Summary

Karakterisering af intra-brusk Transport Egenskaber kationiske peptid luftfartsselskaber

Published: August 10, 2020
doi:

Summary

Denne protokol bestemmer ligevægtsoptagelse, indtrængningsdybde og ikke-ligevægtsdiffusionshastighed for kationiske peptidbærere i brusk. Karakterisering af transportegenskaber er afgørende for at sikre en effektiv biologisk reaktion. Disse metoder kan anvendes til at designe en optimalt ladet stof bærere til målretning negativt ladede væv.

Abstract

Flere negativt ladede væv i kroppen, ligesom brusk, udgør en barriere for den målrettede lægemiddellevering på grund af deres høje tæthed af negativt ladede aggrecaner og kræver derfor forbedrede målretningsmetoder for at øge deres terapeutiske respons. Fordi brusk har en høj negativ fast opladning tæthed, narkotika kan ændres med positivt ladede stof luftfartsselskaber til at drage fordel af elektrostatiske interaktioner, giver mulighed for øget intra-brusk narkotika transport. Undersøgelse af transport af narkotika bærere er derfor afgørende for at forudsige effekten af narkotika i at fremkalde en biologisk reaktion. Vi viser udformningen af tre eksperimenter, som kan kvantificere ligevægt optagelse, dybde penetration og ikke-ligevægt diffusion sats af kationiske peptid luftfartsselskaber i brusk explants. Ligevægt optagelse eksperimenter giver et mål for den opløste koncentration i brusk i forhold til dens omgivende bad, som er nyttigt for at forudsige potentialet i et lægemiddel luftfartsselskab i at øge terapeutisk koncentration af lægemidler i brusk. Dybden af penetrationsundersøgelser ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for visuel repræsentation af 1D-opløst diffusion fra den overfladiske til dybe zone af brusk, hvilket er vigtigt for vurderingen af, om opløselser når deres matrix og cellulære målsteder. Ikke-ligevægtsspiffusionsrate undersøgelser ved hjælp af et specialdesignet transportkammer gør det muligt at måle styrken af bindende interaktioner med vævsmatrixen ved at karakterisere diffusionsraterne for fluorescerende mærkede opløste stoffer på tværs af vævet; dette er gavnligt for at designe bærere af optimal bindingsstyrke med brusk. Tilsammen giver resultaterne fra de tre transporteksperimenter en retningslinje for design af optimalt ladede lægemiddelbærere, som udnytter svage og reversible afgiftsinteraktioner for anvendelser af lægemiddellevering. Disse eksperimentelle metoder kan også anvendes til at evaluere transport af narkotika og narkotika-narkotika luftfartsselskab konjugates. Yderligere, disse metoder kan tilpasses til brug i målretning andre negativt ladede væv såsom menisk, hornhinden og glasagtig humor.

Introduction

Drug-levering til negativt ladede væv i kroppen er fortsat en udfordring på grund af den manglende evne til lægemidler til at trænge dybt ind i vævet for at nå celle og matrix mål steder1. Flere af disse væv består af tætpakkede, negativt ladede aggrecaner, som skaber en høj negativ fast ladningstæthed (FCD)2 i vævet og fungerer som en barriere for levering af de fleste makromolekyler3,4. Men med bistand fra positivt ladede stof luftfartsselskaber, denne negativt ladede væv barriere kan faktisk omdannes til et lægemiddel depot via elektrostatiske afgift interaktioner for vedvarende lægemiddellevering1,,5,6,7( Figur1).

Figure 1
Figur 1: Opladningsbaseret intrabrusklevering af CPC’er. Intra-led injektion af CPC’er i knæleddet rummet. Elektrostatiske interaktioner mellem positivt ladede CPC’er og negativt ladede aggrecangrupper muliggør hurtig og fuld dybdeindtrængning gennem brusk. Dette tal er blevet ændret fra Vedadghavami et al4. Klik her for at se en større version af dette tal.

For nylig, kort længde kationiske peptid luftfartsselskaber (CPC) blev designet med det formål at skabe små kationiske domæner i stand til at bære større størrelse terapeutiske til levering til negativt ladede brusk4. For effektiv lægemiddellevering til brusk til behandling afudbredte 8,9 og degenerative sygdomme som slidgigt (OA) 10 , er detafgørende,at terapeutiske koncentrationer af lægemidler trænge dybt ind i vævet, hvor størstedelen af bruskceller (chondrocytter) ligger11. Selv om der er flere potentielle sygdom ændre lægemidler til rådighed, ingen har fået FDA godkendelse, fordi disse ikke er i stand til effektivt at målrette brusk12,,13. Derfor er det nødvendigt at evaluere transportegenskaberne for narkotikabærere for at forudsige lægemidlers effektivitet ved at fremkalde et terapeutisk respons. Her har vi designet tre separate eksperimenter, der kan udnyttes til at vurdere ligevægtsoptagelsen, penetrationsdybden og ikke-ligevægtsdiffusionshastigheden for CPC4.

For at sikre, at der er en tilstrækkelig lægemiddelkoncentration i brusken, som kan give et optimalt terapeutisk respons, blev optagelsesforsøg designet til at kvantificere ligevægts-CPC-koncentrationen i brusk4. I dette design, efter en ligevægt mellem brusk og dens omgivende bad, kan den samlede mængde af opløst inde i brusk (enten bundet til matrix eller gratis) bestemmes ved hjælp af en optagelse forhold. Dette forhold beregnes ved at normalisere koncentrationen af opløselighed inde i brusk til ligevægtsbadet. I princippet ville neutrale opløste stoffer, hvis diffusion gennem brusk ikke understøttes af afgiftsinteraktioner, have et optagelsesforhold på mindre end 1. Omvendt viser kationiske opløseligheder, hvis transport forstærkes via elektrostatiske interaktioner, et optagelsesforhold, der er større end 1. Som vist med CPC’er kan brugen af en optimal positiv ladning imidlertid resultere i meget højere optagelsesforhold (større end 300)4.

Selv om høj lægemiddelkoncentration i brusk er vigtigt for at opnå terapeutisk fordel, Er det også afgørende, at lægemidler diffuse gennem den fulde tykkelse af brusk. Derfor, undersøgelser, der viser dybden af penetration er nødvendig for at sikre, at narkotika nå dybt inde i brusk, således at matrix og cellulære mål websteder kan nås, hvilket giver en mere effektiv behandling. Dette eksperiment var designet til at vurdere envejsdiffusion af opløseligheder gennem brusk, der simulerer spredning af narkotika i brusk efter intra-artikulær injektion i vivo. Fluorescens billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi giver mulighed for evaluering af dybden af indtrængning i brusk. Net partikel afgift spiller en central rolle i modererende hvordan dybe lægemidler kan diffuse gennem matrix. En optimal nettoladning baseret på et væv FCD er nødvendig for at give mulighed for svag reversibel bindende interaktioner mellem kationiske partikler og anioniske væv matrix. Dette indebærer, at enhver interaktion er svag nok, så partikler kan adskille sig fra matrixen, men vendbar i naturen, så den kan binde sig til et andet matrixbindingssted dybere inde i vævet4. Omvendt kan overdreven positiv nettoladning af en partikel være skadelig over for diffusion, da for stærk matrixbinding forhindrer løsrivelse af partikler fra det oprindelige bindingssted i den overfladiske bruskzone. Dette ville resultere i en utilstrækkelig biologisk respons , da de fleste af målpladserne ligger dybt inde i vævet11.

For yderligere at kvantificere styrken af de bindende interaktioner, analyse af narkotika diffusion satser gennem brusk er fordelagtig. Ikke-ligevægtsdiffusionsundersøgelser giver mulighed for at sammenligne diffusionsrater i realtid mellem forskellige opløste stoffer. Som narkotika diffuse gennem de overfladiske, midterste og dybe zoner af brusk, tilstedeværelsen af bindende interaktioner kan i høj grad ændre diffusion satser. Når der er bindende interaktioner mellem lægemidler og bruskmatrixen, defineres det som den effektive diffusivitet (DEFF). I dette tilfælde, når alle bindingssteder er blevet besat, er udbredelsen af narkotika styret af steady-state diffusion (DSS). Sammenligning mellem DEFF af forskellige opløste bestemmer den relative bindende styrke af opløselige stoffer med matrix. For en given opløst, hvis DEFF og DSS er inden for samme størrelsesorden, indebærer det, at der er minimal binding til stede mellem lægemidlet og matrix under diffusion. Men hvis DEFF er større end DSS, findes der en betydelig binding af partikler til matrix.

De designede eksperimenter individuelt giver mulighed for karakterisering af opløst transport gennem brusk, men en holistisk analyse inklusive alle resultater er nødvendig for at designe en optimalt ladet stof luftfartsselskab. Den svage og reversibel karakter af ladning interaktioner styrer partikel diffusion sats og giver mulighed for høj ligevægt optagelse og hurtig fuld dybde penetration gennem brusk. Gennem ligevægt optagelse eksperimenter, bør vi kigge efter bærere, der viser høj optagelse som følge af afgift interaktioner, som kan verificeres ved hjælp af ikke-ligevægt diffusion sats undersøgelser. Disse bindende interaktioner bør dog være svage og reversible for at give mulighed for fuld tykkelsesindtrængning af opløstet gennem brusk. En ideel stof luftfartsselskab ville have en optimal ladning, som gør det muligt stærk nok bindende for optagelse og høj intra-brusk stof koncentrationer, men ikke for stærk til at hindre fuld tykkelse diffusion4. De præsenterede forsøg vil hjælpe med design karakteristika for charge-baserede væv rettet mod narkotika bærere. Disse protokoller blev brugt til at karakterisere CPC transport gennem brusk4, men disse kan også anvendes på en række lægemidler og narkotika luftfartsselskaber gennem brusk og andre negativt ladede væv.

Protocol

Der blev opnået universitetsgodkendelser for at udføre forsøgene med døde væv. Kvægled blev erhvervet kommercielt fra et slagteri. 1. Brusk explant udvinding Ved hjælp af en skalpel (#10 klinge), skære og fjerne fedt, muskler, ledbånd, sener og alle andre bindevæv til at udsætte brusk fra femoropatellar rille af kvæg knæled. Brug 3 mm og 6 mm dermale slag, gøre vinkelrette slag i brusk til at udtrække cylindriske stik. Stik i individuelle brønde på en 48-br…

Representative Results

Efter ligevægtabsorption af CPC’er ved brusk falder badets fluorescens, når opløsten er blevet taget af vævet. Men hvis fluorescensværdien af det endelige bad forbliver magen til den oprindelige, indikerer det, at der ikke er nogen / minimal opløst optagelse. En anden bekræftelse af opløst optagelse er, hvis vævet synligt har ændret farve til farven på fluorescerende farvestof. Den kvantitative optagelse af opløseligheder i brusk blev bestemt ved hjælp af optagelsesforholdet (RU), efter at fluores…

Discussion

De metoder og protokoller, der er beskrevet her, er vigtige for området målrettet lægemiddellevering til negativt ladede væv. På grund af den høje tæthed af negativt ladede aggrecans til stede i disse væv, en barriere er skabt, hvilket forhindrer lægemidler i at nå deres cellulære mål websteder, der ligger dybt inde i matrix. For at løse denne udestående udfordring kan narkotika ændres til at omfatte positivt ladede narkotikabærere, som kan øge transportraten, optagelsen og bindingen af lægemidler i<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev finansieret af det amerikanske forsvarsministerium gennem Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) under kontrakt W81XWH-17-1-0085, og National Institute of Health R03 EB025903-1. AV blev finansieret af College of Engineering Dean’s Fellowship på Northeastern University.

Materials

316 Stainless Steel SAE Washer McMaster-Carr 91950A044 For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate Fisherbrand 12566620 Black
Acrylic Thick Gauge Sheet Reynolds Polymer N/A For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 100x
Bovine Cartilage Research 87 N/A 2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin Fisher BioReagents BP671-1
CPC+14 LifeTein LT1524 Custom designed peptide
CPC+20 LifeTein LT1525 Custom designed peptide
CPC+8 LifeTein LT1523 Custom designed peptide
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34155
Dermal Punch MedBlades MB5-1 3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides Fisherbrand 12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates Corning Costar 3595 Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film Bemis Parafilm M Laboratory 1337412
Gold Seal Cover Glass Electron Microscopy Sciences 6378701 # 1.5, 18×18 mm
Hammer-Driven Hole Punch McMaster-Carr 3427A15 1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch McMaster-Carr 3427A19 3/4" Diameter
Laser Chroma Technology AT480/30m Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut McMaster-Carr 90480A007 6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope Zeiss LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars Bel-Art Spinbar F37119-0007 7×2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet McMaster-Carr 1370N12 1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk Sigma Aldrich M7409
Petri Dish Chemglass Life Sciences CGN1802145 150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline Corning 21-040-CMR 1x
Plate Shaker VWR 89032-088
Protease Inhibitors Thermo Scientific A32953
Razor Blades Fisherbrand 12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet Reynolds Polymer N/A Black transport chamber inserts
RTV Silicone Loctite 234323 Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel TedPella 549-3 #10, #11 blades
Signal Receiver Chroma Technology ET515lp Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22363204 1.5 mL
Spatula TedPella 13508
Synergy H1 Microplate Reader Biotek H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw McMaster-Carr 90128A153 6-32 Thread size, 1" Long

References

  1. Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
  2. Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).
  3. Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
  4. Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
  5. Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
  6. Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
  7. Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
  8. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  9. Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis – An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
  10. Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
  11. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  12. Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
  13. Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
  14. Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
  15. He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
  16. Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
  17. Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
  18. Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
  19. Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
  20. Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
  21. Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
  22. Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
  23. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
  24. Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
  25. Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
  26. Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
  27. Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
  28. Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
  29. Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).

Play Video

Cite This Article
Vedadghavami, A., Mehta, S., Bajpayee, A. G. Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers. J. Vis. Exp. (162), e61340, doi:10.3791/61340 (2020).

View Video