Denne protokol bestemmer ligevægtsoptagelse, indtrængningsdybde og ikke-ligevægtsdiffusionshastighed for kationiske peptidbærere i brusk. Karakterisering af transportegenskaber er afgørende for at sikre en effektiv biologisk reaktion. Disse metoder kan anvendes til at designe en optimalt ladet stof bærere til målretning negativt ladede væv.
Flere negativt ladede væv i kroppen, ligesom brusk, udgør en barriere for den målrettede lægemiddellevering på grund af deres høje tæthed af negativt ladede aggrecaner og kræver derfor forbedrede målretningsmetoder for at øge deres terapeutiske respons. Fordi brusk har en høj negativ fast opladning tæthed, narkotika kan ændres med positivt ladede stof luftfartsselskaber til at drage fordel af elektrostatiske interaktioner, giver mulighed for øget intra-brusk narkotika transport. Undersøgelse af transport af narkotika bærere er derfor afgørende for at forudsige effekten af narkotika i at fremkalde en biologisk reaktion. Vi viser udformningen af tre eksperimenter, som kan kvantificere ligevægt optagelse, dybde penetration og ikke-ligevægt diffusion sats af kationiske peptid luftfartsselskaber i brusk explants. Ligevægt optagelse eksperimenter giver et mål for den opløste koncentration i brusk i forhold til dens omgivende bad, som er nyttigt for at forudsige potentialet i et lægemiddel luftfartsselskab i at øge terapeutisk koncentration af lægemidler i brusk. Dybden af penetrationsundersøgelser ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for visuel repræsentation af 1D-opløst diffusion fra den overfladiske til dybe zone af brusk, hvilket er vigtigt for vurderingen af, om opløselser når deres matrix og cellulære målsteder. Ikke-ligevægtsspiffusionsrate undersøgelser ved hjælp af et specialdesignet transportkammer gør det muligt at måle styrken af bindende interaktioner med vævsmatrixen ved at karakterisere diffusionsraterne for fluorescerende mærkede opløste stoffer på tværs af vævet; dette er gavnligt for at designe bærere af optimal bindingsstyrke med brusk. Tilsammen giver resultaterne fra de tre transporteksperimenter en retningslinje for design af optimalt ladede lægemiddelbærere, som udnytter svage og reversible afgiftsinteraktioner for anvendelser af lægemiddellevering. Disse eksperimentelle metoder kan også anvendes til at evaluere transport af narkotika og narkotika-narkotika luftfartsselskab konjugates. Yderligere, disse metoder kan tilpasses til brug i målretning andre negativt ladede væv såsom menisk, hornhinden og glasagtig humor.
Drug-levering til negativt ladede væv i kroppen er fortsat en udfordring på grund af den manglende evne til lægemidler til at trænge dybt ind i vævet for at nå celle og matrix mål steder1. Flere af disse væv består af tætpakkede, negativt ladede aggrecaner, som skaber en høj negativ fast ladningstæthed (FCD)2 i vævet og fungerer som en barriere for levering af de fleste makromolekyler3,4. Men med bistand fra positivt ladede stof luftfartsselskaber, denne negativt ladede væv barriere kan faktisk omdannes til et lægemiddel depot via elektrostatiske afgift interaktioner for vedvarende lægemiddellevering1,,5,6,7( Figur1).
Figur 1: Opladningsbaseret intrabrusklevering af CPC’er. Intra-led injektion af CPC’er i knæleddet rummet. Elektrostatiske interaktioner mellem positivt ladede CPC’er og negativt ladede aggrecangrupper muliggør hurtig og fuld dybdeindtrængning gennem brusk. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al4. Klik her for at se en større version af dette tal.
For nylig, kort længde kationiske peptid luftfartsselskaber (CPC) blev designet med det formål at skabe små kationiske domæner i stand til at bære større størrelse terapeutiske til levering til negativt ladede brusk4. For effektiv lægemiddellevering til brusk til behandling afudbredte 8,9 og degenerative sygdomme som slidgigt (OA) 10 , er detafgørende,at terapeutiske koncentrationer af lægemidler trænge dybt ind i vævet, hvor størstedelen af bruskceller (chondrocytter) ligger11. Selv om der er flere potentielle sygdom ændre lægemidler til rådighed, ingen har fået FDA godkendelse, fordi disse ikke er i stand til effektivt at målrette brusk12,,13. Derfor er det nødvendigt at evaluere transportegenskaberne for narkotikabærere for at forudsige lægemidlers effektivitet ved at fremkalde et terapeutisk respons. Her har vi designet tre separate eksperimenter, der kan udnyttes til at vurdere ligevægtsoptagelsen, penetrationsdybden og ikke-ligevægtsdiffusionshastigheden for CPC4.
For at sikre, at der er en tilstrækkelig lægemiddelkoncentration i brusken, som kan give et optimalt terapeutisk respons, blev optagelsesforsøg designet til at kvantificere ligevægts-CPC-koncentrationen i brusk4. I dette design, efter en ligevægt mellem brusk og dens omgivende bad, kan den samlede mængde af opløst inde i brusk (enten bundet til matrix eller gratis) bestemmes ved hjælp af en optagelse forhold. Dette forhold beregnes ved at normalisere koncentrationen af opløselighed inde i brusk til ligevægtsbadet. I princippet ville neutrale opløste stoffer, hvis diffusion gennem brusk ikke understøttes af afgiftsinteraktioner, have et optagelsesforhold på mindre end 1. Omvendt viser kationiske opløseligheder, hvis transport forstærkes via elektrostatiske interaktioner, et optagelsesforhold, der er større end 1. Som vist med CPC’er kan brugen af en optimal positiv ladning imidlertid resultere i meget højere optagelsesforhold (større end 300)4.
Selv om høj lægemiddelkoncentration i brusk er vigtigt for at opnå terapeutisk fordel, Er det også afgørende, at lægemidler diffuse gennem den fulde tykkelse af brusk. Derfor, undersøgelser, der viser dybden af penetration er nødvendig for at sikre, at narkotika nå dybt inde i brusk, således at matrix og cellulære mål websteder kan nås, hvilket giver en mere effektiv behandling. Dette eksperiment var designet til at vurdere envejsdiffusion af opløseligheder gennem brusk, der simulerer spredning af narkotika i brusk efter intra-artikulær injektion i vivo. Fluorescens billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for evaluering af dybden af indtrængning i brusk. Net partikel afgift spiller en central rolle i modererende hvordan dybe lægemidler kan diffuse gennem matrix. En optimal nettoladning baseret på et væv FCD er nødvendig for at give mulighed for svag reversibel bindende interaktioner mellem kationiske partikler og anioniske væv matrix. Dette indebærer, at enhver interaktion er svag nok, så partikler kan adskille sig fra matrixen, men vendbar i naturen, så den kan binde sig til et andet matrixbindingssted dybere inde i vævet4. Omvendt kan overdreven positiv nettoladning af en partikel være skadelig over for diffusion, da for stærk matrixbinding forhindrer løsrivelse af partikler fra det oprindelige bindingssted i den overfladiske bruskzone. Dette ville resultere i en utilstrækkelig biologisk respons , da de fleste af målpladserne ligger dybt inde i vævet11.
For yderligere at kvantificere styrken af de bindende interaktioner, analyse af narkotika diffusion satser gennem brusk er fordelagtig. Ikke-ligevægtsdiffusionsundersøgelser giver mulighed for at sammenligne diffusionsrater i realtid mellem forskellige opløste stoffer. Som narkotika diffuse gennem de overfladiske, midterste og dybe zoner af brusk, tilstedeværelsen af bindende interaktioner kan i høj grad ændre diffusion satser. Når der er bindende interaktioner mellem lægemidler og bruskmatrixen, defineres det som den effektive diffusivitet (DEFF). I dette tilfælde, når alle bindingssteder er blevet besat, er udbredelsen af narkotika styret af steady-state diffusion (DSS). Sammenligning mellem DEFF af forskellige opløste bestemmer den relative bindende styrke af opløselige stoffer med matrix. For en given opløst, hvis DEFF og DSS er inden for samme størrelsesorden, indebærer det, at der er minimal binding til stede mellem lægemidlet og matrix under diffusion. Men hvis DEFF er større end DSS, findes der en betydelig binding af partikler til matrix.
De designede eksperimenter individuelt giver mulighed for karakterisering af opløst transport gennem brusk, men en holistisk analyse inklusive alle resultater er nødvendig for at designe en optimalt ladet stof luftfartsselskab. Den svage og reversibel karakter af ladning interaktioner styrer partikel diffusion sats og giver mulighed for høj ligevægt optagelse og hurtig fuld dybde penetration gennem brusk. Gennem ligevægt optagelse eksperimenter, bør vi kigge efter bærere, der viser høj optagelse som følge af afgift interaktioner, som kan verificeres ved hjælp af ikke-ligevægt diffusion sats undersøgelser. Disse bindende interaktioner bør dog være svage og reversible for at give mulighed for fuld tykkelsesindtrængning af opløstet gennem brusk. En ideel stof luftfartsselskab ville have en optimal ladning, som gør det muligt stærk nok bindende for optagelse og høj intra-brusk stof koncentrationer, men ikke for stærk til at hindre fuld tykkelse diffusion4. De præsenterede forsøg vil hjælpe med design karakteristika for charge-baserede væv rettet mod narkotika bærere. Disse protokoller blev brugt til at karakterisere CPC transport gennem brusk4, men disse kan også anvendes på en række lægemidler og narkotika luftfartsselskaber gennem brusk og andre negativt ladede væv.
De metoder og protokoller, der er beskrevet her, er vigtige for området målrettet lægemiddellevering til negativt ladede væv. På grund af den høje tæthed af negativt ladede aggrecans til stede i disse væv, en barriere er skabt, hvilket forhindrer lægemidler i at nå deres cellulære mål websteder, der ligger dybt inde i matrix. For at løse denne udestående udfordring kan narkotika ændres til at omfatte positivt ladede narkotikabærere, som kan øge transportraten, optagelsen og bindingen af lægemidler i<sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af det amerikanske forsvarsministerium gennem Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) under kontrakt W81XWH-17-1-0085, og National Institute of Health R03 EB025903-1. AV blev finansieret af College of Engineering Dean’s Fellowship på Northeastern University.
316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18×18 mm |
Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7×2 mm |
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
Spatula | TedPella | 13508 | |
Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |