Summary
Kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) är en förstärkt prov multiplexing strategi som är kapabel att öka antalet prover som kan analyseras samtidigt med tillgängliga isobaric taggar. Införlivandet av en robotplattform har kraftigt ökat experimentell genomströmning, reproducerbarhet och kvantitativ noggrannhet.
Abstract
Vi har infört en hög genomströmning kvantitativa proteomik arbetsflöde, kombinerade föregångare isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) kan multiplexera upp till 22 eller 24 prover med tandem massa taggar eller isobaric N,N-dimetyl leucin isobaric taggar, respektive, i ett enda experiment. Detta förbättrade prov multiplexing avsevärt minskar massa spektrometri förvärv gånger och ökar nyttan av de dyra kommersiella isobaric reagenser. Den manuella processen för provhantering och pipetteringssteg i strategin kan dock vara arbetsintensiv, tidskrävande och införa provförlust och kvantitativt fel. Dessa begränsningar kan övervinnas genom införlivandet av automatisering. Här överförde vi det manuella cPILOT-protokollet till en automatiserad vätskehanteringsanordning som kan förbereda stora provnummer (dvs. 96 prover) parallellt. Sammantaget ökar automatiseringen genomförbarheten och reproducerbarheten av cPILOT och möjliggör bred användning av andra forskare med jämförbara automationsenheter.
Introduction
Masspektrometri (MS)-baserade proteomik är ett oumbärligt forskningsverktyg för att identifiera sjukdomsspecifika biomarkörer, förstå sjukdomsprogression, och skapa leads för terapeutisk utveckling. Detta kan uppnås från en rad sjukdomsrelaterade kliniska prover såsom blodserum/plasma, proximala vätskor, och vävnader1,2. Proteomics biomarkör upptäckt och validering har nyligen fått betydande övervägande på grund av kraften i prov multiplexering strategier3,4. Prov multiplexing är en teknik som möjliggör samtidig jämförelse och kvantifiering av två eller flera prov villkor inom en enda MS injektion5,6. Prov multiplexering uppnås genom barcoding peptider eller proteiner från flera prover med kemiska, enzymatiska eller metaboliska taggar och erhålla MS information från alla prover i en enda MS eller MS / MS experiment. Bland de tillgängliga isobaric taggar är isobaric taggning reagenser (iTRAQ), kommersiell tandem massa taggar (TMT), och i huset syntetiserade isobaric N,N-dimetyl leucin (DiLeu) reagenser med kapacitet upp till 16-plex7 och 21-plex8, respektive.
Kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) är en förbättrad prov multiplexing teknik. cPILOT kombinerar isotopisk märkning av peptid N-termini med ljus [−(CH3)2] och tung [−(13C2H3)2] isotoper vid lågt pH (∼2,5), som håller lysinresterna tillgängliga för efterföljande högt pH (8,5) isobaricmärkning med hjälp av TMT, DiLeu, eller iTRAQ-märkning3,9,10,11,12,13,14. CPILOT-strategins dubbla märkningsschema avbildas i Supplemental Figure 1 med två prover med hjälp av en exempelpeptid. Noggrannheten och precisionen i den TMT baserade kvantifieringen på MS2-nivån kan äventyras på grund av förekomsten av förorenande samisolade och co-fragmenterade joner som benämns som störningseffekten15. Denna begränsning i felaktiga reporterjonsförhållanden kan övervinnas med hjälp av tribrid Orbitrap masspektrometrar. Till exempel kan interferenseffekten övervinnas genom att isolera en topp i ett dimetylerat par på MS1-nivå i masspektrometern, utsätta den lätta eller tunga toppen för MS2-fragmentering i den linjära jonfällan och sedan utsätta det mest intensiva MS2-fragmentet för HCD-MS3 för att erhålla kvantitativ information. För att öka chanserna att välja peptiderna utan lysinaminer som finns för att generera reporterjoner, kan ett selektivt MS3-förvärv baserat på y-1-fragmentet också användas och är ett tillvägagångssätt som kan resultera i en högre andel peptider som är kvantifierbara med cPILOT9. Kombinationen av lätta och tunga märkning ökar prov multiplexing kapacitet med en faktor 2x till som uppnås med enskilda isobaric taggar. Vi har nyligen använt cPILOT för att kombinera upp till 24 prover i ett enda experiment med DiLeu reagenser16. Dessutom cPILOT har använts för att studera oxidativa post-translationella modifieringar14 inklusive protein nitration17, andra globala proteomer9, och har visat applikationer över flera vävnadsprover i en Alzheimers sjukdom mus modell11.
Robust provberedning är ett kritiskt steg i ett cPILOT-experiment och kan vara tidskrävande, mödosamt och omfattande. Förstärkt provpleducering kräver omfattande pipettering och högkvalificerad laboratoriepersonal, och det finns flera faktorer som starkt kan påverka reproducerbarheten av experimentet. Till exempel är noggrann hantering av prover nödvändig för att säkerställa liknande reaktionstider för alla prover och för att upprätthålla lämpligt buffert pH för lätta och tunga dimetylerade prover. Vidare kan manuell beredning av tiotals till hundratals prover införa hög experimentell fel. Därför, för att minska prov beredning variabilitet, förbättra kvantitativ noggrannhet, och öka experimentella genomströmningen, vi utvecklat en automatiserad cPILOT arbetsflöde. Automatisering uppnås med hjälp av en enhet för hantering av robotteknikvätska som kan slutföra många aspekter av arbetsflödet (Bild 1). Provberedning från proteinkvantifiering till peptidmärkning utfördes på en automatiserad vätskehanterare. Den automatiserade vätskehanteraren är integrerad med en PPA (positive pressure apparatus) för buffertutbyten mellan SPE-plattorna (solid-phase extraction), orbital shaker och en uppvärmnings-/kylanordning. Robotplattformen innehåller 28 däcksplatser för att rymma tallrikar och buffertar. Det finns två pods med en gripare för att överföra plattorna inom däcksplatserna: ett 96-kanals fast volym pipetteringshuvud (5-1100 μL) och 8 kanals variabla volymsonder (1-1000 μL). Robotplattformen styrs med hjälp av en programvara. Användaren måste vara professionellt utbildad innan du använder den robotliknande vätskehanteraren. Den föreliggande studien fokuserar på att automatisera det manuella cPILOT-arbetsflödet, som kan vara arbetskrävande för bearbetning av mer än 12 prover i en enda sats. För att öka genomströmningen avcPILOT-inflygningen 11, överförde vi cPILOT-protokollet till en robotflytande hanterare för att bearbeta mer än 10 prover parallellt. Automatiseringen tillåter också liknande reaktioner för varje prov parallellt under olika steg av provberedningsprocessen, vilket krävde att mycket utbildade användare skulle uppnå under manuell cPILOT. Detta protokoll fokuserar på genomförandet av den automatiserade vätskehanteringsanordningen för att utföra cPILOT. Den föreliggande studien beskriver protokollet för att använda detta automatiserade system och visar dess prestanda med hjälp av en 22-plex "proof-of-concept" analys av muslever homogenates.
Protocol
Alla djur protokoll godkändes av institutionella Animal Care and Use kommittén vid University of Pittsburgh. En manlig kontroll mus (C57/BLJ) köptes kommersiellt och inrymt i avdelningen för laboratoriedjur resurser vid University of Pittsburgh. Möss utfodrades standard gnagare laboratorium chow ad libitum och hålls i en 12 h ljus / mörk cykel. Levervävnaden skördades och förvarades vid −80 °C.
1. Protein extraktion
OBS: Dessa steg utförs manuellt.
- Tvätta muslever (100 mg) med saltlösning och homogenat med 500 μL av 8 M urea med hjälp av en mekanisk homogenisator med hjälp av lysningsmatris A pärlor för 4 m/s för 20 s.
OBS: I denna studie tillsattes proteas eller fosfatashämmare inte utan får vid behov tillsättas i bufferten, baserat på experimentet. Också, protein extraktion steg kan justeras i enlighet med olika provtyper. - Överför vävnadshomogenatet till ett nytt mikrocentrifugrör, skölj och kombinera lysningsrören med 100-500 μL PBS med 8 M urea.
- Centrifugera de homogeniserade vävnaderna (12,800 x g, 4 °C, och 15 min) och samla upp supernatanten.
OBS: Resten av stegen utförs på den robotflytande hanterare som finns i användarens laboratorium. Vätskehanteraren måste kunna aspirera och dispensera buffertar från och till ANCI-angivna plåtstyper, med minimalt operatörsdeltagande. - Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av en bicinchoninsyra (BCA) analys enligt tillverkarens anvisningar.
- Slå på PPA, värme/ kyla enheten, och vakuumpumparna och anslut alla tillbehör med flytande hanterare. Vätskehanteraren visar ett blått ljus när den är ansluten till datorn och redo att fungera.
- Till reagensplatta 1 (96 brunnsplatta), tillsätt 30 μL på 25 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL cystein och 25 mM 30 μL av iodoacetamid (IAA) till raderna 1, 2 respektive 3.
- Tillsätt 8 M urea och 20 mM Tris med 10 mM CaCl2 (pH 8.2) till en reservoarplatta. Tillsätt 500 μL av 5% myrsyra till 2 mL djup brunnsplatta, 20 μL trypsin till rad 1 trypsinplatta och placera på däcksplatsen enligt metoden.
OBS: IAA och trypsin lades till 96 brunnsplattan innan du adderade till provet. - Alikvot 300 μL av levern homogenate till ett 500 μL rör och placera på en 2 mL djup brunnsplatta och placera vid 4 °C tills protokollet börjar. För detta experiment genererades 22 alikvoter från den enda levern homogenate.
OBS: Tillsätt en intern kvalitetskontrollstandard (t.ex., bovint alfa-casein eller annat exogent protein) med förhållandet 1 μg standard: 100 μg proteinprov. - Definiera volymen av buffertar som ska läggas till proverna med variabelnamn och värde enligt tabell 1. Baserat på BCA, ange volymen av prov och normalisering buffert (8 M urea) på ett kalkylblad och bifoga till programvaran (Tabell 2).
OBS: Ytterligare utspädning med buffert kan vara nödvändig om proteinkoncentrationen är för hög. De resulterande koncentrationerna för prov från levervävnaden var 10 μg/μL. Volymen av buffertar optimerades för 100 μg protein. - Ta bort provrör från 4 °C, placera på den angivna däckplatsen för den automatiserade vätskehanteraren, och låt värmas i 10 min.
- Öppna metoden och följ anvisningarna för att placera de nödvändiga spetsarna (1070, 90, och 230 μL), och labware i önskade positioner. När alla labware och tips är på plats, dubbelkolla med den slutliga däck layout och klicka på Nästa för att fortsätta protokollet.
OBS: Den guidade ställa in informerar användaren att lägga till en erforderlig volym buffert till den specifika labware beroende på protokollet och däck plats som skall hållas.
2. Provreduktion, alkylering och matsmältning
- Ladda 230 μL-spetsar och aspirera 90 μL av 8 M urea från reservoaren och dosera till rad 1 av den svarta 2 mL djupa brunnsplattan. Lasta av spetsarna. Upprepa detta steg tills 8 M urea läggs till alla brunnarna som motsvarar de 22 proverna.
OBS: Denatureringsbufferten varvar ned proteinets tredimensionella struktur för att ge den primära strukturen så trypsin kan agera och bryta proteinet effektivt. Den 8-kanalspipett kan aspirera olika volymer för de 8 kanalerna och kan dispensera till olika platser i labware. I detta steg alla kanaler aspirerade samma volym som definieras i programvaran. - Efter tillsats av denaturationsbufferten, ladda 90 μL-spetsarna och aspirera 10 μL (motsvarar 100 μg) av muslever homogenate med hjälp av 8-kanalspipetten till den svarta 2 mL djupa brunnsplattan. Lasta av spetsarna. Upprepa detta steg tills alla de 22 proverna överförs.
- Efter varje överföring, utför en mix steg till aspirate och dispensera 50 μL av brunnen innehållet tre gånger för att säkerställa blandning av proteinet med bufferten för att uppvisa en 1:1 ratio.
OBS: Avlägsna lager homogenat prov och placera i -80 °C. - För att minska de denaturerade proteinerna, ladda en rad med 90 μL-spetsar och aspirera 3 μL DTT från reagensplattan 1. Dispensera DTT till raderna 1 och 2 av den svarta 2 mL djupa brunnsplattan och lossa spetsarna.
OBS: Proteinet: DTT molar förhållandet bibehålls vid 1:40 för minskning av disulfid obligationer. Beräkningen för molarförhållandet baseras på proteinmassan av bovint serumalbumin (BSA), som är 66,5 x 103 g/mol. - Täta provplattan med aluminiumfolie och inkubera vid 37 °C för 600 s vid 300 rpm.
- Tillsätt 30 μL på 0,25 M IAM till rad 3 av reagensplåt 1 strax före användning och placera på däck. Unseal provplattan och återgå till däck.
OBS: IAM är ljuskänsligt. - Ladda en rad med 90 μL-spetsar, aspirera 6 μL IAM från reagensplattan 1 vid rad 3, och dispensera till rad 1 av provplattan. Lasta av spetsarna.
OBS: Proteinet: IAM molar förhållandet bibehålls vid 1:80 för varje prov. Denna reaktion måste göras i mörkret. - Täta provplattan och inkubera vid 4 °C i 30 min vid 300 varv/min på värme-/kylanordningen.
OBS: Tätning av plattan utförs för att förhindra att provet från ljus, avdunstning och spillning från brunnen. - Unseal provplattan och ladda en rad med 90 μL-spetsar och aspirera 5 μL cystein från reagensplattan 1 vid rad 2. Dispensera till raderna 1 och 2 på provplattan och lossa spetsarna. Inkubera i rumstemperatur i 30 min.
OBS: Proteinet: L-cystein molar förhållandet bibehålls vid 1:40. - Placera provplattan på orbitalskakern för att utföra en tidsenlig skakning på 1800 rpm i 30 min.
- Tillsätt 800 μL av 20 mM Tris buffert med 10 mM CaCl2 (pH 8.2) till varje brunn av provplattan för att späda ureakoncentrationen till 2 M. Lossa spetsarna.
OBS: Trypsinaktivitet hindras vid högre karbamidkoncentrationer och därav måste den minskas till mindre än 2 M. Denna studie utfördes med ett protein till trypsin molar förhållandet 50: 1 för 14 h. - Tillsätt 20 μL trypsin till rad 1, kolumn 1-12 av en 96 brunnsplatta och placera på en angiven plats på däcket.
- Ladda en rad med 90 μL-spetsar, aspirera 2 μL trypsin från trypsin-plattan rad 1, och dispensera till raderna 1 och 2 av provplattan. Lasta av spetsarna.
- Täta plattan och inkubera i 14 h vid 37 °C vid 600 rpm på värme/kylanordningen.
- Efter inkubation, unseal provet plattan och tillsätt 5% myrsyra till rad 3, kolumn 1- 12 av en djup brunn insamlingsplatta och placera den på angivna däck.
- Stoppa matsmältningen genom att tillsätta 150 μL av 5% myrsyra från rad 3 av myrsyraplattan och dispensera till provplatta vid raderna 1 och 2. Lasta av spetsarna.
3. Avsaltning steg 1
- Desalt peptiderna med SPE-platta som innehåller 20 mg Targa C-18 material. Fixera volymen för varje buffertutbyte som 600 μL och fixera trycket till 100 mbar.
- Ladda 1070 μL-spetsar och aspirera 600 μL acetonitril och dispensera till raderna 1 och 2 av SPE-plattan. Placera SPE-plattan på PPA och applicera tryck.
- Med hjälp av samma spetsar, aspirera 600 μL acetonitril och dispensera till raderna 1 och 2 av SPE-plattan. Placera SPE-plattan på PPA och applicera tryck.
OBS: Genomströmningen kan dräneras till avfall med hjälp av en sugpump. - Ladda 1070 μL-spetsar och aspirera 600 μL buffert A (100 % vatten i 0,1 % myrsyra) och dispensera till raderna 1 och 2 av SPE-plattan. Placera SPE-plattan på PPA och applicera tryck.
OBS: Om volymen av bufferten inte minskar avsevärt försöka öka trycket eller tiden. - Ladda 2 rader med 1070 μL-spetsar, aspirera 534 μL rötade prover, och dispensera till raderna 1 och 2 av SPE-plattan. Placera SPE-plattan på PPA och applicera tryck. Upprepa det här steget tills alla prov är laddade.
OBS: Eftersom den totala volymen efter tillsats av myrsyra kommer att vara 1068 μL och proverna tillsattes i två pass. - Ladda 2 rader med använda 1070 μL-spetsar, aspirera 600 μL buffert A, och dispensera till raderna 1 och 2 av SPE-plattan. Placera SPE-plattan på PPA och applicera tryck.
- Upprepa ovanstående steg en gång för att rengöra provet.
- Ladda 1 rad med 1070 μL spetsar, aspirera 600 μL ACN: Vatten (60:40) och dispensera till raderna 1 och 2 av SPE-plattan. Placera SPE-plattan ovanpå en uppsamlingsplatta för att elera peptiderna med hjälp av PPA och applicera tryck.
- Upprepa ovanstående steg för att elera peptiderna i uppsamlingsplattan. Torka uppsamlingsplattan till torrhet och förvara vid -80° C tills vidareförädling.
4. Dimetylation Märkning (peptid N-termini)
- Placera de nödvändiga spetsarna (1070, 90, och 230 μL), och labware i önskade positioner i programvaran. När alla labware och tips är på plats, dubbelkolla med den slutliga däck layout och klicka på Nästa för att fortsätta protokollet.
- Till reagensplatta 2, tillsätt 450 μL av 1% ättiksyra, 50 μL lätt formaldehyd (CH2O), 50 μL av tung formaldehyd (13CD2O), och 150 μL av myrsyra till raderna 1, 2, 3 respektive 4.
- För att reagensplatta 3 tillsätt 50 μL lätt CB, 50 μL tung CB, till raderna 1 och 2 och 50 μL av Ammoniak till rad 3 och 4.
- Ladda 2 rader med 230 μL-spetsar och aspirera 100 μL av 1% ättiksyra från rad 1 reagensplatta 2 och dispensera till de torkade ner peptiderna i provplatta 2 (uppsamlingsplatta från avsaltningssteget) 1 och 2 och utför en tidsbestämd skakning i 5 min vid 1800 rpm.
- Ladda 90 μL-spetsar och aspirera 16 μL på 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) från rad 2 av reagensplåt 2 och dispensera till rad 1 av provplattan. Lasta av spetsarna.
- Ladda 1 rad med 90 μL-spetsar och aspirera 16 μL på 60 mM (4%) 13 CD2O (20% wt/v) från rad 3 av reagensplåt 2 och dispensera till rad 2 av provplattan. Lasta av spetsarna.
OBS: I denna studie rad 1 motsvarar ljus och rad 2 motsvarar tunga dimetylerade prover (Se figur 1). - Ladda 2 rader med 90 μL-spetsar och aspirera 16 μL på 24 mM NaBH3CN och 24 mM NaBD3CN från rad 1 och 2 i reagensplåt 3 och dispensera till raderna 1 respektive 2 av provplattan.
- Lossa spetsarna och utför en tidsenlig skakning i 15 min vid 1800 rpm med hjälp av orbital shaker.
OBS: Lägga natrium cyanoborohydrid initierar reaktionen därmed för att minska variabilitet mellan experiment detta steg utförs en gång per sats. - Ladda 2 rad med 90 μL-spetsar och aspirera 32 μL av 1% ammoniak (~28-30% v/v) från raderna 3 och 4 i reagensplåt 3 och dispensera till raderna 1 respektive 2 av provplattan 2. Lasta av spetsarna.
OBS: Lägga till ammoniak stoppar reaktionen därmed för att minska variabiliteten mellan experiment detta steg utförs en gång per sats. - Kombinera lika stora volymer av lätta och tunga (1:1) dimetylerade peptider till en ny 2 mL djup brunnsplatta för desaltning.
OBS: I denna studie kombinerades 90 μL av brunnsinnehållet från rad 1 med 90 μL av rad 2 från provplatta 2 till en ny 2 mL uppsamlingsplatta (Provplatta 3). Förhållandet mellan ljus: tung blandning beror på experimentprotokollet, i denna studie användes ett 1:1-förhållande. - Ladda 2 rader med 230 μL-spetsar och aspirera 32 μL av 5% myrsyra till de kombinerade proverna och utför en tidsanskaka i 30 s vid 1800 rpm.
OBS: Dimetylationseffektiviteten beror på reaktionsblandningens pH-värde och varje förändring av buffert pH-värdet kommer att resultera i ofullständig märkning av peptiden N-termini. Dimetylation effektivitet bör vara större än 97% när sökte som dynamisk modifiering vid peptiden N-termini. I denna studie var märkningseffektiviteten hos lätta och tunga peptider 99,7% respektive 99,5%.
5. Avsaltning steg 2
- Utför provdesaltering som liknar desaltsteget 1 för de kombinerade proverna.
- Torka proverna i provplattan med hjälp av en hastighetsvapp och förvara vid -80 °C tills vidare bearbetning.
6. Isobaric taggning (Lys rester)
- Följ den guidade labware-installationen och placera de nödvändiga tipsen (1070, 90 och 230 μL), med lämpliga buffertar. När alla labware och tips är på plats, dubbelkolla med den slutliga däck layout och klicka på Nästa för att fortsätta protokollet.
- Tillsätt 250 μL av 100 mM trietyl ammoniumbikarbonat (TEAB), 30 μL hydroxylamin (10% w/v) till raderna 1, och 2 av reagensplåt 4. Placera TMT-rören på 2 mL-plattan med djup brunn som per kalkylbladet i tabell 3.
- Håll ett tomt 1,5 mL rör i en tubrackhållare för poolning av de taggade peptiderna. Placera den torkade dunprovplattan på P9 och TMT-bearbetningsplåt på P14.
- För att rekonstruera peptiderna, ladda 230 μL-spetsar och aspirera 100 μL av 100 mM trietyl ammoniumbikarbonat (TEAB) buffert (pH ~8.5) från rad 1 vid TEAB-platta och dispensera till de torkade peptiderna vid rad 3 av provplatta 3. Placera plattan på orbital shaker för 30 s på 1800 rpm.
OBS: Rekonstruera 100 μg dimetylerade peptider vid en koncentration av 1 μg/μL. - Ladda 90 μL-spetsar och aspirera 10 μL vattenfri acetonitril från H12 av TMT-plattan och dosera i vart och ett av de torkade TMT-rören.
- Ta bort TMT-rören, virvel, och snabb spinn rören och återgå till däck i djup brunn plattan.
- Ladda 1 rad med 90 μL-spetsar och aspirera 12,5 μL av de kombinerade dimetylerade peptiderna och dispensera till rad 1 i TMT-bearbetningsplattan. Lasta av spetsarna.
OBS: Den TMT: peptid förhållandet bibehölls vid 1:8 för detta experiment. - Ladda 1 rad med 90 μL-spetsar och aspirera 10 μL TMT och dispensera till rad 1 på TMT-bearbetningsplattan. Lossa spetsarna, utför en tidsenad shake i 1 timme vid 1 800 varv/min.
- Ladda 1 rad med 90 μL-spetsar och aspirera 8 μL hydroxylamin (10 % w/v) från rad 2 vid TEAB-plåt och dispensera till rad 1 på TMT-bearbetningsplattan. Lossa spetsarna, utför en tidsenad skakning i 15 min vid 1 800 varv/min.
- Kombinera 30,5 μL av de TMT-märkta peptiderna från TMT-bearbetningsplatta till 1,5 mL-rör. Lossa spetsarna efter varje överföring.
- Ta bort röret med de poolade proverna och torka för att avdunsta acetonitrilen. Rekonstruerade peptider i 0,2 mL vatten i 0,1 % myrsyra och återgår till däcket.
OBS: Märkningseffektiviteten för isobaricmärkning är också pH-specifik och märkningseffektiviteten bör ligga över 98 % per tillverkarens instruktioner. I denna studie TMT märkning effektivitet lysin avslutade lätta och tunga peptider var 99,4% och 99,5% respektive.
7. Desalting steg
- Utför provutsaltning som liknar desaltet 1 för ett prov.
- Torka proverna och förvara i -80 °C tills analysen.
8. Flytande kromatografi–Tandem masspektrometri (LC-MS/MS) och MS3
- Rekonstruera peptiderna i MS-kvalitet vatten med 0,1% FA för att få ~1 μg/μL koncentration. Filterprover med mikrocentrifugrör som innehåller ett 0,65 μm-filter. Centrifugera peptider på 12,000 x g för 3 min och placera flödet genom i en auto-sampler injektionsflaska.
OBS: Peptidkoncentrationen kan bekräftas i detta skede om så önskas. Peptiderna skulle behöva rekonstituerade i LC-MS-kvalitet vatten och omfattas av en BCA peptid analys. I denna studie, peptid BCA analysen utfördes inte och alla peptidmängder baserades på initial protein BCA analys. - Förbered de mobila fasbuffertarna enligt följande: 100% (v/v) vatten med 0,1% FA (A) och 100% ACN med 0,1% FA (B).
- Injicera 1 μL prov på en fällakolumn packad med 2 cm C18-material (3 μm, 100 Å porstorlek).
OBS: Prov rengöring på fällan är följande: 10 min, 100% A; 2 μL/min med hjälp av ett 2D-system för vätskekromatografi. - Kör analysseparationsmetoden. Använd en 100 μm i.d. x 26 cm laserdragna-spets smält kiseldioxid kapillär kolonn packad med C18 material (2,5 μm, 100 Å). Gradienten är: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min.
- Kör datainhämtningen för masspektrometern medan analysseparationsmetoden körs.
- Använd följande parametrar för MS-undersökningsgenomsökningen: 375-1 500 m/z, 120 000 upplösning, Cykeltid 3 s (topphastighet), mål för automatisk förstärkningskontroll (AGC) 4.0e5, maximal injektionstid 50 ms.
- Använd följande parametrar för CID–MS/MS med jonfälla: databeroende förvärvs (DDA) skanningar per utfall, 2 m/z isolationsbredd, 35 % normaliserad kollisionsenergi (NCE), 0,25 aktivering q, 10 ms aktiveringstid, 1.0e4 AGC, 100 ms maximal insprutningstid.
- Använd följande parametrar för HCD–MS3 SPS 10: Scan-området 100-400 m/z, antal beroende genomsökningar 10, AGC 5.0e4, maximal injektionstid 118 ms, HCD kollisionsenergi 55%, MS2 isoleringsfönster 2.
9. Dataanalys
- Sök genererade RAW-filer för listan över proteiner och peptider med hjälp av en programvara proteinanalys mot en lämplig databas.
OBS: DE RAW-filer som genereras i denna studie söktes mot en mus Uniprot databas. - Eftersom det finns både lätt och tung märkning i en RAW-fil, sök varje fil med två arbetsflöden för lätta och tunga dimetylerade peptider.
- Sök i RAW-filerna mot Mouse Uniprot-databasen (2019-07-13) med 53035-sekvens med följande parametrar: trypsin-klyvning med maximalt två missade klyvningar, peptid med minsta 6 aminosyror längd, 15 ppm förälder massa tolerans, 1 Da fragmentering tolerans Statiska modifieringar: ljus dimetylation (+28.031, peptid N-terminus) eller tunga dimetylation (+36.076 Da, peptid N-terminus), carbamidometyl (+57.021 Da, C), Dynamiska modifieringar: oxidation (+15.995 Da, M), 11-plex isobaric tag (229.163 Da, K), 1% FDR, reporter jon kvantifiering med 30 ppm topp integration tolerans, mest självsäker centroid för integrationsmetod.
OBS: Den tunga dimetylerade topp innehåller också en annan ändring som är ~ 7 Da (+35.069 Da, peptid N-ändstation) från den lätta dimetylerade toppen och därför en annan sökning nod bör införlivas för att inkludera denna modifiering också. - Utför reporter jon kvantifiering baserat på intensiteten, 65% SPS massa match, genomsnittliga S /N förhållandet 10, isotopiska korrigering, normalisering och skalning utfördes inte.
OBS: Normalisering och skalning kan utföras baserat på total peptidmängd eller ett specifikt protein som tillsätts provet. QC-prover kan också inkluderas i kanalerna för inter-batch- eller intra-batch-normalisering baserat på en tvåstjärtad intern referensskalning18. De isotopiska föroreningarna av olika TMT-kanaler tillhandahölls inte till sökningen, användare rekommenderas att lägga till isotopkontaminering av olika reporterjoner.
Representative Results
Figur 2 visar representativa MS-data av en peptid som identifierats i alla 22 reporterjonkanaler från ett 22-plex cPILOT-experiment, inklusive arbetsflödesreplikat. Bild 2 (överst) avbildar ett dubbelt laddat topppar som åtskiljs med 4 Da m/z mellanrum som anger en enda dimetylgrupp som ingår i peptiden. De lätta och tunga dimetylerade toppparen isolerades och fragmenterades oberoende av varandra för att ge peptidens sekvens. Sekvensen av peptiden är G(dimetyl)AAELMQQK(TMT-11plex) och motsvarar proteinet Betaine-homocystein S-metyltransas. De mest intensiva fragmentjonerna för både de lätta och tunga dimetylerade topparna (visas inte) isolerades ytterligare för MS3-fragmentering och reporterjonerna (m/z 126-131) visas i figur 2 (nederst). Reporterjonintensiteterna står i direkt proportion till peptidöverflödet i provet. Peptidöverflödet av proverna innebär att robotplattformens pipettförmåga är ganska enhetlig över de 22 proverna. Sammantaget resulterade detta 22-plex cPILOT experiment i 1326 (1209-light/1181-tung) identifieringar proteiner till följd av 3098 (6137-light/5872-tung) peptider (Tabell 4). Figur 3 visar rutan tomt av log10 överflöd kontra totalt reporter jonintensiteter över alla de 22 kanaler som visar mindre inter-well/inter-sample variabilitet. Utvärdering av den totala automatiseringen gjordes genom att undersöka felet i reporterjonöverflöd över varje protein i de 22 proverna. Figur 4 visar att provbearbetning med robotplattformen resulterade i mycket låga CV-värden. Specifikt var över 3098 peptider identifierade den genomsnittliga CV i reporter jon överflöd 12,36 % och 15,03 % för lätta och tunga dimetylerade peptider, respektive. Bland dessa peptider 2032 av dessa peptider hade reporter jonsignal över minimitröskeln och ansågs kvantifierbara.
Bild 1. Experimentellt arbetsflöde för att bearbeta 22-prov parallellt med ett automatiserat cPILOT-protokoll. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2. Kvantifiering av peptider över 22 prover. Exempel MS (överst) och MS3 (botten) spektra av peptiden G(dimetyl)AAELMQQK(TMT-11plex) kvantifieras i 22-plex automatiserat cPILOT experiment för ljus dimetylerat (nederst till vänster) och tunga dimetylerade (nederst till höger) toppar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3. Box tomt av totala reporter jonintensiteter kontra log10 överflöd av 22 prover med proteome discoverer 2,3. DEN RAW-fil söktes två gånger för lätta och tunga peptider, proteiner ID separat med TMT som dynamisk modifiering, ljus (+28.031 Da) och tunga (+36.076 & +35.069 Da) dimetylation peptid ate N-termini som statisk modifiering. En kombinerad sökning med alla ovanstående ändringar gjordes med hjälp av Proteome Discover 2.3 för att få Log 10 Överflöd av peptidintensiteter över alla kanaler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4. Violin tomter av co-effektiv av variation av peptid överflöd från summed reporter jonintensiteter över kanalerna 126-131 m/z. Peptiden kvantifierades med ett genomsnittligt CV-värde på 12,36 och 15,03 för lätta (2373) och tunga (2533) kvantifierbara peptider. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1. Illustration av cPILOTen med en enda peptid. Visar isotopiken märkning av två olika prover och isobaric märkning med TMT126, den resulterande blandningen injicerades till MS för LC-MS3. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
| Variabelt namn | Värde | Beskrivning |
| DesaltSamp1 | 1065 | Volym som ska användas för desaltsteg 1 |
| DesaltSamp2 | 392 | Volym som ska användas för desalt steg 2 |
| DesaltSamp3 | 100 | Volym som ska användas för desaltsteg 3 |
| DevMode | Falska | Falskt kommer att skära ner inkubationstiderna till 30sec- True kommer att följa inkubationstidsinställningen i protokollet. |
| DTTVol | 3 | Volym på DTT |
| Filtrerasläp | Targa | Platta som används för avsaltning |
| FiltreraPlattaVol | 600 | Volym för avsaltning |
| HAVattentvättar | Falska | Antal vattentvättar på SPE-plattan |
| IAMVol | 2 | Volym av iodoacetamid |
| PeptidTMTVol | 12.5 | Peptidens volym för TMT-märkning |
| Tryck | 100 | mbar tryck vid PPA |
| TempOffSet | 1 | Förändring av temperatur |
| TMTVol | 10 | Isobaric taggvolym som ska läggas till |
| TrisVol | 800 | Volym för att späda prov före matsmältningen |
| TrypsinVol | 2 | Volym av trypsin |
| AnvändPopTimer | Sant | True visar alternativen att applicera tryck på platta om det krävs |
Tabell 1. Lista över variabler som används i automatiserat cPILOT-protokoll.
| DilKälla | DilWell | Dest | DestWell | DilVolym | StockSource | Stockwell | SampleVol | SampleID |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 1 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 2 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 3 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 4 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 5 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 6 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 7 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 8 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 9 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 10 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 11 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | A12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 12 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 13 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 14 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 15 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 16 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 17 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 18 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 19 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 20 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 21 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 22 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 23 |
| 8M_Urea | 1 | Prover | B12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 24 |
Tabell 2. Volym av mus lever homogenat och 8 M urea.
| KällaWell | KällaWell2 | Reporter Jon | DestWell1 | DestWell2 | Volym | SampleID |
| A1 | C1 | 126 | A1 | E1 | 10 | 1 |
| A3 | C3 | 127N | A2 | E2 | 10 | 2 |
| A5 | C5 | 127C | A3 | E3 | 10 | 3 |
| A7 | C7 | 128N | A4 | E4 | 10 | 4 |
| A9 | C9 | 128C | A5 | E5 | 10 | 5 |
| A11 | C11 | 129N | A6 | E6 | 10 | 6 |
| B2 | D2 | 129C | A7 | E7 | 10 | 7 |
| B4 | D4 | 130N | A8 | E8 | 10 | 8 |
| B6 | D6 | 130C | A9 | E9 | 10 | 9 |
| B8 | D8 | 131N | A10 | E10 | 10 | 10 |
| B10 | D10 | 131C | A11 | E11 | 10 | 11 |
Tabell 3. Totalt antal peptider, proteiner och peptidspektrala matchningar (PSM).
| Automatiserad cPILOT | ||
| Ljus | Tunga | |
| Proteiner | 1209 | 1181 |
| Peptider | 6137 | 5872 |
| PsM | 14948 | 16762 |
Tabell 4. Barcoding den isobaric taggar med lätta och tunga märkta prover.
Discussion
cPILOT är en förbättrad multiplexeringsstrategi som kan analysera upp till 24 prover i ett enda experiment. Multiplexeringskapaciteten beror på antalet tillgängliga isotopiska och isobaric taggning kombinationer. Införande av TMTpro7, som kan märka 16 prover i enstaka experiment, kan tänja på gränserna för cPILOT till 32-plex. cPILOT består av flera pipetting steg och kräver omfattande vård och användarkunskaper för att utföra provberedning. Även med en expertanvändare är manuella fel oundvikliga, vilket inbjuder till användning av robotplattformar för att bearbeta prover i cPILOT-strategin. Eftersom cPILOT utnyttjar pH-beroende märkning av peptiderna behöver pH-värdet bibehållas för ljuset och den tunga dimetylerade uppsättningen prover. Milt surt-grundläggande pH-värde kan resultera i dimetylering av både N-termini och lysinrester. En fördel med cPILOT är att det kräver bara hälften av de isobaric taggarna sedan peptid N-termini är upptagna med dimetylgrupperna. Detta ger ett större antal prover som ska märkas till halva kostnaden. Hantering av större provnummer kräver att reagensexponeringstiderna är liknande för det första och det sista provet i en sats. En pipettdispenser som kan rymma upp till 32 prover parallellt kan bäst uppnås med hjälp av anordningar för hantering av robotteknik flytande.
För att kunna bearbeta flera prover genom cPILOT ändrades det manuella arbetsflödet så att det införlivade automatiseringen. Den robotflytande hanterare som används i denna studie har två skida med 96-kanaliga och 8-kanaliga pipetting förmågor, med en gripare för att placera plattorna i de tillgängliga 28 däck platser. Vätskehanteraren är integrerad med en positiv tryckapparat, orbital shaker, och en anordning för att värma / kyla prover i 96 brunnsplattan. Den positiva tryckapparaten hjälper till att utföra buffertutbyten i SPE-plattorna under sanering, medan orbitalskakapparaten hjälper till att virvel/blanda proverna. Robotplattformen programmerades att aspirera och dosera buffertar och prover till 96-brunnsplattor, inkubera, virvelprover och överföringsplattor. Vätskor med olika viskositeter, såsom acetonitril och vatten, kräver specifika pipettering överväganden som också kan programmeras in i metoden.
CPILOT-arbetsflödet, med början från proteinkvantifiering av BCA till att märka peptiderna med isobaric-taggar (dvs. TMT), utfördes på vätskehanterarsystemet. Det kompletta protokollet skalades för att använda 96 djupa brunnsplattor som kan hålla 2 mL per brunn. Buffertarna utarbetades före början av experimentet och lades till 96 brunnsplattan så att parallell provbearbetning tilläts. I den föreliggande studien, 22 arbetsflöde replikat av mus lever homogenate lades till den djupa väl plattor och tas genom cPILOT protokollet. Slutligen, ett enda prov som består av 22-plex equimolar mus levern taggade peptider injicerades till masspektrometern. Reporterjonintensiteter som motsvarar peptidöverflöd i proverna visade att prover som bearbetas med vätskehanteraren har lägre CV än det manuella protokollet (data som inte visas). Robotplattformen förbättrade också i högdet reproducerbarheten av provbearbetning. Reproducerbarhet och robusthet är mycket viktiga faktorer samtidigt som man bearbetar stora antal prover. Pipetting fel kan leda till fullständig felaktig tolkning av data och här robotplattformen som låg inter-prov variation. Även med hjälp av robotplattformen för cPILOT minskade den tid som krävs för att förbereda prover. Till exempel, efter att ha utvecklat den automatiserade metoden, krävs det 2,5 h för att bearbeta 22 prover i jämförelse med 7,5 h för manuell cPILOT. Experiment pågår i vårt laboratorium för att ytterligare utvärdera jämförelser av de manuella och automatiserade cPILOT-arbetsflödena. Baserat på tidigare rapporter från vårt laboratorium, CV% s av protein reporter jonintensiteter i den manuella cPILOT var i genomsnitt 20% med vissa extremvärden överstiger detta värde12.
cPILOT är en kemisk derivatiseringsstrategi på peptidnivå, som kan användas för alla provtyp såsom celler, vävnader och kroppsvätskor. cPILOT erbjuder förbättrad prov-multiplexering och med införlivandet av automatisering kan underlätta prov med hög genomströmning av multiplexering i proteomik. Denna genomströmning är nödvändig för att ytterligare främja sjukdom och biologisk förståelse och biomarkör upptäckt.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Vanderbilt University Start-up Fonder och NIH tilldelning (R01GM117191) till RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
| 2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
| C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
| Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
| Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
| Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
| Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
References
- Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
- Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
- Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
- Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
- King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
- Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).
