Summary
الجمع بين وضع العلامات النظائرية السلائف وseobaric وضع العلامات (cPILOT) هو نموذج معزز استراتيجية تعدد قادرة على زيادة عدد العينات التي يمكن تحليلها في وقت واحد مع العلامات isobaric المتاحة. وقد أدى دمج منصة الروبوتية إلى زيادة كبيرة في الإنتاجية التجريبية، وقابلية التكاثر، والدقة الكمية.
Abstract
لقد قدمنا عالية الإنتاجية الكمية proteomics سير العمل ، والجمع بين السلائف النظائر النظائرية ووضع علامات isobaric (cPILOT) قادرة على تعدد ما يصل إلى 22 أو 24 عينات مع علامات كتلة جنبا إلى جنب أو isobaric N ، N - dimethyl ليوتريك العلامات isobaric ، على التوالي ، في تجربة واحدة. هذه العينة المعززة multixing يقلل إلى حد كبير من حجم الاكتساب الطيفي الشامل ويزيد من فائدة الكواشف التجارية باهظة الثمن. ومع ذلك، يمكن أن تكون العملية اليدوية لمعالجة العينات وخطوات الأنابيب في الاستراتيجية كثيفة العمالة، تستغرق وقتاً طويلاً، وتُدخل فقدان العينة والخطأ الكمي. ويمكن التغلب على هذه القيود من خلال إدراج الأتمتة. هنا نقلنا بروتوكول cPILOT اليدوي إلى جهاز معالجة سائل آلي يمكنه إعداد أرقام عينة كبيرة (أي 96 عينة) بالتوازي. بشكل عام ، تزيد الأتمتة من جدوى و قابلية إنتاج cPILOT وتسمح بالاستخدام الواسع من قبل باحثين آخرين مع أجهزة أتمتة مماثلة.
Introduction
إن البروتيومات التي تعتمد على قياس الطيف الكتلي (MS) هو أداة بحثية لا غنى عنها في تحديد المؤشرات الحيوية الخاصة بأمراض معينة، وفهم تطور المرض، وخلق خيوط للتنمية العلاجية. ويمكن تحقيق ذلك من مجموعة من العينات السريرية المرتبطة بالأمراض مثل مصل الدم / البلازما ، والسوائل القريبة ، والأنسجة1،2. وقد اكتسبت مؤخرا اكتشاف العلامات الحيوية للبروتيوميات والتحقق من أهمية نظرا كبيرا نظرا لقوة استراتيجيات تعدد العينات3،4. تعدد الأساليب هو تقنية تمكن من المقارنة في وقت واحد وتكميم اثنين أو أكثر من حالات العينة داخل حقن MS واحد5،6. يتم تحقيق تعدد العينات عن طريق التكويد الببتيدات أو البروتينات من عينات متعددة مع العلامات الكيميائية أو الأنزيمية أو الأيضية والحصول على معلومات التصلب المتعدد من جميع العينات في تجربة MS /MS/MS واحدة. من بين العلامات isobaric المتاحة هي الكواشف الاليوبات (iTRAQ) ، والعلامات كتلة جنبا إلى جنب التجارية (TMT) ، وفي المنزل توليفها isobaric N ، N - dimethyl leucine (DiLeu) الكواشف مع قدرات تصل إلى 16 - plex7 و 21 - plex8، على التوالي.
السلائف الملصقات النظائرية ووضع علامات الايسوباريك (cPILOT) هو نموذج المحسنة تكنولوجيا تعدد. يجمع cPILOT بين وضع العلامات النظيرية للببتيد N-termini مع الضوء [−(CH3)2] والثقيلة [−(13C2H3)2] نظائر في درجة حَوية منخفضة (∼2.5)، والتي تحافظ على بقايا الليسين المتاحة للعلامة الهيدروجينية العالية اللاحقة (8.5) الوئيب باستخدام TMT، DiLeu، أو iTRAQ وضع العلامات3،9،10،11،12،13،14. ويصور مخطط وضع العلامات المزدوجة لاستراتيجية cPILOT في الشكل التكميلي 1 مع عينتين باستخدام الببتيد كمثال. يمكن أن تكون دقة ودقة القياس الكمي TMT على مستوى MS2 عرضة للخطر بسبب وجود أيونات مُنْعزلة ومُتَقَدَّدة مُنْثَلِية تُـعَدُّ تأثير التداخل15. ويمكن التغلب على هذا القيد في نسب أيونات المراسل غير الدقيقة بمساعدة مطياف الكتلة ثلاثية الزفير أوربيراب. على سبيل المثال، يمكن التغلب على تأثير التداخل عن طريق عزل الذروة في زوج من ثنائي الديمثيلات عند مستوى MS1 في مطياف الكتلة، مع إخضاع الذروة الخفيفة أو الثقيلة لتجزئة MS2 في فخ أيون الخطي ثم إخضاع الجزء MS2 الأكثر كثافة للحصول على معلومات كمية. من أجل زيادة فرص اختيار الببتيدات دون أمينات ليسين المتاحة لتوليد الأيونات مراسل، واقتناء انتقائي MS3 على أساس y-1 جزء يمكن أيضا أن تستخدم وهو النهج الذي يمكن أن يؤدي إلى نسبة أعلى من الببتيدات قابلة للقياس الكمي مع cPILOT9. مزيج من الضوء والثقيلة وضع العلامات يزيد من قدرات تعدد العينات من قبل عامل من 2x إلى أن يتحقق مع العلامات isobaric الفردية. لقد استخدمنا مؤخرا cPILOT للجمع بين ما يصل إلى 24 عينات في تجربة واحدة مع الكواشف DiLeu16. بالإضافة إلى ذلك وقد استخدمت cPILOT لدراسة الأكسدة بعد التعديلات الانتقالية14 بما في ذلك nitration البروتين17, proteomes العالمية الأخرى9, وقد أظهرت تطبيقات عبر عينات أنسجة متعددة في نموذج فأر مرض الزهايمر11.
إعداد العينة القوية هي خطوة حاسمة في تجربة cPILOT ويمكن أن تستغرق وقتًا طويلاً وشاقاً وواسع النطاق. يتطلب تعدد العيّنات المُحسّن أن يكون مُعدّلًا واسع النطاق من العاملين في المختبرات ذوي المهارات العالية، وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على قابلية إعادة إنتاج التجربة. على سبيل المثال، من الضروري التعامل بعناية مع العينات لضمان أوقات رد فعل مماثلة لجميع العينات وللحفاظ على درجة الH الاحتياطية المناسبة للعينات الخفيفة والثقيلة الباهتة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي إعداد عشرات إلى مئات العينات يدوياً إلى حدوث خطأ تجريبي مرتفع. ولذلك ، للحد من إعداد عينة من التباين ، وتحسين الدقة الكمية ، وزيادة الإنتاجية التجريبية ، وضعنا سير العمل cPILOT الآلي. يتحقق الأتمتة باستخدام جهاز معالجة سائلة آلية يمكن أن تكمل العديد من جوانب سير العمل (الشكل 1). تم إعداد العينة من القياس الكمي للبروتين إلى وضع العلامات الببتيد على معالج سائل آلي. يتم دمج معالج السائل الآلي مع جهاز الضغط الإيجابي (PPA) لتبادل العازلة بين الطور الصلب استخراج لوحات (SPE)، شاكر المدارية، وجهاز التدفئة / التبريد. تحتوي المنصة الروبوتية على 28 موقعًا للتخزين لاستيعاب اللوحات والمخازن المؤقتة. هناك نوعان من القرون مع القابض لنقل لوحات داخل مواقع سطح السفينة: 96 قناة رئيس الأنابيب ذات حجم ثابت (5-1100 ميكرولتر) و 8 مسابير حجم متغير قناة (1-1000 μL). يتم التحكم في النظام الأساسي الروبوتي باستخدام برنامج. يحتاج المستخدم إلى تدريب مهني قبل استخدام معالج السائل الروبوتي. تركز هذه الدراسة على أتمتة سير العمل اليدوي cPILOT ، والذي يمكن أن يكون كثيف العمالة لمعالجة أكثر من 12 عينة في دفعة واحدة. من أجل زيادة إنتاجية نهج cPILOT11، قمنا بنقل بروتوكول cPILOT إلى معالج سائل روبوتي لمعالجة أكثر من 10 عينات بالتوازي. كما تسمح الأتمتة بتفاعلات مماثلة لكل عينة بالتوازي أثناء خطوات مختلفة من عملية إعداد العينة ، والتي تتطلب مستخدمين مدربين تدريباً عالياً لتحقيقها أثناء CPILOT اليدوي. ويركز هذا البروتوكول على تنفيذ جهاز معالجة السوائل الآلي لتنفيذ cPILOT. وتصف هذه الدراسة بروتوكول استخدام هذا النظام الآلي وتوضح أدائه باستخدام تحليل "إثبات المفهوم" من نوع 22-plex لتجانسات كبد الماوس.
Protocol
تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في جامعة بيتسبرغ. تم شراء فأر مراقبة ذكر واحد (C57/BLJ) تجاريًا وتم إيواؤه في قسم الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة بيتسبرغ. تم تغذية الفئران معيار القوارض مختبر تشاو الإعلانية libitum وأبقى في 12 ساعة ضوء / دورة داكنة. تم حصاد أنسجة الكبد وتخزينها في -80 درجة مئوية.
1. استخراج البروتين
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوات يدوياً.
- غسل كبد الماوس (100 ملغ) مع المالحة ومتجانسة مع 500 ميكرولتر من 8 م اليوريا باستخدام التجانس الميكانيكية باستخدام مصفوفة lysing حبات ل 4 م / س لمدة 20 s.
ملاحظة: في هذه الدراسة، لم يتم إضافة مثبطات البروتياز أو الفوسفاتيز ولكن يمكن إضافتها إلى المخزن المؤقت إذا لزم الأمر، استناداً إلى التجربة. أيضا، يمكن تعديل خطوات استخراج البروتين وفقا لأنواع العينات المختلفة. - نقل تجانس الأنسجة إلى أنبوب جديد microcentrifuge، وشطف والجمع بين أنابيب اللين مع 100-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 8 M اليوريا.
- الطرد المركزي الأنسجة المتجانسة (12800 س ز،4 درجة مئوية، و 15 دقيقة) وجمع فائقة.
ملاحظة: يتم تنفيذ باقي الخطوات على معالج السائل الروبوتية المتوفرة في مختبر المستخدم. يجب أن يكون المعالج السائل قادرًا على التعرق وصرف المخازن المؤقتة من وإلى أنواع اللوحة المحددة لـ ANCI ، مع مشاركة المشغل الأدنى. - تحديد تركيز البروتين باستخدام حمض ثنائي شونينيك (BCA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تشغيل PPA، التدفئة / جهاز التبريد، ومضخات التفريغ وتوصيل جميع الملحقات مع معالج السائل. المعالج السائل يظهر الضوء الأزرق بمجرد توصيله بالكمبيوتر وجاهزة للعمل.
- لصفيحة كاشفة 1 (96 لوحة جيدة)، أضف 30 ميكرولتر من 25 مل 1،4-ديثيوثريتول (DTT)، 25 mM 30 ميكرولتر من السيستين و 25 mM 30 ميكرولتر من iodoacetamide (IAA) إلى الصفوف 1 و 2 و 3 على التوالي.
- أضف 8 م يوريا و20 mM تريس مع 10 mM CaCl2 (pH 8.2) إلى لوحة خزان. إضافة 500 μL من 5٪ حمض فورميك إلى 2 مل لوحة بئر عميق، 20 μL من التربسين إلى الصف 1 من لوحة التربسين ومكان في موقع سطح السفينة كما هو محدد من قبل الأسلوب.
ملاحظة: IAA و trypsin تمت إضافتها إلى لوحة 96 جيدا قبل إضافة إلى العينة. - Aliquot 300 ميكرولتر من تجانس الكبد في أنبوب 500 ميكرولتر ووضعها على لوحة بئر 2 مل عميقة ومكان عند 4 درجة مئوية حتى بداية البروتوكول. لهذه التجربة، ولدت 22 aliquots من تجانس الكبد واحد.
ملاحظة: أضف معيارًا داخليًا لمراقبة الجودة (مثل القضيّة الـ(ألفا) البقرية أو البروتينات الخارجية الأخرى) مع نسبة 1 ميكروغرام قياسية: عينة بروتين 100 ميكروغرام. - تعريف حجم المخازن المؤقتة التي سيتم إضافتها إلى العينات بواسطة أسماء المتغيرات والقيمة كما في الجدول 1. استنادا إلى BCA، أدخل حجم العينة والتخزين المؤقت (8 M اليوريا) على جدول البيانات وإرفاقه على البرنامج (الجدول 2).
ملاحظة: قد يكون من الضروري تخفيف المزيد من مع المخزن المؤقت إذا كان تركيز البروتين مرتفعًا جدًا. وكانت التركيزات الناتجة عن العينة من أنسجة الكبد 10 ميكروغرام/ميكرولتر. تم تحسين حجم المخازن المؤقتة لبروتين 100 ميكروغرام. - إزالة أنابيب عينة من 4 درجة مئوية، ومكان على سطح الموقع المحدد من معالج السائل الآلي، والسماح لتدفئة لمدة 10 دقيقة.
- افتح الطريقة واتبع التعليمات لوضع النصائح المطلوبة (1070 و90 و 230 ميكرولتر) ، و labware في المواضع المطلوبة. مرة واحدة في كل labware والنصائح في مكان، عبر الاختيار مع تخطيط سطح السفينة النهائي وانقر فوق التالي لمتابعة البروتوكول.
ملاحظة: إعداد الموجهة بإعلام المستخدم لإضافة وحدة تخزين مطلوب من المخزن المؤقت إلى labware معينة استناداً إلى البروتوكول وموقع سطح السفينة إلى الاحتفاظ.
2. تقليل العينة، الألكيليشن والهضم
- تحميل 230 نصائح μL وpirate 90 ميكرولتر من 8 م يوريا من الخزان والاستغناء عن الصف 1 من الأسود 2 مل لوحة بئر عميق. إلغاء تحميل التلميحات. كرر هذه الخطوة حتى يتم إضافة 8 M اليوريا إلى جميع الآبار المقابلة للعينات 22.
ملاحظة: العازلة denaturation يفك هيكل ثلاثي الأبعاد البروتين إلى إنتاج البنية الأساسية حتى trypsin يمكن أن تعمل وكسر البروتين على نحو فعال. يمكن للماصات 8 قنوات التعرق أحجام مختلفة لقنوات 8 ويمكن الاستغناء عن مواقع مختلفة في labware. في هذه الخطوة جميع القنوات يستنشق نفس وحدة التخزين كما هو محدد في البرنامج. - بعد إضافة العازلة denaturation، تحميل 90 μL نصائح وpirate 10 ميكرولتر (يتوافق مع 100 ميكروغرام) من التجانس الكبد الماوس باستخدام ماصة 8 قنوات إلى 2 مل أسود لوحة بئر عميق. إلغاء تحميل التلميحات. كرر هذه الخطوة حتى يتم نقل كافة العينات 22.
- بعد كل نقل، قم بإجراء خطوة مزيج للتعرق والاستغناء 50 ميكرولتر من محتويات البئر ثلاث مرات لضمان خلط البروتين مع المخزن المؤقت ليظهر نسبة 1:1.
ملاحظة: إزالة عينة متجانسة المخزون ووضع في -80 درجة مئوية. - للحد من البروتينات المشوهة، قم بتحميل صف واحد من 90 ميكرولتر نصائح و 3 ميكرولتر من DTT من لوحة الكواد 1. الاستغناء DTT إلى الصفوف 1 و 2 من 2 مل أسود لوحة جيدا عميق وتفريغ النصائح.
ملاحظة: البروتين: يتم الحفاظ على نسبة داتولات DTT في 1:40 للحد من السندات من كبريتيد. ويستند حساب نسبة المول قبالة كتلة البروتين من الألبومين مصل الأبقار (BSA), وهو 66.5 × 103 ز / مول. - ختم لوحة عينة مع رقائق الألومنيوم واحتضان في 37 درجة مئوية ل600 s في 300 دورة في الدقيقة.
- أضف 30 ميكرولتر من 0.25 M IAM إلى الصف 3 من لوحة الكاشف 1 قبل الاستخدام ومكان على سطح السفينة. فك العيّنة والعودة إلى سطح السفينة.
ملاحظة: IAM حساس للضوء. - تحميل صف واحد من 90 نصائح μL، pirate 6 ميكرولتر من IAM من لوحة الكاشف 1 في الصف 3، والاستغناء إلى الصف 1 من لوحة العينة. إلغاء تحميل التلميحات.
ملاحظة: البروتين: يتم الحفاظ على نسبة العث في IAM عند 1:80 لكل عينة. يجب أن يتم هذا رد الفعل في الظلام. - ختم لوحة عينة واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 300 دورة في الدقيقة على جهاز التدفئة / التبريد.
ملاحظة: يتم الختم لوحة لمنع العينة من الضوء, التبخر وتسرب من البئر. - فك الميكل لوحة العينة وتحميل صف واحد من 90 نصائح μL وpirate 5 ميكرولتر من السيستين من لوحة الكاشف 1 في الصف 2. الاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة عينة وتفريغ النصائح. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: البروتين: يتم الحفاظ على نسبة المولى L-السيستين في 1:40. - ضع لوحة العينة على شاكر المدارية لأداء هزة موقوتة من 1800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 800 μL من 20 mM تريس العازلة مع 10 mM CaCl2 (درجة ص ف 8.2) إلى كل بئر من لوحة العينة لتخفيف تركيز اليوريا إلى 2 M. تفريغ النصائح.
ملاحظة: يعوق نشاط التربسين عند تركيزات اليوريا أعلى وبالتالي يجب تخفيضه إلى أقل من 2 M. وقد أجريت هذه الدراسة مع البروتين إلى نسبة المولى التربسين من 50: 1 ل 14 ساعة. - إضافة 20 ميكرولتر من التربسين إلى الصف 1، العمود 1-12 من لوحة 96 بئر ومكان في موقع محدد على سطح السفينة.
- تحميل صف واحد من 90 نصائح μL، pirate 2 ميكرولتر من التربسين من الصف لوحة التربسين 1، والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة العينة. إلغاء تحميل التلميحات.
- ختم لوحة واحتضان لمدة 14 ساعة في 37 درجة مئوية في 600 دورة في الدقيقة على جهاز التدفئة / التبريد.
- بعد الحضانة، فك الصماء لوحة عينة وإضافة 5٪ حمض فليك إلى الصف 3، العمود 1-12 من لوحة جمع بئر عميق ووضعها على سطح السفينة المحددة.
- وقف الهضم عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من 5٪ حمض فشكل من الصف 3 من لوحة حمض فليك والاستغناء عن لوحة عينة في الصفوف 1 و 2. إلغاء تحميل التلميحات.
3. Desalting الخطوة 1
- Desalt الببتيدات مع لوحة SPE تحتوي على 20 ملغ من Targa C-18 المواد. إصلاح وحدة التخزين لكل تبادل العازلة كما 600 μL وإصلاح الضغط إلى 100 mbar.
- تحميل 1070 نصائح μL وpirate 600 μL من الأسيتونيتريل والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة SPE. ضع لوحة SPE على PPA والضغط.
- باستخدام نفس النصائح، pirate 600 μL من الأسيتونيتريل والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة SPE. ضع لوحة SPE على PPA والضغط.
ملاحظة: يمكن تصريف التدفق إلى النفايات باستخدام مضخة شفط. - تحميل 1070 نصائح μL وpirate 600 ميكرولتر من العازلة A (100 ٪ من المياه في 0.1 ٪ من حمض الفينيك) والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة SPE. ضع لوحة SPE على PPA والضغط.
ملاحظة: إذا لم يتم تقليل حجم المخزن المؤقت بشكل ملحوظ حاول زيادة الضغط أو الوقت. - تحميل 2 صفوف من 1070 نصائح μL، pirate 534 ميكرولتر من العينات المهضومة، والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة SPE. ضع لوحة SPE على PPA والضغط. كرر هذه الخطوة حتى يتم تحميل كافة النماذج.
ملاحظة: منذ حجم الإجمالي بعد إضافة حمض فورميك سيكون 1068 μL وتمت إضافة العينات في تمريرتين. - تحميل 2 الصفوف من النصائح 1070 μL المستخدمة، pirate 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت A، والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة SPE. ضع لوحة SPE على PPA والضغط.
- كرر الخطوة أعلاه مرة واحدة لتنظيف العينة.
- تحميل صف 1 من 1070 نصائح μL، pirate 600 ميكرولتر من ACN: المياه (60:40) والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 من لوحة SPE. ضع لوحة SPE على قمة لوحة جمع لتزيين الببتيدات باستخدام PPA وتطبيق الضغط.
- كرر الخطوة المذكورة أعلاه إلى elute الببتيدات في لوحة جمع. جفف لوحة التجميع لتجف وتخزن في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
4. وضع علامة ديميثيلي (الببتيد N-termini)
- ضع النصائح المطلوبة (1070 و90 و 230 ميكرولتر) ، و labware في المواضع المطلوبة في البرنامج. مرة واحدة في كل labware والنصائح في مكان، عبر الاختيار مع تخطيط سطح السفينة النهائي وانقر فوق التالي لمتابعة البروتوكول.
- لصفيحة الكاشف 2، أضف 450 ميكرولتر من حمض الخليك بنسبة 1٪ و 50 ميكرولتر من الفورمالديهايد الخفيف (CH2O)، و50 ميكرولتر من الفورمالديهايد الثقيل(13CD2O)، و 150 ميكرولتر من حمض الفورميك إلى الصفوف 1 و 2 و 3 و 4 على التوالي.
- لصفيحة كاشفة 3 إضافة 50 ميكرولتر من CB الخفيفة، 50 ميكرولتر من CB الثقيلة، إلى الصفوف 1 و 2 و 50 ميكرولتر من الأمونيا إلى الصف 3 و 4.
- تحميل 2 صفوف من 230 μL نصائح وpirate 100 ميكرولتر من 1٪ حمض الخليك من الصف 1 من لوحة الكاشف 2 والاستغناء عن الببتيدات المجففة أسفل في لوحة عينة 2 (لوحة جمع من الخطوة desalting) الصفوف 1 و 2 وأداء اهتزاز الوقت لمدة 5 دقائق في 1800 دورة في الدقيقة.
- تحميل 90 نصائح μL وpirate 16 ميكرولتر من 60 مل (4٪) CH2O (37٪ wt/ v) من الصف 2 من لوحة الكاشف 2 والاستغناء إلى الصف 1 من لوحة العينة. إلغاء تحميل التلميحات.
- تحميل صف واحد من 90 نصائح μL وpirate 16 ميكرولتر من 60 mM (4٪) 13 CD2O (20٪ wt / v) من الصف 3 من لوحة الكاشف 2 والاستغناء إلى الصف 2 من لوحة العينة. إلغاء تحميل التلميحات.
ملاحظة: في هذه الدراسة الصف 1 يتوافق مع الضوء والصف 2 يتوافق مع عينات dimethylated الثقيلة (انظر الشكل 1). - تحميل 2 صفوف من 90 نصائح μL وpirate 16 ميكرولتر من 24 mM NaBH3CN و 24 mM NaBD3CN من الصف 1 و 2 من لوحة الكاشف 3 والاستغناء عن الصفوف 1 و 2، على التوالي من لوحة العينة.
- تفريغ النصائح وأداء هزة توقيت لمدة 15 دقيقة في 1800 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر المدارية.
ملاحظة: إضافة سيانوبوروهيدريد الصوديوم يبدأ رد الفعل وبالتالي للحد من التباين بين التجارب يتم تنفيذ هذه الخطوة مرة واحدة لكل دفعة. - تحميل صف 2 من 90 نصائح μL و 32 ميكرولتر من 1٪ الأمونيا (~ 28-30٪ V / v) من الصفوف 3 و 4 من لوحة الكاشف 3 والاستغناء عن الصفوف 1 و 2 على التوالي من لوحة العينة 2. إلغاء تحميل التلميحات.
ملاحظة: إضافة الأمونيا توقف التفاعل وبالتالي للحد من التباين بين التجارب يتم تنفيذ هذه الخطوة مرة واحدة لكل دفعة. - الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من الضوء والثقيلة (1:1) الببتيدات dimethylated إلى لوحة جديدة 2 مل عميق جيدا لسالات.
ملاحظة: في هذه الدراسة تم دمج 90 ميكرولتر من محتويات البئر من الصف 1 مع 90 ميكرولتر من الصف 2 من لوحة العينة 2 إلى لوحة جمع جديدة 2 مل (لوحة العينة 3). نسبة الضوء: خلط الثقيلة يعتمد على البروتوكول التجريبي، في هذه الدراسة تم استخدام نسبة 1:1. - تحميل 2 الصفوف من 230 μL نصائح وpirate 32 ميكرولتر من 5٪ حمض فليك إلى العينات مجتمعة وتنفيذ اهتزاز توقيت ل30 s في 1800 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: تعتمد كفاءة إزالة المزيج على درجة الوهن في خليط التفاعل، وأي تغيير في درجة الـ PH العازلة سيؤدي إلى وضع علامات غير مكتملة للببتيد N-termini. يجب أن تكون كفاءة إزالة التمين أكبر من 97٪ عند البحث عن التعديل الديناميكي في الببتيد N-termini. في هذه الدراسة كانت كفاءة وضع العلامات للضوء والببتيدات الثقيلة 99.7٪ و 99.5٪ على التوالي.
5. Desalting الخطوة 2
- أداء عينات من إزالة التشبع مماثلة للخطوة desalt 1 للعينات مجتمعة.
- جفف العينات في لوحة العينة باستخدام سرعة vac وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
6- وضع علامات على الترسبات ال Isobaric (بقايا ال ليس)
- اتبع إعداد labware الموجهة ووضع النصائح المطلوبة (1070 و 90 و 230 ميكرولتر) ، مع مخازن مناسبة. مرة واحدة في كل labware والنصائح في مكان، عبر الاختيار مع تخطيط سطح السفينة النهائي وانقر فوق التالي لمتابعة البروتوكول.
- أضف 250 ميكرولتر من 100 mM ثلاثية الإيثيل بيكربونات (TEAB)، 30 ميكرولتر من الهيدروكسيلمين (10٪ ث / الخامس) إلى الصفوف 1، و 2 من لوحة الكاشف 4. ضع أنابيب TMT على لوحة 2 مل في عمق جيدا وفقا لجدول البيانات في الجدول 3.
- احتفظ بأنبوب فارغ 1.5 مل في حامل حامل رف أنبوب لتجميع الببتيدات الموسومة. ضع لوحة العينة المجففة في P9 و TMT معالجة لوحة في P14.
- لإعادة تشكيل الببتيدات، تحميل 230 نصائح μL وpirate 100 ميكرولتر من 100 mM ثلاثية الإيثيل بيكربونات (TEAB) العازلة (pH ~ 8.5) من الصف 1 في لوحة TEAB والاستغناء إلى الببتيدات المجففة في الصف 3 من لوحة عينة 3. ضع اللوحة على الشاكر المداري لمدة 30 s عند 1800 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: إعادة تشكيل 100 ميكروغرام من الببتيدات الباهتة في تركيز 1 ميكروغرام/ميكرولتر. - تحميل 90 نصائح μL وpirate 10 ميكرولتر من الأسيتونيتريل اللامائية من H12 من لوحة TMT والاستغناء في كل من أنابيب TMT المجففة.
- إزالة أنابيب TMT، دوامة، وسريع تدور الأنابيب والعودة إلى سطح السفينة في لوحة بئر عميق.
- تحميل صف 1 من 90 نصائح μL وpirate 12.5 ميكرولتر من الببتيدات dimethylated مجتمعة والاستغناء عن الصف 1 من لوحة معالجة TMT. إلغاء تحميل التلميحات.
ملاحظة: تم الحفاظ على TMT: نسبة الببتيد في 1:8 لهذه التجربة. - تحميل صف 1 من 90 نصائح μL وpirate 10 ميكرولتر من TMT والاستغناء عن الصف 1 من لوحة معالجة TMT. افرغ النصائح، قم بإجراء هزة موقوتة لمدة ساعة واحدة عند 1800 دورة في الدقيقة.
- تحميل صف 1 من 90 نصائح μL وpirate 8 ميكرولتر من الهيدروكسيلمين (10٪ ث / الخامس) من الصف 2 في لوحة TEAB والاستغناء إلى الصف 1 من لوحة معالجة TMT. افرغ النصائح، قم بأداء هزة موقوتة لمدة 15 دقيقة عند 1800 دورة في الدقيقة.
- الجمع بين 30.5 μL من الببتيدات TMT المسمى من TMT معالجة لوحة إلى 1.5 مل أنبوب. قم بإلغاء تحميل التلميحات بعد كل عملية نقل.
- إزالة أنبوب مع العينات المجمعة وتجف لتتبخر الأسيتريتريل. إعادة الببتيدات في 0.2 مل من الماء في 0.1 ٪ حمض فليك والعودة إلى سطح السفينة.
ملاحظة: كفاءة وضع العلامات من وضع علامات isobaric هو أيضاً الرقم PH محددة وينبغي أن تكون كفاءة وضع العلامات فوق 98% لكل تعليمات الشركة المصنعة. في هذه الدراسة كان TMT وضع العلامات كفاءة من الببتيدات الخفيفة وثقل lysine إنهاء 99.4٪ و 99.5٪ على التوالي.
7. إزالة السيلتينغ خطوة
- أداء عينات من إزالة التشبع مماثلة لساللت 1 لعينة واحدة.
- جفف العينات وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
8. الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) و MS3
- إعادة تكوين الببتيدات في MS الصف المياه مع 0.1٪ FA للحصول على ~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز. عينات مرشح مع أنابيب microcentrifuge تحتوي على مرشح 0.65 μm. ببتيدات الطرد المركزي في 12000 س ز لمدة 3 دقائق ووضع تدفق من خلال إلى قارورة العينات لصناعة السيارات.
ملاحظة: يمكن تأكيد تركيز الببتيد في هذه المرحلة إذا رغبت في ذلك. الببتيدات سوف تحتاج إلى إعادة تشكيلها في LC-MS درجة المياه وتخضع لـ BCA الببتيد المقايسة. في هذه الدراسة، لم يتم إجراء فحص الببتيد BCA وكانت تستند جميع كميات الببتيد على تحليل البروتين الأولي BCA. - إعداد العازلات المرحلة المتنقلة على النحو التالي: 100٪ (v/v) المياه مع 0.1٪ FA (A) و 100٪ ACN مع 0.1٪ FA (B).
- حقن 1 ميكرولتر من العينة على عمود فخ معبأة مع 2 سم من مادة C18 (3 ميكرومتر، 100 Å المسام الحجم).
ملاحظة: عينة التنظيف على فخ على النحو التالي: 10 دقيقة, 100% A; 2 ميكرولتر/دقيقة باستخدام نظام كروماتوغرافي سائل 2D. - تشغيل أسلوب الفصل التحليلي. استخدام 100 ميكرومتر i.d. x 26 سم ليزر سحبت طرف انصهر السيليكا عمود الشعيرات الدموية معبأة مع مادة C18 (2.5 μm، 100 Å). التدرج هو: 0-10 دقيقة، 10٪ B؛ 10-30 دقيقة، 10-15٪ B؛ 30-75 دقيقة، 15-30٪ B؛ 75-88 دقيقة، 30-60٪ B؛ 88-92 دقيقة، 60-90٪ B؛ 92-99 دقيقة، 90٪ B؛ 99-100 دقيقة، 90-10٪ B، 100-120 دقيقة، 10٪ B؛ 300 nL/min، 120 دقيقة.
- تشغيل الحصول على البيانات لمطياف الكتلة أثناء تشغيل طريقة الفصل التحليلية.
- استخدام المعلمات التالية لمسح المسح MS: 375-1,500 م / z،120،000 القرار، دورة وقت 3 s (السرعة القصوى)، التحكم الآلي في الكسب (AGC) الهدف 4.0e5، الحد الأقصى وقت الحقن 50 مللي ثانية.
- استخدم المعلمات التالية لـ CID-MS/MS مع مصيدة الأيونات: عمليات الاكتساب المعتمدة على البيانات (DDA) لكل نتيجة، عرض العزلة 2 م/ز، 35% طاقة التصادم المُطَوَّل (NCE)، 0.25 تنشيط q، 10 مللي ثانية وقت التفعيل، 1.0e4 AGC، 100 مللي ثانية أقصى وقت الحقن.
- استخدم المعلمات التالية لHCD-MS3 SPS 10: مسح نطاق 100-400 م / z،عدد من الأشعة التابعة 10، AGC 5.0e4، الحد الأقصى وقت الحقن 118 مللي ثانية، HCD اصطدام الطاقة 55٪، MS2 نافذة العزل 2.
9 - تحليل البيانات
- البحث عن ملفات RAW التي تم إنشاؤها للحصول على قائمة من البروتينات والببتيدات باستخدام برنامج تحليل البروتين مقابل قاعدة بيانات مناسبة.
ملاحظة: تم البحث عن ملفات RAW التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة مقابل قاعدة بيانات Uniprot ماوس. - منذ هناك كل من الضوء والثقيلة وضع العلامات في ملف RAW واحد ، والبحث في كل ملف مع اثنين من سير العمل للضوء والببتيدات dimethylated الثقيلة.
- البحث في ملفات RAW ضد قاعدة بيانات Uniprot الماوس (07/13/2019) مع تسلسل 53035 مع المعلمات التالية: تريبسين الانقسام مع اثنين من الانقسامات غاب الحد الأقصى، الببتيد مع الحد الأدنى 6 الأحماض الأمينية طول، 15 جزء في المليون التسامح الجماعي الأم، 1 Da تجزئة التسامح التعديلات الثابتة: ثنائي التخويل الخفيف (+28.031، الببتيد N-terminus) أو ثنائي الديمتيل الثقيل (+36.076 دا، الببتيد N-terminus)، كارباميدوميثيل (+57.021 Da، C)، والتعديلات الديناميكية: الأكسدة (+15.995 دا، M)، 11-plex ايوباتريك الوسم (229.163 دا، K)، 1٪ FDR، مراسل أيون quantification مع 30 جزء في المليون ذروة التسامح التكامل، المركزية الأكثر ثقة لطريقة التكامل.
ملاحظة: قمة dimethylated الثقيلة يشمل أيضا تعديل آخر الذي هو ~ 7 دا (+35.069 دا، الببتيد N-terminus) من ذروة dimethylated الخفيفة، وبالتالي ينبغي إدراج عقدة بحث أخرى لتشمل هذا التعديل أيضا. - أداء كمية أيون مراسل على أساس كثافة، 65٪ لم يتم إجراء التطابق الشامل SPS، متوسط نسبة S / N 10، التصحيح النظائري، التطبيع والتحجيم.
ملاحظة: يمكن إجراء عملية التطبيع والتقجيم على أساس إجمالي كمية الببتيد أو بروتين معين يضاف إلى العينة. ويمكن أيضا أن تكون العينات QC المدرجة في القنوات للالتطبيع بين الدفعات أو داخل دفعة على أساس 2-الذيل المرجعية الداخلية التحجيم18. لم يتم توفير التلوث النظائري لمختلف قنوات TMT للبحث ، وينصح المستخدمين لإضافة تلوث النظائر من أيونات مراسل مختلفة.
Representative Results
ويبين الشكل 2 بيانات MS التمثيلية لببتيد تم تحديدها في جميع القنوات الأيونية المراسلة الـ 22 من تجربة cPILOT 22-plex، بما في ذلك تكرار سير العمل. الشكل 2 (أعلى) يصور زوج ذروة مشحونة بشكل مضاعف مفصولة بتباعد 4 Da m/z يشير إلى مجموعة من الديميثيل مدمجة في الببتيد. تم عزل أزواج الذروة الباهتة الخفيفة والثقيلة المجزأة وجزئت بشكل مستقل لتسفر عن تسلسل الببتيد. تسلسل الببتيد هو G (dimethyl) AAELMQQK (TMT-11plex) ويتوافق مع البروتين Betaine-homocysteine S-methyl transferase. تم عزل الأيونات المجزأة الأكثر كثافة لكل من القمم الباهتة الخفيفة والثقيلة(غير المعروضة)لتفتيت MS3 وتظهر الأيونات المراسلة(m/z 126-131) في الشكل 2 (أسفل). المراسل كثافة الأيونات هي متناسبة مباشرة مع وفرة الببتيد في العينة. وفرة الببتيد من العينات يعني قدرة الأنابيب من منصة الروبوتية موحدة إلى حد ما عبر العينات 22. وعموما، أدت هذه التجربة 22-plex cPILOT إلى 1326 (1209-light/1181-heavy) تحديد البروتينات الناتجة عن 3098 (6137-light/5872-heavy) الببتيدات(الجدول 4). ويبين الشكل 3 قطعة مربع من وفرة log10 مقابل مجموع كثافة أيون المراسل عبر جميع القنوات 22 التي تظهر أقل بين البئر / بين العينات المتغيرة. تم تقييم الأتمتة الإجمالية من خلال دراسة الخطأ في وفرة أيون المراسلين عبر كل بروتين في العينات الـ 22. ويبين الشكل 4 أن معالجة العينة مع النظام الأساسي الروبوتي أدى إلى قيم السيرة الذاتية منخفضة جداً. على وجه التحديد، عبر الببتيدات 3098 حددت متوسط السيرة الذاتية في وفرة أيون مراسل كان 12.36٪ و 15.03٪ للببتيدات الباهتة الخفيفة والثقيلة، على التوالي. من بين هذه الببتيدات 2032 من هذه الببتيدات كان مراسل إشارة أيون فوق الحد الأدنى عتبة واعتبرت قابلة للقياس الكمي.
الشكل 1- الـ 1 سير العمل التجريبي لمعالجة 22 عينة بالتوازي مع بروتوكول cPILOT الآلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2- الانبعاثات 2 من 100 القياس الكمي للببتيدات عبر 22 عينة. مثال MS (أعلى) و MS3 (أسفل) أطياف من الببتيد G (dimethyl) AAELMQQK (TMT-11plex) كميا في 22-PLEX الآلي cPILOT التجربة للضوء dimethylated (أسفل اليسار) والثقيلة dimethylated (أسفل اليمين) قمم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3- الانبعاثات 100-11 مربع مؤامرة من مجموع المراسل أيونات الشدة مقابل log10 وفرة من 22 عينات باستخدام مكتشف البروتيوم 2.3. تم البحث في الملف الخام مرتين عن الببتيدات الخفيفة والثقيلة ، معرفات البروتينات بشكل منفصل مع TMT كتعديلات ديناميكية ، الضوء (+28.031 Da) وثقيل (+36.076 & +35.069 Da) ثنائي الفينيل في الببتيد N -termini كتعديلات ثابتة. تم تشغيل بحث مشترك مع جميع التعديلات المذكورة أعلاه باستخدام Proteome Discover 2.3 للحصول على سجل 10 وفرة من شدة الببتيد عبر جميع القنوات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4- الانبعاثات 100 100 كمان المؤامرات من كفاءة المشاركة في الاختلاف من وفرة الببتيد من ملخص أيونات مراسل كثافة عبر القنوات 126-131 م / ض. تم تحديد الببتيد كمياً بمتوسط قيمة السيرة الذاتية 12.36 و15.03 للضوء (2373) والثقيلة (2533) الببتيدات القابلة للقياس الكمي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1. رسم توضيحي لـ cPILOT مع ببتيد واحد. إظهار النظائر وضع العلامات من عينتين مختلفة وsciobaric وضع العلامات مع TMT126، تم حقن الخليط الناتج إلى MS لLC-MS3. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
| اسم المتغير | قيمه | وصف |
| DesaltSamp1 | 1065 | وحدة التخزين التي ستستخدم للخطوة desalt 1 |
| DesaltSamp2 | 392 | حجم لاستخدامها في الخطوة desalt 2 |
| DesaltSamp3 | 100 | حجم لاستخدامها في الخطوة desalt 3 |
| Devmode | كاذبه | سوف كاذبة خفض أوقات الحضانة إلى 30sec- صحيح سيتبع توقيت الحضانة في البروتوكول. |
| DTTVol | 3 | حجم DTT |
| لوحة تصفية | Targa | لوحة تستخدم لتحلية |
| تصفية بلافول | 600 | حجم إزالة السيلت |
| HAWaterWashes | كاذبه | عدد من يغسل المياه على لوحة SPE |
| IAMVol | 2 | حجم iodoacetamide |
| الببتيدTMTVol | 12.5 | حجم الببتيد لوضع العلامات TMT |
| الضغط | 100 | ضغط mbar في PPA |
| TempOffSet | 1 | تغير في درجة الحرارة |
| TMTVol | 10 | وحدة تخزين علامات Isobaric التي سيتم إضافتها |
| TrisVol | 800 | حجم لتخفيف العينة قبل الهضم |
| تريبسينفول | 2 | حجم التربسين |
| UsePopTimer | صحيح | يعرض True خيارات لتطبيق الضغط على اللوحة إذا لزم الأمر |
الجدول 1- الانبعاثات 1000 قائمة بالمتغيرات المستخدمة في بروتوكول cPILOT الآلي.
| ديلسورس | ديلويل | Dest | ديست ويل | ديلفولومي | StockSource | ستوكويل | SampleVol | معرف العينات |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 1 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 2 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 3 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 4 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 5 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 6 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 7 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 8 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 9 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 10 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 11 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | A12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 12 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 13 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 14 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 15 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 16 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | باء٥ | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 17 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 18 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 19 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 20 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 21 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 22 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 23 |
| 8M_Urea | 1 | عينات | B12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 24 |
الجدول 2- حجم الماوس التجانس الكبد و 8 م اليوريا.
| سورس ويل | مصدر ويل2 | مراسل ايون | DestWell1 | DestWell2 | حجم | معرف العينات |
| A1 | جيم 1 | 126 | A1 | E1 | 10 | 1 |
| A3 | جيم 3 | 127N | A2 | هاء2 | 10 | 2 |
| A5 | جيم 5 | 127C | A3 | E3 | 10 | 3 |
| A7 | جيم 7 | 128N | A4 | هاء -4 | 10 | 4 |
| A9 | جيم 9 | 128C | A5 | E5 | 10 | 5 |
| A11 | C11 | 129N | A6 | E6 | 10 | 6 |
| B2 | مد 2 | 129C | A7 | E7 | 10 | 7 |
| B4 | دال4 | 130N | A8 | E8 | 10 | 8 |
| B6 | مد ٦ | 130C | A9 | E9 | 10 | 9 |
| B8 | دال 8 | 131N | A10 | E10 | 10 | 10 |
| B10 | D10 | 131C | A11 | E11 | 10 | 11 |
الجدول 3- الانبعاثات 100 من 10 العدد الإجمالي للبتيدات والبروتينات والتطابقات الطيفية الببتيدية (PSMs).
| cPILOT الآلي | ||
| ضوء | الثقيله | |
| البروتينات | 1209 | 1181 |
| الببتيدات | 6137 | 5872 |
| PSMs | 14948 | 16762 |
الجدول 4 - 100 100 دولار باركودينغ العلامات isobaric مع عينات خفيفة وثقيلة وصفت.
Discussion
cPILOT هي استراتيجية متعددة متعددة المحسنة التي يمكن أن تحليل ما يصل إلى 24 عينات في تجربة واحدة. تعتمد القدرة المتعددة على عدد مجموعات العلامات النظائرية وال Isobaric المتاحة. إدخال TMTpro7، التي هي قادرة على وضع علامات 16 عينات في تجربة واحدة ، يمكن أن تدفع حدود cPILOT إلى 32-plex. يتكون cPILOT من خطوات متعددة من الأنابيب ويتطلب رعاية واسعة ومهارات المستخدم لأداء إعداد العينة. حتى مع وجود مستخدم خبير ، فإن الأخطاء اليدوية أمر لا مفر منه ، مما يدعو إلى استخدام الأنظمة الأساسية الروبوتية لمعالجة العينات في استراتيجية cPILOT. منذ CPILOT يستخدم علامات pH تعتمد على الببتيدات، يجب الحفاظ على مادة PH للضوء ومجموعة من العينات dimethylated الثقيلة. يمكن أن يؤدي الأسي الحمضية الخفيفة إلى تينيثيليشن لكل من بقايا N-termini والليسين. ميزة من cPILOT هو أنه يتطلب سوى نصف علامات isobaric منذ الببتيد N-termini مشغولة مع مجموعات ثنائي الفينيل. وهذا يتيح لعدد أكبر من العينات أن تحمل علامات نصف التكلفة. يتطلب التعامل مع أعداد العينات الأكبر أن تكون أوقات التعرض للكاشف متشابهة للعينة الأولى والأخيرة في دفعة. يمكن الحصول على موزع ماصة يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 32 عينة بالتوازي مع استخدام أجهزة معالجة السائل الروبوتية.
من أجل معالجة عينات متعددة من قبل cPILOT ، تم تعديل سير العمل اليدوي لدمج التشغيل الآلي. معالج السائل الروبوتية المستخدمة في هذه الدراسة اثنين من القرون مع 96 قناة و 8 قنوات الأنابيب القدرات، مع القابض لوضع لوحات في المواقع المتاحة سطح السفينة 28. يتم دمج معالج السائل مع جهاز الضغط الإيجابي، شاكر المدارية، وجهاز لتسخين / تبريد العينات في لوحة 96 جيدا. ويساعد جهاز الضغط الإيجابي في إجراء عمليات التبادل العازلة في لوحات SPE أثناء التنظيف، بينما يساعد الشاكر المداري على الدوامة/خلط العينات. تمت برمجة المنصة الروبوتية لتسفط وصرف المخازن المؤقتة والعينات إلى 96 بئرًا، واحتضان، وعينات دوامة، ولوحات نقل. السوائل ذات اللزوجة المختلفة، مثل الأسيتونيتريل والماء، تتطلب اعتبارات محددة الأنابيب التي يمكن أيضا أن تكون مبرمجة في الطريقة.
وقد تم تنفيذ سير عمل cPILOT ، بدءا من القياس الكمي للبروتين من قبل BCA إلى وضع العلامات الببتيدات مع علامات الايسوباريك (أي TMT) على نظام معالج السائل. تم تحجيم البروتوكول الكامل لاستخدام 96 لوحات بئر عميق يمكن أن تعقد 2 مل في البئر. وقد أعدت المخازن المؤقتة قبل بدء التجربة وأضيفت إلى لوحة البئر 96 بحيث تسمح بمعالجة العينات المتوازية. في هذه الدراسة، 22 تكرار سير العمل من التجانس الكبد الماوس تمت إضافتها إلى لوحات البئر العميق واتخذت من خلال بروتوكول cPILOT. وأخيرا، تم حقن عينة واحدة تتكون من الكبد 22-plex ماوس ثنائي الببتيدات الموسومة في مطياف الكتلة. أظهرت كثافة أيونات المراسل المقابلة لوفرات الببتيد في العينات أن العينات المعالجة مع معالج السائل لديها السير الذاتية أقل من البروتوكول اليدوي(البيانات غير مبينة). كما حسنت المنصة الروبوتية إلى حد كبير إمكانية إعادة إنتاج معالجة العينات. إن قابلية التكاثر والمتانة عاملان هامان للغاية أثناء معالجة أعداد كبيرة من العينات. يمكن أن تؤدي أخطاء الأنابيب إلى تفسير خاطئ كامل للبيانات وهنا وفرت منصة الروبوتية تباينًا منخفضًا بين العينات. كما أن استخدام النظام الأساسي الروبوتي لـ cPILOT قلل من الوقت اللازم لإعداد العينات. على سبيل المثال، بعد تطوير الطريقة الآلية، تطلب الأمر 2.5 ساعة لمعالجة 22 عينة مقارنة بـ 7.5 ساعة لـ cPILOT اليدوي. التجارب مستمرة في مختبرنا لإجراء مزيد من التقييم مقارنات سير العمل اليدوي والآلي cPILOT. استنادا إلى التقارير السابقة من مختبرنا، والسيرة الذاتية٪، من البروتين مراسل كثافة الأيونات في cPILOT اليدوي كانت في المتوسط 20٪ مع بعض القيم المتطرفة تتجاوز هذه القيمة12.
cPILOT هي استراتيجية اشتقاق كيميائية على مستوى الببتيد، يمكن استخدامها لأي نوع من العينات مثل الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم. cPILOT يقدم متعددة العينة المحسنة ومع دمج الأتمتة يمكن أن يسهل multixing عينة عالية الإنتاجية في proteomics. هذا الإنتاج ضروري للمضي قدما في المرض والفهم البيولوجي واكتشاف العلامات البيولوجية.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يعترف المؤلفان بأموال بدء العمل في جامعة فاندربيلت وجائزة المعاهد القومية للصحة (R01GM117191) لـ RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
| 2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
| C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
| Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
| Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
| Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
| Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
References
- Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
- Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
- Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
- Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
- King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
- Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).
