 1).
    3. Purifique el monómero JBNT crudo mediante una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con una columna de fase inversa. El programa de aislamiento se muestra a continuación: Disolvente A: 100% agua; disolvente B: 100% acetonitrilo; disolvente C: solución de agua pH=1 HCl; caudal: 3 mL/min (véase la Tabla 1).
    4. Recoge el pico más grande a unos 7,2 minutos.

2. Fabricación para JBNT/FN

  1. Añadir 80 μL de solución acuosa JBNT de 1 mg/ml a 40 μL de solución acuosa FN de 1 mg/ml y pipeta varias veces.
  2. Compruebe la presencia de suspensión sólida blanca después de la tubería durante unos 10 s.
    NOTA: Se tomó un video para capturar el proceso de autoensamblaje de NM (Archivo suplementario 2).

3. Observación de especímenes liofilizados

NOTA: Este paso se realiza para mostrar la estructura de andamios de NM hecha de JBNT y FN.

  1. Prepare soluciones FN, JBNT y FN/JBNT NM para la observación de materiales liofilizados. Diluir 10 μL de 100 μg/ml de FN con 40 μL de agua destilada para hacer una solución de 20 μg/ml de FN.
  2. Preparar 100 mg/ml de solución de JBNT diluyendo 5 μL de 1 mg/ml de JBNTs en 45 μL de agua di.
  3. Mezclar 10 μL de 100 μg/mL FN y 5 μL de 1 mg/ml de JBNT en 35 μL de agua DI para formar la solución NM.
  4. Cubra tres pozos de microplacas inferiores redondas transparentes de 96 pozos con el FN, la solución JBNT y la solución NM, respectivamente. Cada pozo recibe 50 μL de la solución.
  5. Realizar la liofilización, como se describe a continuación, para visualizar la estructura del andamio del NM.
    1. Congele la placa a -80 °C durante la noche.
    2. Encienda el instrumento liofilizado y la bomba de vacío.
    3. Pulse el botón de enfriamiento para reducir la temperatura del sistema a -50 °C.
    4. Coloque la placa congelada en el instrumento liofilizado y cierre todas las aberturas de los instrumentos.
    5. Haga clic en el botón de inicio para reducir la presión del sistema a 0,9 mbar.
    6. Después de las 4 h, pulse el botón de aireación y abra la válvula para aumentar la presión del sistema a la presión atmosférica.
    7. Saque el plato del instrumento liofilizado.
    8. Utilice un microscopio para observar el FN, los JBNT y el NM autoensamblado resultante. Tome varias fotografías con una cámara para los materiales.

4. Medición de espectros de absorción

NOTA: Utilice el cambio de espectros para FN y JBNT para presentar el JBNT/FN NM12autoensamblado.

  1. Mezclar 30 μL de 100 μg/mL FN con 15 μL de agua destilada y 5 μL de 1 mg/ml de JBNT para preparar la solución JBNT/FN NM. La suspensión sólida blanca se puede ver después de canalizar la solución varias veces.
    NOTA: Las concentraciones finales de JBNT y FN en la solución son 100 μg/mL y 60 μg/mL, respectivamente. Las soluciones JBNT y FN a la misma concentración a la utilizada en la solución NM también se prepararon como soluciones de control.
  2. Diluir 5 μL de 1 mg/ml de JBNT con 45 μL de agua destilada para preparar la solución de control JBNT.
  3. Diluir 30 μL de 100 μg/mL FN con 20 μL de agua destilada para preparar la solución de control FN.
  4. Mida los espectros de absorción UV-vis de las soluciones FN, JBNT y JBNT/FN NM con el espectrofotómetro (ver Tabla de materiales)para caracterizar el ensamblaje de NM.
    1. Haga clic en el botón UV-Vis. Limpie la superficie de ensayo del espectrofotómetro y deje caer 2 μL de agua destilada sobre él. Mida como en blanco de 190-850 nm.
    2. Limpie la superficie de prueba del espectrofotómetro y suelte 2 μL de solución FN en él. Mida los espectros de absorción UV-Vis de la solución FN de 190 nm a 850 nm.
    3. Limpie la superficie de prueba del espectrofotómetro y suelte 2 μL de solución JBNT sobre ella. Mida los espectros de absorción de la solución JBNT de 190 nm a 850 nm.
    4. Limpie la superficie de prueba del espectrofotómetro y suelte 2 μL de solución JBNT/FN NM en él. Mida los espectros de absorción de la solución JBNT/FN NM de 190 nm a 850 nm.

5. Preparación de JBNT/FN NM para microscopía electrónica de transmisión (TEM)

  1. Limpie varias rejillas antes de manchar negativamente con un limpiador de plasma básico (consulte Tabla de materiales).
  2. Realice la tinción negativa de las muestras siguiendo dos procesos diferentes.
    1. Gota 3 μL de 1 mg/ml de solución acuosa JBNTs y 3 μL de solución JBNT/FN NM en rejillas separadas y déjela durante 2 minutos. A continuación, enjuague cada rejilla con 100 μL de solución de acetato de urilo (UA) del 0,5%. Escurrir el exceso de solución con papel filtrante y secar el aire de las rejillas.
    2. Mezcle 9 μL de solución JBNT/FN NM con 3 μL de solución 2.0% UA y pipeta varias veces. Pipetear la solución mixta en las rejillas y mantenerla en las rejillas durante 2 minutos. Utilice un papel de filtro para eliminar la solución mixta de las rejillas y secar las rejillas a temperatura ambiente.
  3. Por último, caracterizar la muestra de JBNT, JBNT/FN NM manchada con el paso 5.2.1, y JBNT/FN NM manchada con el paso 5.2.2 con el TEM.

6. Ensayo de función biológica in vitro

  1. Añada 200 μL de controles negativos (NC, PBS), JBNT, FN y las soluciones JBNT/FN NM en un pozo de una diapositiva de 8 pozos, respectivamente.
  2. Secar el reloj de cubierta de 8 pozos con el instrumento liofilizado para recubrir materiales en la parte inferior de los pozos. El protocolo para el secado por congelación es el mismo que el paso 3.5.
  3. A continuación, añadir 10.000 células/pozos hMSCs (Pasaje 3) en los pozos e incubarlos durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO2.
  4. Después de la incubación, pipetear el medio de cultivo celular de los pozos y enjuagar el cultivo con solución PBS 1x.
  5. Añadir 100 μL de la solución fija a cada pozo con células y dejar durante 5 min. Enjuague las células suavemente con 1x PBS dos veces.
  6. Diluir 1% Tritón-X 100 a 0.1%. Añadir 100 μL de 0.1% Triton-X 100 a cada pozo con células y dejar por 10 min. Enjuague las células suavemente con 1x PBS dos veces.
  7. Diluir la ródamina fhalloidina a 1,65 μM. Añadir 100 μL de ródamina faloides a cada pozo con células e incubar el reloj de cubierta de cámara manteniendo la luz a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague las células suavemente con 1x PBS dos veces.
  8. Capture las imágenes celulares con un microscopio fluorescente.
  9. Cuente los números de celda en imágenes fluorescentes para cada grupo. Calcule la densidad de adherencia celular promediando tres áreas aleatorias en cada pozo.
  10. Presente todos los datos como media ± desviación estándar (SD). Realice análisis estadísticos utilizando una prueba T de una cola, seguida de un análisis de la varianza (ANOVA) con p<0.05, que se considera estadísticamente significativa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nuestros estudios descubrieron que la formación del NM de JBNT y FN es rápida, lo que sucedió en 10 segundos. Como se muestra en la Figura 2,floccule blanco se obtuvo cuando la solución JBNT se mezcló con la solución FN y se pipeted varias veces. El proceso de formación de NM es completamente biomimético. No se necesitan estímulos externos. El proceso de fabricación es mucho más fácil que el de algunos biomateriales emergentes, que se basa en la luz ultravioleta o iniciador químico para el reticulamiento13.

Capturamos y analizamos las imágenes de la cámara de FN, JBNTs, y el NM (Figura 3). Para el grupo FN, a excepción de las manchas blancas cortas, no se observaron fibras largas. Los racimos cortos fueron las aglomeraciones proteicas que consisten en FN, lo que indica que la estructura de los andamios no se puede formar solo con FN sin JBNT(Figura 3A). Como se muestra en la Figura 3B, las fibras largas y más delgadas indican la existencia de JBNT. El ancho de las hebras blancas del NM es más ancho en comparación con los JBNT, lo que indica que los JBNT y el FN se relacionaron entre sí formando NM. La fibra NM puede crecer hasta varios centímetros de longitud(Figura 3C).

Obtuvimos los espectros UV-Vis para indicar el ensamblaje entre JBNT y FN. Como se muestra en la Figura 4,JBNTs exhibe dos picos de absorción a 220 nm y 280 nm, respectivamente. En comparación con los JBNT, el JBNT/FN NM tiene dos picos de absorción en la misma ubicación con un valor significativamente reducido, que era de JBNT pero afectado por los JBNTs autoensamblados no covalentes y FN en el medio.

TEM se utilizó para caracterizar la morfología de los JBNT y NM. Como se muestra en la Figura 5A,los JBNT son tubos delgados con diámetros uniformes. En condiciones neutrales, los JBNT se cobran positivamente mientras que el FN se carga negativamente. Cuando se mezclaron, formaron nm fibromas largos a través de interacciones de carga (Figura 5B). Cuando el pH es más bajo que el punto isoeléctrico del FN (pI de 5.5-6.0), los paquetes NM presentan la auto-liberación debido al FN cargado positivamente. Como se muestra en el cuadro 5C, cuando se conserva en una solución con el pH bajo (4.0), el NM fue desmontado, y mucho FN fue liberado del NM. El FN distribuido junto con el nanotubo es también una fuerte evidencia de que el NM fue fabricado por JBNTs y FN10.

Exploramos el efecto del JBNT/FN NM en la adhesión celular. Como se muestra en el cuadro 6,la densidad de adhesión celular del grupo NM mostró una diferencia significativa (valor p <0.05) del valor en comparación con el control negativo. La diferencia puede deberse a que el NM está diseñado para imitar morfológicamente ecm, que proporcionan un andamio para la adhesión celular14. El ECM se componía de colágenos y glicoproteínas adhesivas celulares, como la fibronectina15. El colágeno se ha presentado con la capacidad de promover una mayor adherencia y proliferación de hMSCs16. Además, se ha demostrado que la fibronectina mejora la adherencia de los hMSCs en el sitio lesionado, así como15. Las imágenes de fluorescencia también demostraron que la adherencia de los hMSC del grupo NM aumentó significativamente en comparación con el grupo de control negativo (Figura 7)15,17.

Figure 1
Figura 1: Ilustración esquemática del autoensamblaje jerárquico de JBNT con una cadena lateral lisina.
Esta figura se reimprime con permiso de la publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Demostración para el proceso autoensamblado del NM.
(A) Solución FN. (B) JBNTs mezclados con FN. Esta figura se reimprime con permiso de la publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Fotografías de Brightfield.
Fotografías de Brightfield de (A) FN (B) JBNTs y (C) NM formado por JBNT y FN. Cada área tiene un diámetro de 2 cm. Esta figura se reimprime con permiso de la publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Espectros de absorción de FN, JBNT y JBNT/FN NM.
Esta cifra se reimprime de la publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes TEM.
Imágenes TEM de (A) JBNTs (B) JBNT /FN NM, y (C) liberado JBNT / FN NM. Esta figura se reimprime con permiso de la publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Análisis estadístico de la adhesión celular.
La densidad de adherencia celular se registró en este experimento. *p<0.01 en comparación con los controles negativos. **p<0.05 solo en comparación con JBNT. N=3. Esta figura se reimprime con permiso de la publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Imágenes de fluorescencia.
Imágenes de fluorescencia de (A) los hMSCs y (B) el hMSC incubado con los JBNT. (C) el hMSC incubado con el FN. (D) el hMSC incubado con el JBNT/FN NM. Barra de escala: 100 μm. Esta figura se reimprime con permiso de la publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hora Un% B% C%
0.00 min 98 0 2
15.00 min 68 30 2
25.00 min 8 90 2
26.00 min 0 100 0

Tabla 1: Tiempo de elución de degradado.

Archivo suplementario 1: Esquema para la síntesis del monómero JBNT. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Archivo suplementario 2: Vídeo para el autoensamblaje del FN/JBNT NM. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En este estudio, desarrollamos un NM biomimético autoensamblado, que se formó con JBNTs e FN inspirados en el ADN. Al preparar la solución JBNT, el polvo liofilizado JBNT debe disolverse en el agua en lugar de PBS porque PBS causará aglomeración de JBNT, lo que inhibe su montaje. Además, el NM también debe ensamblarse en agua si queremos observar las estructuras nano-fibril del NM, porque la sal en PBS se agrupará con fibras NM, lo que puede reducir en gran medida la resolución de las imágenes.

El NM ha demostrado un gran potencial para servir como un nuevo andamio de ingeniería de tejidos, aunque se han hecho muchos esfuerzos para fabricar andamios regenerativos de tejido, que se utilizaron para facilitar la adhesión y la diferenciación de hMSCs. Sin embargo, la mayoría de estos materiales están prefaseados con una forma específica, como un andamio impreso en 3D18,19. Como tal, no son fáciles de implantar en sitios lesionados que están en lo profundo de la articulación. Sin embargo, la solución NM aquí se puede inyectar como líquido y luego servir como un andamio para la adhesión celular.

Una limitación es que el NM no es mecánicamente fuerte. A diferencia de los polímeros, se fabrican a través del autoensamblaje de interacciones novalentes, por lo que no pueden soportar mucha carga mecánica o tensión. Por otro lado, la estructura novalente también presenta muy buena biodegradabilidad y biocompatibilidad adecuada para funciones biológicas8,20,21.

El NM inyectable ha demostrado un gran potencial para proporcionar una ubicación objetivo y un andamio para la localización de MSC para mejorar la cicatrización de fractura ósea en el cuerpo. Sin embargo, cuando se inyecta en el sitio lesionado, el NM novalente puede no permanecer en su lugar durante mucho tiempo, lo que puede reducir el efecto terapéutico. En el futuro, exploraremos incorporar otros materiales (como hidrogeles) o alternar las estructuras NM para optimizar aún más las propiedades del andamio NM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

El Dr. Yupeng Chen es cofundador de NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Este trabajo cuenta con el apoyo financiero de NIH (Becas 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) y Universidad de Connecticut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dichloroethane Alfa Aesar 39121
2-cyanoacetic acid Sigma-Aldrich C88505
4-Dimethylaminopyridine TCI America D1450
8 wells Chambered Coverglass Thermo Fisher 155409
96-well plate Corning 353072
absolute ethanol Thermo Fisher BP2818500
acetone Sigma-Aldrich 179124
acetonitrile Sigma-Aldrich 34851
allylamine Sigma-Aldrich 145831
Basic Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC32G
citric acid Sigma-Aldrich 251275
concentrated hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Deionized water Thermo Fisher 15230147
dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
diethyl ether Sigma-Aldrich 296082
Di-tert-butyl dicarbonate Sigma-Aldrich 361941
ethyl acetate Sigma-Aldrich 319902
ethylcarbamate Sigma-Aldrich U2500
Fibronectin Thermo Fisher PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) Thermo Fisher R37814
guanidinium hydrochloride Alfa Aesar A13543
hexanes Sigma-Aldrich 227064
Human mesenchymal stem cells Lonza PT-2501
methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl iodide Sigma-Aldrich 289566
N,N-Diisopropylethylamine Alfa Aesar A17114
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
N-Methylmorpholine N-oxide Alfa Aesar A19802
Osmium tetraoxide Alfa Aesar 45385
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140163
Phosphate Buffer Solution Thermo Fisher 20012050
phosphoryl chloride Sigma-Aldrich 201170
potassium carbonate Sigma-Aldrich 347825
reverse phase column Thermo Fisher 25305-154630
Rhodamine Phalloidin Thermo Fisher R415
silica gel TCI America S0821
sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
sodium ethoxide Alfa Aesar L13083
sodium periodide Sigma-Aldrich 71859
sodium sulfate Sigma-Aldrich 239313
sodium sulfite Sigma-Aldrich S0505
sodium triacetoxyborohydride Alfa Aesar B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) Thermo Fisher ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit Lonza PT-3001
tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757
thioanisole Sigma-Aldrich T28002
toluene Sigma-Aldrich 179418
triethylamine Alfa Aesar A12646
trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198
Triton X-100 Thermo Fisher HFH10
Trypsin-EDTA solution Thermo Fisher 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
  2. Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
  3. Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
  4. De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
  5. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  6. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  7. Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
  8. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  9. Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
  10. Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
  11. Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
  12. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
  13. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
  14. Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
  15. Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
  16. Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
  17. Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
  18. Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
  19. Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
  20. Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
  21. Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).

Tags

Este mes en JoVE Número 159 nano-matriz autoensamblado Nanotubos base Janus fibronectina células madre mesenquimales adherencia
Fabricación de una nano-matriz biomimética con nanotubos base Janus y fibronectina para adherencia a células madre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen,… More

Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (159), e61317, doi:10.3791/61317 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter