Summary
Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.
Abstract
Biz yüksek iş akışı kantitatif proteomik iş akışı tanıttı, kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) tandem kitle etiketleri veya izobarik N, N-dimetil lösin izobaric etiketleri ile 22 veya 24 örnekleri çoklama yeteneğine sahip, sırasıyla, tek bir deneyde. Bu gelişmiş örnek çoklama önemli ölçüde kütle spektrometresi edinim sürelerini azaltır ve pahalı ticari izobarik reaktiflerin yarar artar. Ancak, stratejide numune işleme ve pipetleme adımlarının manuel süreci emek yoğun, zaman alıcı olabilir ve örnek kaybı ve nicel hata yada. Bu sınırlamalar otomasyon un dahil edilmesiyle aşılabilir. Burada manuel cPILOT protokolünü, paralel olarak büyük örnek numaraları (yani 96 örnek) hazırlayabilen otomatik bir sıvı işleme cihazına aktardık. Genel olarak otomasyon, cPILOT'un fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini artırır ve karşılaştırılabilir otomasyon cihazlarıyla diğer araştırmacılar tarafından geniş kullanıma olanak tanır.
Introduction
Kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik, hastalığa özgü biyobelirteçlerin belirlenmesinde, hastalığın ilerlemesini anlamada ve terapötik gelişime yol açan vazgeçilmez bir araştırma aracıdır. Bu kan serumu/ plazma, proksimal sıvılar ve dokular1gibi hastalıkla ilgili klinik örnekler bir dizi elde edilebilir,2. Proteomics biyomarker bulma ve doğrulama son zamanlarda örnek çoklama stratejileri nin gücü nedeniyle önemli dikkate kazanmıştır3,4. Örnek çoklama, tek bir MS enjeksiyonu içinde iki veya daha fazla örnek koşulun eşzamanlı olarak karşılaştırılmasını ve nicelemesini sağlayan bir tekniktir5,6. Numune çoklama, kimyasal, enzimatik veya metabolik etiketlerle birden fazla numuneden peptid veya proteinlerin barkodlanması ve tek bir MS veya MS/MS deneyindeki tüm örneklerden MS bilgisi alınması yla elde edilir. Mevcut izobarik etiketler ibarbarik etiketleme reaktifleri (iTRAQ), ticari tandem kitle etiketleri (TMT) ve evde sentezlenmiş izobarik N, N-dimethyl lösin (DiLeu) reaktifleri 16-pleks7 ve 21-pleks8yetenekleri vardır.
Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) gelişmiş bir örnek çoklama teknolojisidir. cPILOT, peptit N-termininizin izotopik etiketlemesini hafif [−(CH3)2] ve ağır [−(13C2H)2] izotopları düşük pH'da ([2,5) birleştirir ve bu da lizin kalıntısını sonraki yüksek pH (8.5) izobarik etiketleme için TMT kullanarak kullanılabilir tutar, DiLeu veya iTRAQ etiketleme3,9,10,11,12,13,14. cPILOT stratejisinin çift etiketleme şeması, örnek bir peptid kullanılarak iki örnekle Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. MS2 düzeyinde TMT tabanlı nicelemenin doğruluğu ve hassasiyeti, girişim etkisi15olarak nitelendirilen birlikte izole edilmiş ve birlikte parçalanmış iyonların kontamine olması nedeniyle tehlikeye atılabilir. Yanlış muhabir iyon oranlarındaki bu sınırlama tribrid Orbitrap kütle spektrometreleri yardımıyla aşılabilir. Örneğin, kütle spektrometresinde MS1 düzeyinde ki dimetil bir çiftteki tepeyi izole ederek, ışık veya ağır tepeyi doğrusal iyon tuzağındaki MS2 parçalanmasına maruz bırakarak ve daha sonra nicel bilgi elde etmek için HCD-MS3 için en yoğun MS2 parçasını maruz bırakarak girişim etkisi aşılabilir. Muhabir iyonları üretmek için mevcut olan lizin aminleri olmadan peptidseçme şansını artırmak için, y-1 parçasına dayalı seçici bir MS3 kazanımı da kullanılabilir ve cPILOT9ile ölçülebilen peptidlerin daha yüksek bir yüzdesi ile sonuçlanabilecek bir yaklaşımdır. Hafif ve ağır etiketlemenin birleşimi, numune çoklama yeteneklerini tek tek isobarik etiketlerle elde edilene 2 kat daha fazla dır. Biz son zamanlarda DiLeu reaktifler16ile tek bir deneyde en fazla 24 örnek birleştirmek için cPILOT kullandık. Ayrıca cPILOT oksidatif post-translational değişiklikler14 protein niterat17dahil çalışmak için kullanılmıştır , diğer küresel proteomlar9, ve bir Alzheimer hastalığı fare modelinde birden fazla doku örnekleri arasında uygulamaları göstermiştir11.
Sağlam numune hazırlama, bir cPILOT deneyinde kritik bir adımdır ve zaman alıcı, zahmetli ve kapsamlı olabilir. Gelişmiş numune çoklama kapsamlı pipetleme ve yüksek vasıflı laboratuvar personeli gerektirir ve deneyin tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde etkileyebilen çeşitli faktörler vardır. Örneğin, numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesi, tüm numuneler için benzer reaksiyon sürelerini sağlamak ve hafif ve ağır dimetillenmiş numuneler için uygun tampon pH'ı korumak için gereklidir. Ayrıca, onlarca ila yüzlerce numunenin manuel olarak hazırlanması yüksek deneysel hataya neden olabilir. Bu nedenle, numune hazırlama değişkenliğini azaltmak, nicel doğruluğu artırmak ve deneysel iş akışını artırmak için otomatik bir cPILOT iş akışı geliştirdik. Otomasyon, iş akışının birçok yönünü tamamlayabilen robotik bir sıvı işleme cihazı kullanılarak sağlanır(Şekil 1). Protein niceleminden peptit etiketlemeye kadar numune hazırlama otomatik sıvı işleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Otomatik sıvı işleyici, katı faz lı ekstraksiyon (SPE) plakaları, orbital shaker ve ısıtma/soğutma cihazı arasındaki tampon değişimleri için pozitif basınç aygıtı (PPA) ile entegre edilmiştir. Robotik platform plakave tamponlar karşılamak için 28 güverte yerleri içerir. Güverte konumları içinde plakaları aktarmak için bir kavrayıcı ile iki pod vardır: 96 kanallı sabit hacimli pipetleme kafası (5-1100 μL) ve 8 kanal değişken hacim probları (1-1000 μL). Robotik platform bir yazılım kullanılarak kontrol edilir. Kullanıcının robotik sıvı işleyicisini kullanmadan önce profesyonel olarak eğitilmesi gerekir. Bu çalışma, 12'den fazla numunenin tek bir toplu iş halinde işlenmesi için emek yoğun olabilecek manuel cPILOT iş akışını otomatikleştirmek üzerinde odaklanmıştır. cPILOTyaklaşımı11'inişbzinin arttırılabilmesi için cPILOT protokolünü 10'dan fazla numuneyi paralel olarak işlemek üzere robotik bir sıvı işleyicisine aktardık. Otomasyon aynı zamanda her örnek için benzer reaksiyonlara, numune hazırlama sürecinin çeşitli adımları sırasında paralel olarak izin verir ve bu da yüksek eğitimli kullanıcıların manuel cPILOT sırasında bunu başarmasını gerektirir. Bu protokol, cPILOT'u gerçekleştirmek için otomatik sıvı taşıma cihazının uygulanmasına odaklanır. Bu çalışma, bu otomatik sistemi kullanma protokolünü açıklar ve fare karaciğerhomojenlerinin 22-pleksli "kavram kanıtı" analizi kullanılarak performansını göstermektedir.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Bir erkek kontrol faresi (C57/BLJ) ticari olarak satın alındı ve Pittsburgh Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Kaynakları Bölümü'nde yer aldı. Fareler standart kemirgen laboratuvar chow reklam libitum beslenen ve 12 saat ışık / karanlık döngüsü nde tutuldu. Karaciğer dokusu hasat edildi ve −80 °C'de depolandı.
1. Protein ekstraksiyonu
NOT: Bu adımlar el ile gerçekleştirilir.
- Fare karaciğerini (100 mg) tuzlu ve homojen ile 500 μL 8 M üre ile yıkamak, 20 s için 4 m/s için lysing matris Iğdır a boncukları kullanarak mekanik bir homogenizer kullanarak.
NOT: Bu çalışmada proteaz veya fosfataz inhibitörleri eklenmemiş, ancak deneye bağlı olarak gerekirse tampona eklenebilir. Ayrıca, protein ekstraksiyon adımları çeşitli numune tipleri için buna göre ayarlanabilir. - Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne homojenate doku aktarın, durulayın ve 8 M üre ile PBS 100-500 μL ile lysing tüpleri birleştirmek.
- Homojendokuları (12.800 x g, 4 °C ve 15 dk) santrifüj edin ve süpernatanttoplayın.
NOT: Geri kalan adımlar kullanıcının laboratuvarında bulunan robotik sıvı işleyicisi üzerinde gerçekleştirilir. Sıvı işleyici, en az operatör katılımı yla ANCI'ın belirttiği plaka tiplerinden ve anci'den tamponları aspire etme ve dağıtma yeteneğine sahip olmalıdır. - Üreticinin talimatlarına göre bir bicinchoninic asit (BCA) tsay kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin.
- PPA'yı, ısıtma/soğutma cihazını ve vakum pompalarını açın ve tüm aksesuarları sıvı işleyiciyle bağlayın. Sıvı işleyicisi, bilgisayara bağlanıp çalışmaya hazır olduğunda mavi bir ışık gösterir.
- Plaka 1 (96 kuyu plakası) reaktifetmek için, sırasıyla 1, 2 ve 3 satırlarına 25 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 l sistein ve 25 mM 30 l iodoacetamid (IAA) 30 μL ekleyin.
- Bir rezervuar plakasına 10 mM CaCl2 (pH 8.2) ile 8 M üre ve 20 mM Tris ekleyin. 2 mL derin kuyu plakasına %5 formik asit, 20 μL trypsin tablanın 1 sırasını ekleyin ve yöntemde belirtildiği şekilde güverte yerine yerleştirin.
NOT: Örnekten önce 96 kuyu plakasına IAA ve tripsin eklenmiştir. - Aliquot 300 μL karaciğer 500 μL tüp içine homojen ve 2 mL derin kuyu plaka üzerine yerleştirin ve 4 ° C protokolün başlangıcına kadar yerleştirin. Bu deney için tek karaciğer homojeninden 22 aliquot üretildi.
NOT: 1 μg standardı olan 1μg standardı ile bir iç kalite kontrol standardı (örneğin, sığır alfa kazein veya diğer eksojen protein) ekleyin: 100 μg protein örneği. - Örneklereeklenecek arabellek lerin hacmini tablo 1'e göre değişken adlarına ve değerine göre tanımlayın. BCA'ya göre, örnek ve normalleştirme arabelleği (8 M üre) hacmini elektronik tabloya girin ve yazılıma iliştirin(Tablo 2).
NOT: Protein konsantrasyonu çok yüksekse tampon ile daha fazla seyreltme gerekebilir. Karaciğer dokusundan alınan numune için elde edilen konsantrasyonlar 10 μg/μL idi. Tamponların hacmi 100 μg protein için optimize edildi. - Örnek tüpleri 4 °C'den çıkarın, otomatik sıvı işleyicinin belirtilen güverte yerine yerleştirin ve 10 dakika Boyunca ısınmaya izin verin.
- Yöntemi açın ve gerekli ipuçlarını (1070, 90 ve 230 μL) ve labware'i istenilen konumlara yerleştirmek için yönergeleri izleyin. Tüm laboratuvar yazılımları ve ipuçları yerleştirildikten sonra, son güverte düzenini çapraz kontrol edin ve protokolü devam etmek için İleri'yi tıklatın.
NOT: Kılavuzlu kurulum, protokole ve tutulacak güverte konumuna bağlı olarak belirli laboratuvar yazılımına gerekli miktarda arabellek eklemesi için kullanıcıya bilgi verir.
2. Örnek azaltma, alkililasyon ve sindirim
- 230 μL'lik uçları yükleyin ve rezervuardan 90 μL 8 M üre aspire edin ve siyah 2 mL derinliğindeki kuyu plakasının 1. İpuçlarını boşaltın. 22 numuneye karşılık gelen tüm kuyulara 8 M üre eklenene kadar bu adımı tekrarlayın.
NOT: Denatürasyon tamponu, birincil yapıyı verimlendirmek için proteinin üç boyutlu yapısını sarar, böylece tripsin etkili bir şekilde hareket edebilir ve proteini kırabilir. 8 kanallı pipet, 8 kanal için farklı hacimleri aspire edebilir ve labware farklı konumlara dağıtabilirsiniz. Bu adımda tüm kanallar yazılımda tanımlandığı gibi aynı hacmi aspire etti. - Denatürasyon tamponunu ekledikten sonra, 90 μL'lik uçları yükleyin ve 8 kanallı pipeti siyah 2 mL derin kuyu plakasına kullanarak fare karaciğerinin homojen 10μG'sine (100 μg'ye karşılık) aspire edin. İpuçlarını boşaltın. 22 örnek aktarılana kadar bu adımı tekrarlayın.
- Her aktarımdan sonra, proteinin tamponla karıştırılarak 1:1 oranında karıştırılmasını sağlamak için kuyu içeriğinin 50°L'sini üç kez aspire etmek için bir karışım adımı atın ve dağıtın.
NOT: Stok homojen numuneyi çıkarın ve -80 °C'ye yerleştirin. - Denatüre proteinleri azaltmak için, bir sıra 90 μL'lik uçları yükleyin ve reaktif plaka 1'den 3 μL DTT aspire edin. DTT'yi siyah 2 mL derinliğindeki kuyu plakasının 1 ve 2 sıralarına dağıtın ve uçları boşaltın.
NOT: Protein: DTT molar oranı disülfit bağlarının azaltılması için 1:40'da korunur. Azı heferal oranının hesaplanması, 66.5 x 103 g/mol olan büyükbaş hayvan serum albumin (BSA) protein kütlesinden hesaplanır. - Numune plakasını alüminyum folyo ile kapatın ve 37 °C'de 300 s'de 300 rpm'de kuluçkaya yatırın.
- Kullanmadan hemen önce 3 0,25 M IAM'lik 3'lük reaktif plakası 1'e ekleyin ve güverteye yerleştirin. Numune plakasını kapatın ve güverteye dönün.
NOT: IAM ışığa duyarlıdır. - Bir sıra 90 μL'lik uçları yükleyin, 3 numaralı satırdaki reaktif plaka1'den 6 μL IAM aspire edin ve örnek plakanın 1 numaralı satırına dağıtın. İpuçlarını boşaltın.
NOT: Protein: IAM molar oranı her örnek için 1:80'de korunur. Bu reaksiyon karanlıkta yapılmalı. - Isıtma/soğutma cihazında numune plakasını ve kuluçka makinesini 30 dk 30 00 dakika boyunca 4 °C'de kapatın.
NOT: Numunenin ışıktan, buharlaşmadan ve kuyudan dökülmesini önlemek için plakanın sızdırmazlığı yapılır. - Numune plakasını kapatın ve 90 μL'lik bir sıra yükleyin ve 2 numaralı 1 numaralı reaktif plakasından 5 μL sistein aspire edin. Örnek plakanın 1 ve 2 sıralarına dağıtın ve uçları boşaltın. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
NOT: Protein: L-sistein molar oranı 1:40'da korunur. - 30 dakika boyunca 1800 rpm zamanlanmış bir sallamak gerçekleştirmek için orbital shaker üzerinde örnek plaka yerleştirin.
- Üre konsantrasyonunu 2 M'ye seyreltmek için numune plakasının her kuyuya 10 mM CaCl2 (pH 8.2) ile 20 mM Tris tampon800 μL ekleyin.
NOT: Tripsin aktivitesi daha yüksek üre konsantrasyonlarında engellenir ve bu nedenle 2 M'den aza indirilmelidir. Bu çalışma 50 tripsin molar oranına kadar bir protein ile yapıldı: 1 4 saat için 1. - Satır 1'e 20 μL trypsin, 96 kuyu plakasının 1-12 sütununa ekleyin ve güvertede belirli bir yere yerleştirin.
- Bir sıra 90 μL'lik uçları yükleyin, trypsin plakasatır 1'den 2 μL tripsin aspire edin ve numune plakasının 1 ve 2 numaralı satırlarına dağıtın. İpuçlarını boşaltın.
- Plakayı kapatın ve ısıtma/soğutma cihazında 600 rpm'de 37 °C'de 14 saat kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, numune plakasının mührünü kapatın ve derin bir kuyu toplama plakasının 1-12.
- Formik asit plakasının 3 numaralı satırından %5 formik asit ekleyerek sindirimi durdurun ve 1 ve 2 numaralı satırlarda numune plakasına dağıtın. İpuçlarını boşaltın.
3. Tuzsuzadım 1
- 20 mg Targa C-18 malzeme içeren SPE plakalı peptidleri tuzlayın. Her arabellek değişimi için hacmi 600 μL olarak düzeltin ve basıncı 100 mbar'a sabitle.
- 1070 μL uçları yükleyin ve 600 μL asetonitril aspire edin ve SPE plakasının 1 ve 2. SPE plakasını PPA'ya yerleştirin ve basınç uygulayın.
- Aynı ipuçlarını kullanarak 600 μL asetonitit aspire edin ve SPE plakasının 1 ve 2. SPE plakasını PPA'ya yerleştirin ve basınç uygulayın.
NOT: Akış bir emme pompası kullanılarak atık boşaltılabilir. - 1070 μL uçları yükleyin ve 600 μL Tampon A (%0,1 formik asitte %100 su) aspire edin ve SPE plakasının 1 ve 2 sıralarına dağıtın. SPE plakasını PPA'ya yerleştirin ve basınç uygulayın.
NOT: Arabellek hacmi önemli ölçüde basınç veya zaman artırmayı deneyin azaltmazsa. - 1070 μL'lik 2 sıra, sindirilmiş numunelerin 534 μL'ini aspire edin ve SPE plakasının 1 ve 2. SPE plakasını PPA'ya yerleştirin ve basınç uygulayın. Tüm örnekler yüklenene kadar bu adımı tekrarlayın.
NOT: Formik asit eklendikten sonra toplam hacim 1068 μL olacağından ve numuneler iki geçişte eklenmiştir. - Kullanılan 1070 μL ipuçları, tampon A 600 μL aspire ve SPE plaka 1 ve 2 satırları dağıtmak 2 satır yükleyin. SPE plakasını PPA'ya yerleştirin ve basınç uygulayın.
- Numuneyi temizlemek için yukarıdaki adımı bir kez tekrarlayın.
- 1 sıra 1070 μL uçlar yükleyin, 600 μL ACN aspire edin: Su (60:40) ve SPE plakasının 1 ve 2 sıralarına dağıtın. PPA kullanarak peptidleri etkisiz kındırmak ve basınç uygulamak için SPE plakasını bir toplama plakasının üzerine yerleştirin.
- Toplama plakasındaki peptidleri aşmak için yukarıdaki adımı tekrarlayın. Toplama plakasını kurutun ve -80° C'de daha fazla işleme konana kadar saklayın.
4. Dimethylation Etiketleme (peptit N-termini)
- Gerekli ipuçlarını (1070, 90 ve 230 μL) ve laboratuvar yazılımlarını yazılımda istenilen konumlara yerleştirin. Tüm laboratuvar yazılımları ve ipuçları yerleştirildikten sonra, son güverte düzenini çapraz kontrol edin ve protokolü devam etmek için İleri'yi tıklatın.
- Plaka 2'yi reaktif etmek için sırasıyla %1 asetik asit, 50°L hafif formaldehit (CH2O), 50 μL ağır formaldehit(13CD2O) ve 150 μL formik asit imal edin.
- 3. tablayı yeniden eklemek için 50°L hafif CB, 50 μL ağır CB, 1 ve 2 ve 50 μL Amonyak'ın 3 ve 4.
- 2 satır 230 μL ipuçları yükleyin ve reaktif plaka 2 satır 1% asetik asit 100 μL aspire ve örnek plaka 2 kurutulmuş aşağı peptidler dağıtmak (tuzsuzlama adım dan toplama plaka) satır 1 ve 2 ve 1800 rpm 5 dakika için zamanlanmış sallayarak gerçekleştirin.
- 90 μL uçları yükleyin ve 60 mM'nin 16 μL'sini aspire edin (%4) CH2O (%37 wt/v) reaktif plaka 2 satır 2 ve örnek plaka satır 1 dağıtmak. İpuçlarını boşaltın.
- 1 sıra 90 μL uç ve aspire 16 μL 60 mM (%4) yükleyin 13.000 CD2O (% 20 wt/v) reaktif plaka 2 satır 3 ve örnek plaka 2 satır 2 dağıtmak. İpuçlarını boşaltın.
NOT: Bu çalışmada satır 1 ışığa karşılık gelir ve satır 2 ağır dimetillenmiş örneklere karşılık gelir (Bkz. Şekil 1). - 2 sıra 90 μL uçları yükleyin ve 24 mM NaBH3CN ve 24 mM NaBD3CN'i 1 ve 2 sıra reaktif plaka3'ten yükleyin ve örnek plakanın sırasıyla 1 ve 2 sıralarına dağıtın.
- Uçları boşaltın ve orbital shaker kullanarak 1800 rpm 15 dakika için zamanlanmış bir sarsıntı gerçekleştirin.
NOT: Sodyum siyanoborohydride eklenmesi bu adım toplu başına bir kez gerçekleştirilir deneyler arasındaki değişkenliği azaltmak için böylece reaksiyon başlatır. - 2 sıra 90 μL uçları yükleyin ve %1 amonyya (~28-30% v/v) satırından 3 ve 4 reaktif plaka3'ten aspire edin ve örnek plaka 2'nin sırasıyla 1 ve 2 sıralarına dağıtın. İpuçlarını boşaltın.
NOT: Amonyağ eklemek, bu adım ın her parti başına bir kez gerçekleştirildiğini, deneyler arasındaki değişkenliği azaltmak için reaksiyonu durdurur. - Eşit hacimlerde hafif ve ağır (1:1) dimetillenmiş peptidleri tuzsuzlamak için yeni bir 2 mL derin kuyu plakası ile birleştirin.
NOT: Bu çalışmada 1. Işık oranı: ağır karıştırma deneysel protokole bağlıdır, bu çalışmada 1:1 oranı kullanılmıştır. - 2 sıra 230 μL'lik uçları yükleyin ve kombine numunelere %5 formik asit 32 μL aspire edin ve 1800 rpm'de 30 s'ye zamanlanmış bir sallayarak yapın.
NOT: Dimetilasyon verimi reaksiyon karışımının pH'ına bağlıdır ve tampon pH'daki herhangi bir değişiklik peptid N-termini'nin eksik etiketletilmelerine neden olur. Dimetilasyon verimliliği, peptid N-termini'de dinamik modifikasyon olarak arandığında %97'den fazla olmalıdır. Bu çalışmada hafif ve ağır peptidlerin etiketleme etkinliği sırasıyla %99,7 ve %99,5 idi.
5. Tuzsuzadım 2
- Kombine numuneler için tuzdan arındırma adımı 1'e benzer numune tuzulama gerçekleştirin.
- Numune plakasındaki numuneleri hız vac'ı kullanarak kurulayın ve ilave işleme ne kadar -80 °C'de saklayın.
6. İzobarik etiketleme (Lys artıkları)
- Kılavuzlu laboratuvar yazılımı kurulumlarını izleyin ve gerekli ipuçlarını (1070, 90 ve 230 μL) uygun arabelleklerle yerleştirin. Tüm laboratuvar yazılımları ve ipuçları yerleştirildikten sonra, son güverte düzenini çapraz kontrol edin ve protokolü devam etmek için İleri'yi tıklatın.
- 1 00 mM trietil amonyum bikarbonat (TEAB), 30 μL hidroksilin (%10 w/v) satırına 250 mL ve reaktif plaka 4'ün 2'sini ekleyin. TMT tüplerini Tablo 3'tekielektronik tabloya göre 2 mL derin plakaya yerleştirin.
- Etiketli peptidleri bir araya etmek için boş bir 1,5 mL'lik tüpü bir tüp raf tutucuda saklayın. Kurutulmuş numune plakasını P14'e P9 ve TMT işleme plakası olarak yerleştirin.
- Peptitleri yeniden oluşturmak için, 230 μL uçları yükleyin ve 100 mM trietil amonyum bikarbonat (TEAB) tamponuna (pH ~8.5) emiş olun ve ÖRNEK plaka 3'ün 3. 1800 rpm 30 s için orbital shaker plaka yerleştirin.
NOT: 1 μg/μL konsantrasyonunda 100 μg dimetillenmiş peptidleri yeniden oluşturun. - TMT plakasının H12'sinden 90 μL'lik suve asetonite yükleyin ve kurutulmuş TMT tüplerinin her birine dağıtın.
- TMT tüpleri, girdap çıkarın ve hızlı tüpler spin ve derin kuyu plaka güverteye dönün.
- 1 sıra 90 μL'lik uçları yükleyin ve 12,5 μL'lik kombine dimetillenmiş peptidleri aspire edin ve TMT işleme plakasının 1. İpuçlarını boşaltın.
NOT: TMT: peptit oranı bu deney için 1:8 olarak muhafaza edildi. - 1 sıra 90 μL'lik uçları yükleyin ve 10 μL TMT aspire edin ve TMT işleme plakasının 1. İpuçlarını boşaltın, 1800 rpm'de 1 saat boyunca zamanlı sallayın.
- TEAB plakasındaki 2. Uçları boşaltın, 1800 rpm 15 dakika boyunca zamanlanmış bir sallayarak gerçekleştirin.
- TMT işleme plakasından 1,5 mL tüpe 30,5 μL TMT etiketli peptidleri birleştirin. Her aktarımdan sonra ipuçlarını boşaltın.
- Asetonitril buharlaştırmak için havuzlu örnekleri ile tüp çıkarın ve kuru. 0,2 mL suda % 0,1 formik asitte peptidleri yeniden oluşturup güverteye geri dönün.
NOT: İzobarik etiketlemenin etiketleme verimliliği de pH'ya özgüdür ve etiketleme verimliliği üreticinin talimatları başına %98'in üzerinde olmalıdır. Bu çalışmada lizin indüve ağır peptidlerin TMT etiketleme etkinliği sırasıyla %99,4 ve %99,5 idi.
7. Tuzsuzadım
- Bir numune için tuz 1'e benzer numune tuzulama gerçekleştirin.
- Numuneleri kurutun ve analiz edilene kadar -80 °C'de saklayın.
8. Sıvı Kromatografisi-Tandem Kütle Spektrometresi (LC-MS/MS) ve MS3
- ~1 μg/μL konsantrasyonu elde etmek için MS sınıfı sudaki peptidleri %0,1 FA ile yeniden oluşturun. 0,65 μm filtre içeren mikrosantrifüj tüplü filtre örnekleri. 3 dk için 12.000 x g centrifuge peptidler ve bir otomatik örnekleyici şişe içine akışı yerleştirin.
NOT: İstenirse peptit konsantrasyonu bu aşamada doğrulanabilir. Peptidler LC-MS sınıf su ve BCA peptid töz tabi yeniden olması gerekir. Bu çalışmada peptid BCA tsbellii yapılmamış ve tüm peptid miktarları ilk protein BCA testini temel almis - Mobil faz tamponlarını aşağıdaki gibi hazırlayın: %0,1 FA (A) ile %100 (v/v) su ve %0,1 FA (B) ile %100 ACN.
- 2 cm C18 malzeme (3 μm, 100 şgözenek boyutu) ile paketlenmiş bir tuzak sütununa 1 μL numune enjekte edin.
NOT: Tuzakta numune temizliği aşağıdaki gibidir: 10 dk, %100 A; 2B sıvı kromatografi sistemi kullanılarak 2 μL/dk. - Analitik ayırma yöntemini çalıştırın. C18 malzeme (2,5 μm, 100 Å) ile paketlenmiş 100 μm i.d. x 26 cm lazer çekme ucu erimiş silika kılcal kolon kullanın. Degrade: 0-10 dk, %10 B; 10-30 dk, %10-15 B; 30-75 dk, %15-30 B; 75-88 dk, %30-60 B; 88-92 dk, %60-90 B; 92-99 dk, %90 B; 99-100 dk, 90-10% B, 100-120 dk, 10% B; 300 nL/dk, 120 dk.
- Analitik ayırma yöntemi çalışırken kütle spektrometresi için veri toplama çalıştırın.
- MS anket taraması için aşağıdaki parametreleri kullanın: 375-1.500 m/z,120.000 çözünürlük, Çevrim süresi 3 s (üst hız), otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedef 4.0e5, maksimum enjeksiyon süresi 50 ms.
- Iyon tuzağı olan CID-MS/MS için aşağıdaki parametreleri kullanın: sonuç başına veri bağımlı toplama (DDA) taramaları, 2 m/z izolasyon genişliği, %35 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE), 0,25 aktivasyon q, 10 ms aktivasyon süresi, 1.0e4 AGC, 100 ms maksimum enjeksiyon süresi.
- HCD-MS3 SPS 10 için aşağıdaki parametreleri kullanın: Tarama aralığı 100-400 m/z,bağımlı tarama sayısı 10, AGC 5.0e4, maksimum enjeksiyon süresi 118 ms, HCD çarpışma enerjisi %55, MS2 izolasyon penceresi 2.
9. Veri analizi
- Uygun bir veritabanına karşı bir protein analiz yazılımı kullanarak protein ve peptidler listesi için RAW dosyaları arama.
NOT: Bu çalışmada oluşturulan RAW dosyaları bir fare Uniprot veritabanına karşı arandı. - Bir RAW dosyasında hem hafif hem de ağır etiketleme olduğundan, her dosyada hafif ve ağır dimetillenmiş peptidler için iki iş akışı yla arama yapın.
- Fare Uniprot veritabanına (13/07/2019) karşı RAW dosyalarını aşağıdaki parametrelerle 53035 sırasına göre arayın: en fazla iki cevapsız dekoltesi olan trypsin dekolte, en az 6 amino asit uzunluğu ile peptid, 15 ppm ana kütle toleransı, 1 Da parçalanma toleransı Statik modifikasyonlar: hafif dimetilasyon (+28.031, peptit N-terminus) veya ağır dimetilasyon (+36.076 Da, peptit N-terminus), karbamidometi (+57.021 Da, C), Dinamik modifikasyonlar: oksidasyon (+15.995 Da, M), 11-pleksiz izobarik etiket (229.163 Da, K), %1 FDR, 30 ppm pik entegrasyon toleransı ile muhabir iyon nicelemesi, entegrasyon yöntemi için en emin santridikoid.
NOT: Ağır dimetiltepe de ~ 7 Da (+35.069 Da, peptit N-terminus) ışık dimetilated tepe ve bu nedenle başka bir arama düğümü de bu değişiklik dahil edilmelidir başka bir değişiklik içerir. - Yoğunluk, %65 SPS kitle eşleşmesi, ortalama S/N oranı 10, izotopik düzeltme, normalleştirme ve ölçekleme ile uyumlu iyon nicelliği gerçekleştirin.
NOT: Normalizasyon ve ölçekleme, toplam peptit miktarına veya numuneye eklenen belirli bir proteine göre yapılabilir. QC örnekleri de iki kuyruklu iç referans ölçekleme18dayalı toplu veya toplu normalleştirme için kanallara dahil edilebilir. Farklı TMT kanallarının izotopik kontaminasyonları arama sağlanamadı, kullanıcıların farklı muhabir iyonlarının izotop kontaminasyonu eklemeleri tavsiye edilir.
Representative Results
Şekil 2, iş akışı çoğaltmaları da dahil olmak üzere 22 plekslik bir cPILOT deneyinden 22 muhabir iyon kanalının tümlerinde tanımlanan bir peptidin temsili MS verilerini gösterir. Şekil 2 (üstte), peptidin içine dahil edilmiş tek bir dimetil grubu gösteren 4 Da m/z aralığıile ayrılmış iki kat yüklü bir tepe çiftini gösterir. Hafif ve ağır dimetillenmiş tepe çiftleri izole edildi ve peptit dizisini vermek için bağımsız olarak parçalandı. Peptitin dizilimi G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) olup Betain-homosistein S-metil transferaz proteinine karşılık gelir. Hem hafif hem de ağır dimetillenmiş zirveler için en yoğun parça iyonları(gösterilmemiştir)MS3 parçalanması için daha fazla izole edildi ve muhabir iyonları(m/z 126-131) Şekil 2'de (altta) gösterilmiştir. Muhabir iyon yoğunlukları doğrudan örnekteki peptit bolluğu ile orantılıdır. Örneklerin peptit bolluğu, robotik platformun borulama yeteneğinin 22 örnekte oldukça düzgün olduğunu gösterir. Genel olarak, bu 22-pleksk cPILOT deney 1326 sonuçlandı (1209-ışık/1181-ağır) 3098 kaynaklanan protein tanımlamaları (6137-Light/5872-ağır) peptidler(Tablo 4). Şekil 3, daha az ara/örneksel değişkenlik gösteren tüm 22 kanalda log10 bolluğuna karşı toplam muhabir iyon yoğunluklarının kutu çizimini gösterir. Toplam otomasyonun değerlendirilmesi, 22 numunede her proteinde muhabir iyon bolluğundaki hata inceleyerek yapılmıştır. Şekil 4, robotik platform ile numune işlemenin cv değerlerinin çok düşük olduğunu göstermektedir. Özellikle, 3098 peptidler arasında muhabir iyon bolluğunda ortalama CV tespit 12.36 % ve 15.03% hafif ve ağır dimetillenmiş peptidler için, sırasıyla. Bu peptidler arasında 2032 minimum eşik üzerinde muhabir iyon sinyali vardı ve ölçülebilir kabul edildi.
Şekil 1. Otomatik bir cPILOT protokolüne paralel olarak 22 numuneyi işlemek için deneysel iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. 22 örnekte peptidlerin sayısallaştırılması. Örnek MS (üst) ve MS3 (alt) peptid G(dimetil)AAELMQQK(TMT-11plex) ışık dimetilleştirilmiş (sol altta) ve ağır dimetil (sağ alt) zirveleri için 22-pleks otomatik cPILOT deneyölçülen spektrumları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Toplam muhabir iyon yoğunlukları karşı proteome discoverer 2.3 kullanarak 22 örnek log10 bolluk kutu arsa. RAW dosyası, hafif ve ağır peptidler, proteinler tmt ile ayrı ayrı dinamik modifikasyon, ışık (+28.031 Da) ve statik modifikasyon olarak peptid N-termini'de ağır (+36.076 & +35.069 Da) dimetilasyon için iki kez arandı. Tüm kanallarda peptid yoğunlukları Log 10 Bolluk elde etmek için Proteome Discover 2.3 kullanılarak tüm yukarıdaki değişiklikler ile kombine bir arama yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. 126-131 m/zkanalları arasında özetlenen muhabir iyon yoğunluklarından peptit bolluğu varyasyonu co-verimli Keman arsalar . Peptit, hafif (2373) ve ağır (2533) ölçülebilir peptidler için ortalama 12,36 ve 15,03 CV değeri ile ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1. Tek bir peptid ile cPILOT İllüstrasyon. İki farklı numunenin izotopik etiketlemesini ve TMT126ile izobarik etiketlemeyi gösteren karışım LC-MS3için MS'ye enjekte edildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Değişken Adı | Değer | Açıklama |
| DesaltSamp1 | 1065 | Tuz dansı adımı 1 için kullanılacak hacim |
| DesaltSamp2 | 392 | Tuzdan arındırma adımı 2 için kullanılacak hacim |
| DesaltSamp3 | 100 | Tuz dansı adım 3 için kullanılacak hacim |
| Devmode | False | Yanlış 30sec için kuluçka süreleri kesecek- True protokolde kuluçka zamanlaması takip edecektir. |
| DTTVol | 3 | DTT hacmi |
| Filtre Plakası | Targa | Tuzsuzlama için kullanılan plaka |
| Filtre PlakasıVol | 600 | Tuzsuzlama için hacim |
| HAWaterWashes | False | SPE plakası üzerindeki su yıkar sayısı |
| IAMVol | 2 | İyodoacetamid hacmi |
| PeptideTMTVol | 12.5 | TMT etiketleme için peptit hacmi |
| Basınç | 100 | PPA'da mbar basıncı |
| Tempoffset | 1 | Sıcaklık değişimi |
| TMTVol | 10 | Eklenecek isobaric etiket hacmi |
| TrisVol | 800 | Sindirimi önce numune seyreltmek için hacim |
| TripsinVol | 2 | Tripsin hacmi |
| PopTimer'ı Kullanma | True | True gerekirse plakaya basınç uygulama seçeneklerini görüntüler |
Tablo 1. Otomatik cPILOT protokolünde kullanılan değişkenlerin listesi.
| DilSource | Dilwell | Dest | DestWell | DilVolume | StockSource | Stockwell | ÖrnekVol | ÖrnekID |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 1 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 2 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 3 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 4 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 5 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 6 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 7 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 8 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 9 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 10 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 11 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | A12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 12 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 13 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 14 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 15 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 16 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 17 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 18 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 19 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 20 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 21 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 22 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 23 |
| 8M_Urea | 1 | Örnekleri | B12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 24 |
Tablo 2. Fare karaciğer homojenate ve 8 M üre hacmi.
| Kaynak Kuyusu | Kaynak Kaynak 2 | Muhabir Ion | DestWell1 | DestWell2 | Birim | ÖrnekID |
| A1 | C1 | 126 | A1 | E1 | 10 | 1 |
| A3 | C3 | 127 N | A2 | E2 | 10 | 2 |
| A5 | C5 | 127C | A3 | E3 | 10 | 3 |
| A7 | C7 | 128 N 128 N | A4 | E4 | 10 | 4 |
| A9 | C9 | 128C | A5 | E5 | 10 | 5 |
| A11 | C11 | 129 N | A6 | E6 | 10 | 6 |
| B2 | D2 | 129C | A7 | E7 | 10 | 7 |
| B4 | D4 | 130 N | A8 | E8 | 10 | 8 |
| B6 | D6 | 130C | A9 | E9 | 10 | 9 |
| B8 | D8 | 131 N1 | A10 | E10 | 10 | 10 |
| B10 | D10 | 131C | A11 | E11 E- | 10 | 11 |
Tablo 3. Toplam peptid, protein ve peptit spektral eşleşme (PsM) sayısı.
| Otomatik cPILOT | ||
| ışık | Ağır | |
| Protein | 1209 | 1181 |
| Peptidler | 6137 | 5872 |
| PSM | 14948 | 16762 |
Tablo 4. Isobarik etiketleri hafif ve ağır etiketli örneklerle kodlama.
Discussion
cPILOT, tek bir deneyde en fazla 24 örneği analiz edebilen gelişmiş bir çoklama stratejisidir. Çoklama kapasitesi kullanılabilir izotopik ve izobarik etiketleme kombinasyonlarının sayısına bağlıdır. Tek bir deneyde 16 numuneyi etiketleme yeteneğine sahip olan TMTpro7'nintanıtımı, cPILOT'un sınırlarını 32-plex'e itebilir. cPILOT birden fazla pipetleme adımlarından oluşur ve numune hazırlama sı için kapsamlı bakım ve kullanıcı becerileri gerektirir. Uzman bir kullanıcıda bile, cPILOT stratejisinde örnekleri işlemek için robotik platformların kullanılmasını davet eden manuel hatalar kaçınılmazdır. cPILOT peptidlerin pH bağımlı etiketlemesini kullandığından, pH'nın hafif ve ağır dimetillenmiş numune ler için korunması gerekir. Hafif asidik-bazik pH hem N-termini hem de lizin artıklarının dimetilasyonuna neden olabilir. CPILOT bir avantajı peptit N-termini dimetil grupları ile işgal beri izobarik etiketlerin sadece yarısını gerektirir. Bu, daha fazla sayıda numunenin yarı maliyetle etiketlenmesine neden olur. Daha büyük örnek numaraların işlenmesi, reaktif maruziyet sürelerinin bir toplu işteki ilk ve son örnek için benzer olduğunu gerektirir. 32 numuneyi paralel olarak barındırabilen bir pipet dağıtıcısı, robotik sıvı taşıma cihazlarının kullanımı yla en iyi şekilde elde edilebilir.
CPILOT tarafından birden fazla numunenin işlenmesi için, manuel iş akışı otomasyonu da dahil etmek üzere değiştirildi. Bu çalışmada kullanılan robotik sıvı işleyici 96 kanallı ve 8 kanallı pipetleme yeteneklerine sahip iki bölmeye sahiptir ve plakaları mevcut 28 güverte konumuna yerleştirmek için bir kavrayıcıya sahiptir. Sıvı işleyici, pozitif basınç aparatı, orbital shaker ve 96 kuyu plakasındaki numuneleri ısıtmak/soğutmak için bir cihazla entegre edilmiştir. Pozitif basınç aparatı temizlik sırasında SPE plakalarında tampon değişiminin olmasına yardımcı olurken, orbital shaker numuneleri girdap/karıştırmaya yardımcı olur. Robotik platform, tampon ve numuneleri 96 kuyulu plakalara, kuluçkaya, girdap örneklerine ve transfer plakalarına aspire etmek ve dağıtmak için programlanmıştır. Asetonitril ve su gibi farklı viskozitelere sahip sıvılar, yönteme programlanabilecek özel pipetleme hususları gerektirir.
BCA tarafından protein niceleminden başlayarak peptidlerin isobarik etiketlerle (yani TMT) etiketlenmesine kadar cPILOT iş akışı sıvı işleyici sistemi üzerinde gerçekleştirildi. Protokolün tamamı, kuyu başına 2 mL tutabilen 96 derin kuyu plakası kullanılacak şekilde ölçeklendirildi. Arabellekler deney başlamadan önce hazırlandı ve paralel numune işleme izin vermek için 96 kuyu plakası eklendi. Bu çalışmada, fare karaciğerhomojenate 22 iş akışı kopyaları derin kuyu plakaları eklendi ve cPILOT protokolü ile alınmıştır. Son olarak, 22-plekse equimolar fare karaciğer etiketli peptidler oluşan tek bir örnek kütle spektrometre enjekte edildi. Örneklerdeki peptit bolluğuna karşılık gelen muhabir iyon yoğunlukları, sıvı işleyicisi ile işlenen numunelerin manuel protokolden daha düşük CV'lere sahip olduğunu göstermiştir(veriler gösterilmemiştir). Robotik platform aynı zamanda numune işlemenin tekrarlanabilirliğini de büyük ölçüde artırdı. Çok sayıda numune işlenirken tekrarlanabilirlik ve sağlamlık çok önemli faktörlerdir. Pipetleme hataları verilerin tamamen yanlış yorumlanmasına yol açabilir ve burada robotik platform düşük örnekler arası varyasyon sağladı. Ayrıca cPILOT için robot platformu kullanarak örnekleri hazırlamak için gerekli süreyi azalttı. Örneğin, otomatik yöntemi geliştirdikten sonra, 22 numunenin manuel cPILOT için 7,5 saate kıyasla işlenmesi için 2,5 saat gereklidir. El kitabı ve otomatik cPILOT iş akışlarının karşılaştırmalarını daha fazla değerlendirmek için laboratuvarımızda deneyler devam ediyor. Laboratuvarımızdan gelen önceki raporlara göre, manuel cPILOT protein muhabiri iyon yoğunluklarının CV% ortalama% 20 bu değeri12aşan bazı aykırı idi.
cPILOT, peptid düzeyinde hücreler, dokular ve vücut sıvıları gibi herhangi bir örneklem türü için kullanılabilen kimyasal bir türeçleştirme stratejisidir. cPILOT gelişmiş numune çoklama sunar ve otomasyonun dahil edilmesiyle proteomik lerde yüksek iş hacmi örnek çoklamayı kolaylaştırabilir. Bu iş, hastalık ve biyolojik anlayış ve biyomarker keşfini ilerletmek için gereklidir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar RASR için Vanderbilt Üniversitesi Start-up Fonları ve NIH ödülü (R01GM117191) kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
| 2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
| C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
| Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
| Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
| Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
| Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
References
- Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
- Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
- Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
- Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
- King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
- Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).
