Summary
Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Sample-Multiplexing-Strategie, die in der Lage ist, die Anzahl der Proben zu erhöhen, die gleichzeitig mit verfügbaren isobarischen Tags analysiert werden können. Die Integration einer Roboterplattform hat den experimentellen Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die quantitative Genauigkeit erheblich erhöht.
Abstract
Wir haben einen quantitativen Proteomik-Workflow mit hohem Durchsatz, kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarischeKennzeichnung (cPILOT) eingeführt, die in der Lage ist, bis zu 22 bzw. 24 Proben mit Tandem-Massen-Tags oder isobaric N,N-Dimethyl-Leucin-Isobaric-Tags bzw. in einem einzigen Experiment zu multiplexen. Dieses verbesserte Probenmultiplexing reduziert die Erfassungszeiten der Massenspektrometrie erheblich und erhöht den Nutzen der teuren kommerziellen isobarischen Reagenzien. Der manuelle Prozess der Probenhandhabung und Pipettierschritte in der Strategie kann jedoch arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein und zu Probenverlusten und quantitativen Fehlern führen. Diese Einschränkungen können durch die Integration der Automatisierung überwunden werden. Hier haben wir das manuelle cPILOT-Protokoll an ein automatisiertes Flüssigkeitshandhabungsgerät übertragen, das große Probennummern (d.h. 96 Proben) parallel erstellen kann. Insgesamt erhöht die Automatisierung die Machbarkeit und Reproduzierbarkeit von cPILOT und ermöglicht eine breite Nutzung durch andere Forscher mit vergleichbaren Automatisierungsgeräten.
Introduction
Die auf der Massenspektrometrie (MS) basierende Proteomik ist ein unverzichtbares Forschungsinstrument, um krankheitsspezifische Biomarker zu identifizieren, das Fortschreiten der Krankheit zu verstehen und Leads für die therapeutische Entwicklung zu schaffen. Dies kann aus einer Reihe von krankheitsbedingten klinischen Proben wie Blutserum/Plasma, proximale Flüssigkeiten und Gewebe1,2erreicht werden. Proteomics Biomarker Entdeckung und Validierung haben in letzter Zeit erhebliche Berücksichtigung aufgrund der Leistungsfähigkeit der Probenmultiplexing-Strategien3,4. Das Sample-Multiplexing ist eine Technik, die den gleichzeitigen Vergleich und die Quantifizierung von zwei oder mehr Probenbedingungen innerhalb einer einzelnen MS-Injektion5,6ermöglicht. Das Probenmultiplexing wird erreicht, indem Peptide oder Proteine aus mehreren Proben mit chemischen, enzymatischen oder metabolischen Tags gekodiert und MS-Informationen aus allen Proben in einem einzigen MS- oder MS/MS-Experiment erhalten werden. Zu den verfügbaren isobarischen Tags gehören isobaric Tagging Reagenzien (iTRAQ), kommerzielle Tandem-Massen-Tags (TMT) und im Haus synthetisierte isobaric N,N-dimethyl leucin (DiLeu) Reagenzien mit Fähigkeiten bis zu 16-plex7 bzw. 21-plex8.
Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und die isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Probenmultiplexing-Technologie. cPILOT kombiniert die Isotopenbeschriftung von Peptid N-Termini mit leichten [(CH3)2] und schweren[(13C2H3)2] Isotopen bei niedrigem pH-Wert (2,5 ), wodurch der Lysinrückstand für die anschließende hohe pH-Kennzeichnung (8,5) mit TMT, DiLeu oder iTRAQ-Tagging3,9,10,11,12,13,14" zur Verfügung steht. Das duale Kennzeichnungsschema der cPILOT-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1 mit zwei Proben anhand eines Beispielpeptids dargestellt. Die Genauigkeit und Genauigkeit der TMT-basierten Quantifizierung auf MS2-Ebene kann durch das Vorhandensein kontaminierender, koisolierter und kofragmentierter Ionen, die als Interferenzeffekt15bezeichnet werden, beeinträchtigt werden. Diese Einschränkung in ungenauen Reporter-Ionen-Verhältnissen kann mit Hilfe von tribrid Orbitrap-Massenspektrometern überwunden werden. Beispielsweise kann der Interferenzeffekt überwunden werden, indem ein Peak in einem dimethylierten Paar auf der MS1-Ebene im Massenspektrometer isoliert wird, der leichte oder schwere Peak der MS2-Fragmentierung in der linearen Ionenfalle unterzogen wird und dann das intensivste MS2-Fragment für HCD-MS3 unterzogen wird, um quantitative Informationen zu erhalten. Um die Chancen auf die Auswahl der Peptide ohne Lysinamin elekläge, die für die Erzeugung von Reporterionen zur Verfügung stehen, zu erhöhen, kann auch eine selektiveMS3-Erfassung auf Basis des y-1-Fragments verwendet werden und ist ein Ansatz, der zu einem höheren Prozentsatz der mit cPILOT 9 quantifizierbaren Peptide führen kann. Die Kombination aus leichter und schwerer Beschriftung erhöht die Multiplexing-Fähigkeiten der Probe um den Faktor 2x auf den Faktor, der mit einzelnen isobarischen Tags erreicht wird. Wir haben vor kurzem cPILOT verwendet, um bis zu 24 Proben in einem einzigen Experiment mit DiLeu Reagenzien16zu kombinieren. Zusätzlich wurde cPILOT verwendet, um oxidative posttranslationale Modifikationen14 einschließlich Proteinnitration17, andere globale Proteome9, zu studieren und hat Anwendungen in mehreren Gewebeproben in einem Alzheimer-Mausmodell11demonstriert.
Robuste Probenvorbereitung ist ein kritischer Schritt in einem cPILOT-Experiment und kann zeitaufwändig, mühsam und umfangreich sein. Verbessertes Probenmultiplexing erfordert umfangreiches Pipettieren und hochqualifiziertes Laborpersonal, und es gibt mehrere Faktoren, die die Reproduzierbarkeit des Experiments stark beeinflussen können. Beispielsweise ist ein sorgfältiger Umgang mit Proben erforderlich, um ähnliche Reaktionszeiten für alle Proben zu gewährleisten und einen angemessenen Puffer-pH-Wert für leichte und schwere dimethylierte Proben aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann die manuelle Vorbereitung von Dutzenden bis Hunderten von Proben zu hohen experimentellen Fehlern führen. Um die Variabilität der Probenvorbereitung zu reduzieren, die quantitative Genauigkeit zu verbessern und den experimentellen Durchsatz zu erhöhen, haben wir einen automatisierten cPILOT-Workflow entwickelt. Die Automatisierung erfolgt mit einem Roboter-Flüssigkeitshandlinggerät, das viele Aspekte des Workflows vervollständigen kann (Abbildung 1). Die Probenvorbereitung von der Proteinquantifizierung bis zur Peptidkennzeichnung wurde auf einem automatisierten Flüssigkeitshandler durchgeführt. Der automatisierte Flüssigkeitshandler ist mit einem Positivdruckgerät (PPA) für den Pufferaustausch zwischen den Festphasen-Extraktionsplatten (SPE), dem Orbitalshaker und einem Heiz-/Kühlgerät integriert. Die Roboterplattform enthält 28 Deckstandorte für Platten und Puffer. Es gibt zwei Hülsen mit einem Greifer, um die Platten innerhalb der Deckpositionen zu übertragen: einen 96-Kanal-Festvolumen-Pipettierkopf (5-1100 l) und 8 Kanal-Variable Volumensonden (1-1000 l). Die Roboterplattform wird über eine Software gesteuert. Der Anwender muss professionell geschult werden, bevor er den Roboter-Flüssigkeitshandler verwendet. Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die Automatisierung des manuellen cPILOT-Workflows, der für die Verarbeitung von mehr als 12 Proben in einer Charge arbeitsintensiv sein kann. Um den Durchsatz des cPILOT-Ansatzes11zu erhöhen, haben wir das cPILOT-Protokoll an einen Roboter-Flüssigkeitshandler übertragen, um mehr als 10 Proben parallel zu verarbeiten. Die Automatisierung ermöglicht auch ähnliche Reaktionen für jede Probe parallel während verschiedener Schritte des Probenvorbereitungsprozesses, die hochqualifizierte Benutzer während der manuellen cPILOT zu erreichen erforderte. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Implementierung der automatisierten Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung zur Durchführung von cPILOT. Die vorliegende Studie beschreibt das Protokoll für die Verwendung dieses automatisierten Systems und demonstriert seine Leistungsfähigkeit anhand einer 22-plexitorischen "Proof-of-Concept"-Analyse von Mausleberhomogenaten.
Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt. Eine männliche Steuermaus (C57/BLJ) wurde kommerziell gekauft und in der Division of Laboratory Animal Resources der University of Pittsburgh untergebracht. Mäuse wurden standardmäßig Nagetier Labor chow ad libitum gefüttert und in einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus gehalten. Lebergewebe wurde geerntet und bei 80 °C gelagert.
1. Proteinextraktion
HINWEIS: Diese Schritte werden manuell ausgeführt.
- Mausleber (100 mg) mit Saline waschen und mit 500 l 8 M Harnstoff mit einem mechanischen Homogenisator mit Lysing-Matrix A-Perlen für 4 m/s für 20 s homogenisieren.
HINWEIS: In dieser Studie wurden Protease- oder Phosphatase-Inhibitoren nicht zugesetzt, können aber auf der Grundlage des Experiments bei Bedarf dem Puffer zugesetzt werden. Auch Proteinextraktionsschritte können für verschiedene Probentypen entsprechend angepasst werden. - Übertragen Sie das Gewebehomogenat in ein neues Mikrozentrifugenrohr, spülen und kombinieren Sie die Lysing-Röhrchen mit 100-500 l PBS mit 8 M Harnstoff.
- Zentrifugieren Sie die homogenisierten Gewebe (12.800 x g,4 °C und 15 min) und sammeln Sie den Überstand.
HINWEIS: Die restlichen Schritte werden auf dem Roboter-Flüssigkeitshandler durchgeführt, der im Labor des Benutzers verfügbar ist. Der Flüssigkeitshandler muss in der Lage sein, Puffer von und zu DEN von ANCI angegebenen Plattentypen zu ansaieren und zu dosieren, wobei die Teilnehmer beteiligungsmäßig minimal beteiligt sind. - Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure(BCA) Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Schalten Sie das PPA, das Heiz-/Kühlgerät und die Vakuumpumpen ein und schließen Sie das gesamte Zubehör mit einem Flüssigkeitshandler an. Der Flüssigkeitshandler zeigt ein blaues Licht an, sobald er mit dem Computer verbunden und betriebsbereit ist.
- Um die Platte 1 (96 Wellplatte) zu reagenziieren, fügen Sie 30 l von 25 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 l Cystein und 25 mM 30 L Iodoacetamid (IAA) zu den Zeilen 1, 2 und 3 hinzu.
- 8 M Harnstoff und 20 mM Tris mit 10 mM CaCl2 (pH 8.2) zu einer Reservoirplatte geben. Fügen Sie 500 l 5% Ameisensäure auf 2 ml tiefe Brunnenplatte, 20 l Trypsin zu Reihe 1 der Trypsinplatte und legen Sie sie in die Deckposition, wie durch die Methode angegeben.
HINWEIS: IAA und Trypsin wurden der 96-Well-Platte hinzugefügt, bevor sie der Probe hinzugefügt wurden. - Aliquot 300 l der Leber homogenisieren in ein 500-L-Rohr und legen Sie auf eine 2 ml tiefe Brunnenplatte und legen Sie sie bei 4 °C bis zum Beginn des Protokolls. Für dieses Experiment wurden 22 Aliquots aus dem einzelnen Leberhomogenat erzeugt.
ANMERKUNG: Fügen Sie einen internen Qualitätskontrollstandard (z. B. Rinder-Alpha-Casein oder anderes exogenes Protein) mit dem Verhältnis 1 g-Standard hinzu: 100 g Proteinprobe. - Definieren Sie das Volumen der Puffer, die den Stichproben durch Variablennamen und Wert gemäß Tabelle 1hinzugefügt werden sollen. Basierend auf dem BCA geben Sie das Volumen der Probe und den Normalisierungspuffer (8 M Harnstoff) in einer Kalkulationstabelle ein und fügen Sie sie an die Software an (Tabelle 2).
HINWEIS: Eine weitere Verdünnung mit Puffer kann erforderlich sein, wenn die Proteinkonzentration zu hoch ist. Die resultierenden Konzentrationen für die Probe aus dem Lebergewebe betrugen 10 g/l. Das Puffervolumen wurde für 100 g Protein optimiert. - Entnahmeproben aus 4 °C entfernen, auf die angegebene Deckposition des automatisierten Flüssigkeitshandlers legen und 10 min erwärmen lassen.
- Öffnen Sie die Methode, und befolgen Sie die Anweisungen, um die erforderlichen Tipps (1070, 90 und 230 L) und Labware in die gewünschten Positionen zu platzieren. Sobald alle Labware und Tipps vorhanden sind, kreuzen Sie die Scheckmitmit mit dem endgültigen Deck-Layout und klicken Sie auf Weiter, um das Protokoll fortzusetzen.
HINWEIS: Die geführte Einrichtung informiert den Benutzer, der spezifischen Labware je nach Protokoll und zu haltendem Deckstandort ein erforderliches Puffervolumen hinzuzufügen.
2. Probenreduktion, Alkylierung und Verdauung
- 230 L-Spitzen und 90 l 8 M Harnstoff aus dem Reservoir aussaugen und auf Reihe 1 der schwarzen 2 ml Tiefenbrunnenplatte abgeben. Entladen Sie die Tipps. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis 8 M Harnstoff allen Brunnen hinzugefügt wird, die den 22 Proben entsprechen.
HINWEIS: Der Denaturierungspuffer löst die dreidimensionale Struktur des Proteins ab, um die primäre Struktur zu erhalten, damit das Trypsin effektiv wirken und das Protein brechen kann. Die 8-Kanal-Pipette kann verschiedene Volumina für die 8 Kanäle ansaugen und an verschiedenen Stellen in der Labware abgeben. In diesem Schritt haben alle Kanäle das gleiche Volumen wie in der Software definiert angesaugt. - Nach Zugabe des Denaturierungspuffers die 90 L-Spitzen und das Aspirieren von 10 'L (entspricht 100'g) der Mausleber homogenisieren sie mit der 8-Kanal-Pipette auf die schwarze 2 ml Tiefe Brunnenplatte. Entladen Sie die Tipps. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle 22 Samples übertragen werden.
- Führen Sie nach jeder Übertragung einen Mixschritt durch, um den Brunneninhalt dreimal zu aspirieren und zu verteilen, um sicherzustellen, dass das Protein mit dem Puffer vermischt wird, um ein Verhältnis von 1:1 aufweisen zu können.
HINWEIS: Stoffhomogenatprobe entfernen und in -80 °C geben. - Um die denaturierten Proteine zu reduzieren, laden Sie eine Reihe von 90 L-Spitzen und aspirieren Sie 3 l DTT von der Reagenzplatte 1. Geben Sie DTT auf die Reihen 1 und 2 der schwarzen 2 ml tiefen Brunnenplatte und entladen Sie die Spitzen.
HINWEIS: Das Protein: DTT-Molarenverhältnis wird bei 1:40 für die Reduzierung von Disulfidbindungen beibehalten. Die Berechnung für das Molverhältnis basiert auf der Proteinmasse des Rinderserumalbumins (BSA), die 66,5 x 103 g/mol beträgt. - Versiegeln Sie die Probenplatte mit Aluminiumfolie und brüten bei 37 °C für 600 s bei 300 Umdrehungen pro Minute.
- Fügen Sie 30 l 0,25 M IAM in Zeile 3 der Reagenzplatte 1 kurz vor Gebrauch hinzu und legen Sie sie auf das Deck. Entsiegeln Sie die Probenplatte und kehren Sie zum Deck zurück.
HINWEIS: IAM ist lichtempfindlich. - Eine Reihe von 90 L-Spitzen laden, 6 l IAM von der Reagenzplatte 1 in Zeile 3 absaugen und auf Zeile 1 der Probenplatte verteilen. Entladen Sie die Tipps.
HINWEIS: Das Protein: IAM-Molarenverhältnis wird für jede Probe bei 1:80 gehalten. Diese Reaktion muss im Dunkeln erfolgen. - Die Probenplatte versiegeln und bei 4 °C 30 min bei 300 Umdrehungen pro Minute auf dem Heiz-/Kühlgerät inkubieren.
HINWEIS: Die Versiegelung der Platte wird durchgeführt, um zu verhindern, dass die Probe leicht, verdunstet und aus dem Brunnen verschüttet wird. - Entsiegeln Sie die Probenplatte und laden Sie eine Reihe von 90 L-Spitzen und aspirieren Sie 5 l Cystein aus der Reagenzplatte 1 in Zeile 2. Geben Sie auf die Zeilen 1 und 2 der Probenplatte und entladen Sie die Spitzen. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
HINWEIS: Das Protein: L-Cystein-Molarenverhältnis wird bei 1:40 beibehalten. - Legen Sie die Probenplatte auf den Orbital-Shaker, um einen zeitgezeitigten Shake von 1800 Umdrehungen pro Minute für 30 min durchzuführen.
- Fügen Sie jedem Bohrgut der Probenplatte 800 l von 20 mM Tris Puffer mit 10 mM CaCl2 (pH 8.2) hinzu, um die Harnstoffkonzentration auf 2 M zu verdünnen.
HINWEIS: Die Trypsinaktivität wird bei höheren Harnstoffkonzentrationen behindert und muss daher auf weniger als 2 M reduziert werden. Diese Studie wurde mit einem Protein-Trypsin-Molar-Verhältnis von 50: 1 für 14 h durchgeführt. - Fügen Sie 20 L Trypsin zu Zeile 1, Spalte 1-12 einer 96-Wellplatte hinzu und an einer bestimmten Stelle auf dem Deck zu platzieren.
- Eine Reihe von 90 L-Spitzen laden, 2 l Trypsin aus der Trypsin-Plattenreihe 1 absaugen und auf die Reihen 1 und 2 der Probenplatte abgeben. Entladen Sie die Tipps.
- Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie 14 h bei 37 °C bei 600 Umdrehungen pro Minute auf dem Heiz-/Kühlgerät.
- Nach der Inkubation die Probenplatte entsiegeln und 5% Ameisensäure zu Zeile 3, Spalte 1- 12 einer tiefen Brunnensammelplatte hinzufügen und auf das angegebene Deck legen.
- Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 150 l 5% Ameisensäure aus Zeile 3 der Ameisensäureplatte hinzufügen und in den Reihen 1 und 2 auf die Probenplatte abgeben. Entladen Sie die Tipps.
3. Entsalzungsschritt 1
- Die Peptide mit SPE-Platte mit 20 mg Targa C-18 Material entsalzen. Fixieren Sie das Volumen für jeden Pufferaustausch auf 600 l und fixieren Sie den Druck auf 100 mbar.
- 1070 L-Spitzen und 600 l Acetonitril ansaugen und auf die Reihen 1 und 2 der SPE-Platte verteilen. Legen Sie die SPE-Platte auf PPA und setzen Sie Druck auf.
- Mit den gleichen Spitzen 600 l Acetonitril aspirieren und auf die Reihen 1 und 2 der SPE-Platte abgeben. Legen Sie die SPE-Platte auf PPA und setzen Sie Druck auf.
HINWEIS: Der Durchfluss kann mit einer Saugpumpe abgelassen werden. - 1070 L-Spitzen und 600 l Puffer A (100 % Wasser in 0,1 % Ameisensäure) ansaugen und auf die Reihen 1 und 2 der SPE-Platte verteilen. Legen Sie die SPE-Platte auf PPA und setzen Sie Druck auf.
HINWEIS: Wenn das Volumen des Puffers nicht signifikant reduziert wird, versuchen Sie, den Druck oder die Zeit zu erhöhen. - Laden Sie 2 Reihen mit 1070 L-Spitzen, aspirieren Sie 534 l der verdauten Proben und geben Sie sie an den Reihen 1 und 2 der SPE-Platte ab. Legen Sie die SPE-Platte auf PPA und setzen Sie Druck auf. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Beispiele geladen sind.
HINWEIS: Da das Gesamtvolumen nach Zugabe von Ameisensäure 1068 l betragen wird und die Proben in zwei Durchgängen zugegeben wurden. - Laden Sie 2 Reihen der verwendeten 1070 L-Spitzen, aspirieren Sie 600 l Puffer A und geben Sie auf die Zeilen 1 und 2 der SPE-Platte. Legen Sie die SPE-Platte auf PPA und setzen Sie Druck auf.
- Wiederholen Sie den obigen Schritt einmal, um die Probe zu reinigen.
- 1 Reihe mit 1070 L-Spitzen beladen, 600 l ACN aspirieren: Wasser (60:40) und auf die Reihen 1 und 2 der SPE-Platte abgeben. Legen Sie die SPE-Platte auf eine Sammelplatte, um die Peptide mit PPA zu entschärfen und Druck aufzutragen.
- Wiederholen Sie den obigen Schritt, um die Peptide in der Sammelplatte zu vereitpen. Die Sammelplatte trocknen und bei -80° C bis zur Weiterverarbeitung lagern.
4. Dimethylierungskennzeichnung (Peptid N-termini)
- Legen Sie die erforderlichen Spitzen (1070, 90 und 230 L) und Labware in die gewünschten Positionen in der Software. Sobald alle Labware und Tipps vorhanden sind, kreuzen Sie die Scheckmitmit mit dem endgültigen Deck-Layout und klicken Sie auf Weiter, um das Protokoll fortzusetzen.
- Um die Reagenzplatte 2 zu reagenziieren, fügen Sie 450 l 1% Essigsäure, 50 l leichtes Formaldehyd (CH2O), 50 l schweres Formaldehyd(13CD2O) und 150 l Ameisensäure in die Reihen 1, 2, 3 und 4 ein.
- Um die Platte 3 zu reagenziieren, geben Sie 50 l leichtes CB, 50 l schweres CB, zu den Reihen 1 und 2 und 50 l Ammoniak zu Zeile 3 und 4 hinzu.
- 2 Reihen mit 230 L-Spitzen und 100 l 1% Essigsäure aus Reihe 1 der Reagenzplatte 2 absaugen und in die ausgetrockneten Peptide in der Probenplatte 2 (Sammelplatte aus dem Entsalzungsschritt) Reihen 1 und 2 abgeben und ein zeitgezeitetes Schütteln für 5 min bei 1800 Umdrehungen pro Minute durchführen.
- Laden Sie 90 L-Spitzen und aspirieren Sie 16 l von 60 mM (4%) CH2O (37% gew./v) aus Zeile 2 der Reagenzplatte 2 und auf Zeile 1 der Probenplatte abgeben. Entladen Sie die Tipps.
- 1 Reihe mit 90 L-Spitzen laden und 16 l von 60 mM (4%) 13 CD2O (20% gew./v) aus Zeile 3 der Reagenzplatte 2 und auf Zeile 2 der Probenplatte abgeben. Entladen Sie die Tipps.
ANMERKUNG: In dieser Studie entspricht Zeile 1 licht- und Zeile 2 entspricht schweren dimethylierten Proben (siehe Abbildung 1). - 2 Reihen mit 90 L-Spitzen und Aspirat 16 l von 24 mM NaBH3CN und 24 mM NaBD3CN aus Reihe 1 und 2 der Reagenzplatte 3 und auf die Reihen 1 und 2 bzw. der Probenplatte abgeben.
- Entladen Sie die Spitzen und führen Sie einen zeitgetitigen Shake für 15 min bei 1800 Rpm mit dem Orbital-Shaker durch.
HINWEIS: Das Hinzufügen von Natriumcyanoborohydrid leitet die Reaktion ein und reduziert daher die Variabilität zwischen den Experimenten, die dieser Schritt einmal pro Charge durchgeführt wird. - 2 Reihen von 90 L-Spitzen und 32 l 1% Ammoniak (ca. 28-30 % v/v) aus den Reihen 3 und 4 der Reagenzplatte 3 auftragen und auf die Reihen 1 bzw. 2 der Probenplatte 2 abgeben. Entladen Sie die Tipps.
ANMERKUNG: Das Hinzufügen von Ammoniak stoppt die Reaktion, um die Variabilität zwischen den Experimenten zu reduzieren, dieser Schritt wird einmal pro Charge durchgeführt. - Kombinieren Sie gleiche Mengen an leichten und schweren (1:1) dimethylierten Peptiden zu einer neuen 2 ml tiefen Brunnenplatte zum Entsalzen.
ANMERKUNG: In dieser Studie wurden 90 l des Brunnengehalts aus Zeile 1 mit 90 l Der Reihe 2 von Probenplatte 2 zu einer neuen 2 ml Sammelplatte (Sample Plate 3) kombiniert. Das Verhältnis von Licht: schwereS Mischen hängt vom experimentellen Protokoll ab, in dieser Studie wurde ein Verhältnis von 1:1 verwendet. - Laden Sie 2 Reihen mit 230 L-Spitzen und aspirieren Sie 32 l 5% Ameisensäure in die kombinierten Proben und führen Sie ein zeitgezeitetes Schütteln für 30 s bei 1800 Rpm durch.
HINWEIS: Die Dimethylierungseffizienz hängt vom pH-Wert des Reaktionsgemisches ab, und jede Änderung des Puffer-pH-Werts führt zu einer unvollständigen Kennzeichnung des Peptids N-termini. Die Dimethylierungseffizienz sollte bei der Suche als dynamische Modifikation am Peptid N-termini größer als 97 % sein. In dieser Studie betrug die Etikettierungseffizienz von leichten und schweren Peptiden 99,7 % bzw. 99,5 %.
5. Entsalzungsschritt 2
- Führen Sie eine Musterentaltung ähnlich dem Entaltschritt 1 für die kombinierten Samples durch.
- Trocknen Sie die Proben in der Probenplatte mit einem Geschwindigkeitsvakuum und lagern Sie sie bei -80 °C bis zur WeiterenVerarbeitung.
6. Isobarische Markierung (Lys-Rückstände)
- Befolgen Sie die geführte Labware-Einrichtung und platzieren Sie die erforderlichen Tipps (1070, 90 und 230 L) mit entsprechenden Puffern. Sobald alle Labware und Tipps vorhanden sind, kreuzen Sie die Scheckmitmit mit dem endgültigen Deck-Layout und klicken Sie auf Weiter, um das Protokoll fortzusetzen.
- Fügen Sie die Zeilen 1 und 2 der Reagenzplatte 4 250 l von 100 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB), 30 l Hydroxylamin (10 % w/v) hinzu. Legen Sie die TMT-Rohre auf die 2 ml Tiefbrunnenplatte gemäß tabelle in Tabelle 3.
- Bewahren Sie ein leeres 1,5 ml Rohr in einem Rohrträgerhalter auf, um die getaggten Peptide zu bündeln. Legen Sie die getrocknete Probenplatte an P9 und TMT-Verarbeitungsplatte an P14.
- Um die Peptide zu rekonstituieren, 230 L-Spitzen und 100 l von 100 mM Triethyl-Ammonium-Bicarbonat(TEAB)-Puffer (pH-Nr. 8,5) aus Reihe 1 an der TEAB-Platte zu laden und in Reihe 3 der Probenplatte 3 auf die getrockneten Peptide zu verteilen. Legen Sie die Platte auf den Orbital-Shaker für 30 s bei 1800 Rpm.
ANMERKUNG: Rekonstituieren Sie 100 g dimethylierte Peptide in einer Konzentration von 1 g/l. - 90 L-Spitzen und 10 l wasserfreies Acetonitril aus H12 der TMT-Platte eintragen und in jede der getrockneten TMT-Rohre geben.
- Entfernen Sie die TMT-Rohre, Wirbel, und schnell drehen Sie die Rohre und kehren Sie zu Deck in tiefen Brunnenplatte.
- 1 Reihe mit 90 L-Spitzen und 12,5 l der kombinierten dimethylierten Peptide ansaugen und in die Reihe 1 der TMT-Verarbeitungsplatte geben. Entladen Sie die Tipps.
HINWEIS: Das TMT:-Peptidverhältnis wurde für dieses Experiment bei 1:8 beibehalten. - 1 Reihe mit 90 L-Spitzen und 10 L TMT-Spitzen auftragen und auf die Reihe 1 der TMT-Verarbeitungsplatte verteilen. Entladen Sie die Spitzen, führen Sie einen Zeitshake für 1 Stunde bei 1800 Rpm.
- 1 Reihe mit 90 L-Spitzen und Aspirat 8 l Hydroxylamin (10% w/v) aus Reihe 2 an der TEAB-Platte laden und in die Reihe 1 der TMT-Verarbeitungsplatte geben. Entladen Sie die Spitzen, führen Sie ein zeitiertes Schütteln für 15 min bei 1800 Rpm durch.
- Kombinieren Sie 30,5 l der TMT-gekennzeichneten Peptide von der TMT-Verarbeitungsplatte auf 1,5 ml Rohr. Entladen Sie die Tipps nach jeder Übertragung.
- Entfernen Sie das Rohr mit den gepoolten Proben und trocknen Sie, um das Acetonitril zu verdampfen. Peptide in 0,2 ml Wasser in 0,1 % Ameisensäure rekonstituieren und auf das Deck zurückkehren.
HINWEIS: Die Etikettiereffizienz der isobaric-Kennzeichnung ist ebenfalls pH-spezifisch und die Etikettiereffizienz sollte nach Herstelleranweisungen über 98 % liegen. In dieser Studie betrug die TMT-Etikettiereffizienz des Lysins, das leichte und schwere Peptide beendete, 99,4 % bzw. 99,5 %.
7. Entsalzungsschritt
- Führen Sie eine Probeentaltung ähnlich der Desalt 1 für ein Beispiel durch.
- Trocknen Sie die Proben und lagern Sie sie in -80 °C bis zur Analyse.
8. Flüssigchromatographie–Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und MS3
- Rekonstituieren Sie die Peptide in MS-Wasser mit 0,1% FA, um eine Konzentration von 1 g/l zu erhalten. Filterproben mit Mikrozentrifugenrohren, die einen 0,65-mm-Filter enthalten. Zentrifugenpeptide bei 12.000 x g für 3 min und legen Sie den Durchfluss in eine Auto-Sampler-Durchstechflasche.
HINWEIS: Die Peptidkonzentration kann in diesem Stadium auf Wunsch bestätigt werden. Die Peptide müssten in LC-MS-Wasser rekonstituiert und einem BCA-Peptidtest unterzogen werden. In dieser Studie wurde das Peptid BCA-Assay nicht durchgeführt und alle Peptidmengen basierten auf dem ersten Protein BCA-Assay. - Bereiten Sie die mobilen Phasenpuffer wie folgt vor: 100% (v/v) Wasser mit 0,1% FA (A) und 100% ACN mit 0,1% FA (B).
- In eine Fallensäule mit 2 cm C18-Material (3 m, 100 x Porengröße) injizieren.
HINWEIS: Die Probenreinigung der Falle erfolgt wie folgt: 10 min, 100% A; 2 l/min mit einem 2D-Flüssigkeitschromatographiesystem. - Führen Sie die analytische Trennmethode aus. Verwenden Sie eine 100 x 26 cm große Laser-Gezogen-Spitze mit Kieselsäure-Kapillarsäule, verpackt mit C18-Material (2,5 m, 100 x). Der Gradient ist: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 Min.
- Führen Sie die Datenerfassung für das Massenspektrometer aus, während die analytische Trennmethode ausgeführt wird.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für den MS-Vermessungscan: 375-1.500 m/z, 120.000 Auflösung, Zykluszeit 3 s (Spitzengeschwindigkeit), automatische Verstärkungssteuerung (AGC) Ziel 4.0e5, maximale Einspritzzeit 50 ms.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für CID–MS/MS mit Ionenfalle: Datenabhängige Erfassungsscans (DDA) pro Ergebnis, 2 m/z Isolationsbreite, 35% normalisierte Kollisionsenergie (NCE), 0,25 Aktivierung q, 10 ms Aktivierungszeit, 1,0e4 AGC, 100 ms maximale Einspritzzeit.
- Verwenden Sie die folgenden Parameter für HCD–MS3 SPS 10: Scanbereich 100-400 m/z, Anzahl der abhängigen Scans 10, AGC 5.0e4, maximale Einspritzzeit 118 ms, HCD Kollisionsenergie 55%, MS2 Isolationsfenster 2.
9. Datenanalyse
- Durchsuchen Sie generierte RAW-Dateien für die Liste der Proteine und Peptide mit einer Proteinanalyse-Software für eine geeignete Datenbank.
HINWEIS: Die in dieser Studie generierten RAW-Dateien wurden anhand einer Uniprot-Datenbank mit der Maus durchsucht. - Da es sowohl leichte als auch schwere Beschriftungen in einer RAW-Datei gibt, durchsuchen Sie jede Datei mit zwei Workflows nach leichten und schweren dimethylierten Peptiden.
- Durchsuchen Sie die RAW-Dateien mit der Maus Uniprot Datenbank (13.07.2019) mit 53035 Sequenz mit den folgenden Parametern: Trypsin Spaltung mit maximal zwei verpassten Spaltungen, Peptid mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, 15 ppm Elternmassentoleranz, 1 Da-Fragmentierungstoleranz Statische Modifikationen: leichte Dimethylierung (+28.031, Peptid N-terminus) oder schwere Dimethylierung (+36.076 Da, Peptid N-terminus), Carbamidomethyl (+57.021 Da, C), Dynamische Modifikationen: Oxidation (+15.995 Da, M), 11-plexisobes Tag (229.163 Da, K), 1% FDR, Reporter-Ionen-Quantifizierung mit 30 ppm Spitzenintegrationstoleranz, zuversichtlichster Schwerpunkt für Integrationsmethode.
ANMERKUNG: Der schwere dimethylierte Peak enthält auch eine weitere Modifikation, die 7 Da (+35.069 Da, Peptid N-terminus) aus dem lichtdimethylierten Peak ist und daher ein weiterer Suchknoten eingebaut werden sollte, um diese Modifikation ebenfalls einzubeziehen. - Führen Sie Reporter-Ionen-Quantifizierung basierend auf der Intensität, 65% SPS-Massenübereinstimmung, durchschnittliches S/N-Verhältnis 10, Isotopenkorrektur, Normalisierung und Skalierung wurden nicht durchgeführt.
HINWEIS: Normalisierung und Skalierung können basierend auf der Gesamtpeptidmenge oder einem bestimmten Protein, das der Probe zugesetzt wird, durchgeführt werden. QC-Beispiele können auch in die Kanäle für die Normalisierung zwischen Batch- oder Intrabatch-Verbindungen auf der Grundlage einer zweischwanzigen internen Referenzskalierung18eingeschlossen werden. Die Isotopenkontaminationen verschiedener TMT-Kanäle wurden der Suche nicht zur Verfügung gestellt, Benutzern wird empfohlen, die Isotopenkontamination verschiedener Reporterionen hinzuzufügen.
Representative Results
Abbildung 2 zeigt repräsentative MS-Daten eines Peptids, das in allen 22 Reporterionenkanälen aus einem 22-Plex-cPILOT-Experiment identifiziert wurde, einschließlich Workflow-Replikationen. Abbildung 2 (oben) zeigt ein doppelt geladenes Spitzenpaar, das durch 4 Da m/z-Abstand getrennt ist und eine einzelne Dimethylgruppe anzeigt, die in das Peptid integriert ist. Die leichten und schweren dimethylierten Spitzenpaare wurden unabhängig voneinander isoliert und fragmentiert, um die Sequenz des Peptids zu ergeben. Die Sequenz des Peptids ist G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) und entspricht dem Protein Betain-Homocystein-S-Methyltransferase. Die intensivsten Fragmentionen sowohl für die leichten als auch für die schweren dimethylierten Spitzen(nicht dargestellt)wurden für die MS3-Fragmentierung weiter isoliert und die Reporterionen (m/z 126-131) sind in Abbildung 2 (unten) dargestellt. Die Ionenintensitäten des Reporters stehen in direktem Verhältnis zur Peptidfülle in der Probe. Die Peptidfülle der Proben impliziert, dass die Pipettierfähigkeit der Roboterplattform in den 22 Proben ziemlich gleichmäßig ist. Insgesamt ergab dieses 22-plexcPILOT-Experiment 1326 (1209-light/1181-heavy) Protein-Identifikationen, die aus 3098 (6137-light/5872-heavy) Peptiden resultierten (Tabelle 4). Abbildung 3 zeigt das Box-Diagramm der log10-Überfluss menge im Vergleich zu den Gesamt-Reporterionenintensitäten auf allen 22 Kanälen, die eine geringere Inter-Well-/Inter-Sample-Variabilität anzeigen. Die Bewertung der Gesamtautomatisierung erfolgte durch die Untersuchung des Fehlers in der Reporterionenfülle über jedes Protein in den 22 Proben. Abbildung 4 zeigt, dass die Probenverarbeitung mit der Roboterplattform zu sehr niedrigen CV-Werten geführt hat. Insbesondere betrug bei den 3098 festgestellten Peptiden der durchschnittliche Lebenslauf in der Reporterionenfülle 12,36 % bzw. 15,03 % für leichte und schwere dimethylierte Peptide. Unter diesen Peptiden 2032 dieser Peptide hatte Reporter-Ionen-Signal über der Mindestschwelle und wurden als quantifizierbar.
Abbildung 1. Experimenteller Workflow zur Verarbeitung von 22 Proben parallel zu einem automatisierten cPILOT-Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Quantifizierung von Peptiden in 22 Proben. Beispiel MS (oben) und MS3 (unten) Spektren des Peptids G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) quantifiziert in 22-plexe automatisiertem cPILOT-Experiment für leichte dimethylierte (unten links) und schwere dimethylierte (unten rechts) Spitzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Box-Plot der gesamten Reporterionenintensitäten im Vergleich zu log10 Fülle von 22 Proben mit Proteom-Entdecker 2.3. Die RAW-Datei wurde zweimal nach leichten und schweren Peptiden, Protein-IDs getrennt mit TMT als dynamische Modifikation, leicht (+28.031 Da) und schwerer (+36.076 & +35.069 Da) Dimethylierung bei Peptid N-termini als statische Modifikation durchsucht. Eine kombinierte Suche mit allen oben genannten Modifikationen wurde mit Proteome Discover 2.3 ausgeführt, um die Log 10 Fülle von Peptidintensitäten über alle Kanäle zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Geigenplots der Koeffizienten der Variation der Peptidfülle von summierten Reporterionenintensitäten über Kanäle 126-131 m/z. Das Peptid wurde mit einem durchschnittlichen CV-Wert von 12,36 und 15,03 für leichte (2373) und schwere (2533) quantifizierbare Peptide quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1. Abbildung des cPILOT mit einem einzigen Peptid. Die Isotop-Kennzeichnung von zwei verschiedenen Proben und isobaric-Tagging mit TMT126wurde der resultierenden Mischung in MS für LC-MS3injiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
| Variablenname | Wert | Beschreibung |
| DesaltSamp1 | 1065 | Volumen für Entaltschritt 1 |
| DesaltSamp2 | 392 | Volumen für Desaltschritt 2 |
| DesaltSamp3 | 100 | Volumen für Entaltschritt 3 |
| Devmode | FALSE | False verkürzt die Inkubationszeiten auf 30sec- True folgt dem Inkubationszeitpunkt im Protokoll. |
| DTTVol | 3 | Volumen der DTT |
| FilterPlate | Targa | Platte zur Entsalzung |
| FilterPlateVol | 600 | Volumen zum Entsalzen |
| HAWaterWashes | FALSE | Anzahl der Wasserwass auf der SPE-Platte |
| IAMVol | 2 | Volumen von Iodoacetamid |
| PeptideTMTVol | 12.5 | Peptidvolumen für die TMT-Kennzeichnung |
| Druck | 100 | mbar Druck bei PPA |
| TempOffSet | 1 | Temperaturänderung |
| TMTVol | 10 | Isobaric-Tag-Volume wird hinzugefügt |
| TrisVol | 800 | Volumen zur Verdünnung der Probe vor der Verdauung |
| TrypsinVol | 2 | Volumen von Trypsin |
| UsePopTimer | STIMMT | True zeigt die Optionen zum Druck auf die Platte bei Bedarf an |
Tabelle 1. Liste der Variablen, die im automatisierten cPILOT-Protokoll verwendet werden.
| DilSource | DilWell | Dest | DestWell | DilVolume | StockSource | Stockwell | SampleVol | SampleID |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 1 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 2 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 3 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 4 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 5 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 6 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 7 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 8 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 9 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 10 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 11 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | A12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 12 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 13 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 14 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 15 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 16 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 17 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 18 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 19 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 20 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 21 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 22 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 23 |
| 8M_Urea | 1 | Proben | B12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 24 |
Tabelle 2. Volumen der Mausleber homogenat und 8 M Harnstoff.
| SourceWell | SourceWell2 | Reporter Ion | DestWell1 | DestWell2 | Volumen | SampleID |
| A1 | C1 | 126 | A1 | E1 | 10 | 1 |
| A3 | C3 | 127N | A2 | E2 | 10 | 2 |
| A5 | C5 | 127C | A3 | E3 | 10 | 3 |
| A7 | C7 | 128N | A4 | E4 | 10 | 4 |
| A9 | C9 | 128C | A5 | E5 | 10 | 5 |
| A11 | C11 | 129N | A6 | E6 | 10 | 6 |
| B2 | D2 | 129C | A7 | E7 | 10 | 7 |
| B4 | D4 | 130N | A8 | E8 | 10 | 8 |
| B6 | D6 | 130C | A9 | E9 | 10 | 9 |
| B8 | D8 | 131N | A10 | E10 | 10 | 10 |
| B10 | D10 | 131C | A11 | E11 | 10 | 11 |
Tabelle 3. Gesamtzahl der Peptide, Proteine und Peptidspektralübereinstimmungen (PSMs).
| Automatisierter cPILOT | ||
| Licht | Schwere | |
| Proteine | 1209 | 1181 |
| Peptide | 6137 | 5872 |
| Psms | 14948 | 16762 |
Tabelle 4. Barcoding der isobaric Tags mit den leichten und schweren beschrifteten Proben.
Discussion
cPILOT ist eine verbesserte Multiplexing-Strategie, die bis zu 24 Proben in einem einzigen Experiment analysieren kann. Die Multiplexing-Kapazität hängt von der Anzahl der verfügbaren isotopischen und isobarischen Tagging-Kombinationen ab. Die Einführung des TMTpro7, der in der Lage ist, 16 Proben in einzelexperimentn zu markieren, kann die Grenzen von cPILOT auf 32-plex verschieben. cPILOT besteht aus mehreren Pipettierschritten und erfordert umfangreiche Sorgfalt und Benutzerfertigkeiten, um die Probenvorbereitung durchzuführen. Auch bei einem fachkundigen Anwender sind manuelle Fehler unvermeidlich, die den Einsatz von Roboterplattformen zur Bearbeitung von Proben in der cPILOT-Strategie einlädt. Da cPILOT pH-abhängige Markierungen der Peptide verwendet, muss der pH-Wert für das Licht und den schweren dimethylierten Satz von Proben aufrechterhalten werden. Leicht saur-Basic pH kann zur Dimethylierung von N-Termini- und Lysinrückständen führen. Ein Vorteil von cPILOT ist, dass es nur die Hälfte der isobarischen Tags benötigt, da Peptid N-termini mit den Dimethylgruppen besetzt sind. Dadurch kann eine größere Anzahl von Proben zu halben Kosten gekennzeichnet werden. Die Handhabung größerer Probennummern erfordert, dass die Expositionszeiten für Reagenzien für die erste und die letzte Probe in einer Charge ähnlich sind. Ein Pipettenspender, der bis zu 32 Proben parallel aufnehmen kann, kann am besten mit Deminkern von Flüssigkeitshandhabungsgeräten erreicht werden.
Um mehrere Proben von cPILOT zu verarbeiten, wurde der manuelle Workflow um Automatisierung geändert. Der in dieser Studie verwendete Roboter-Flüssigkeitshandler verfügt über zwei Hülsen mit 96-Kanal- und 8-Kanal-Pipettierfähigkeiten, mit einem Greifer, um die Platten in den verfügbaren 28 Deckpositionen zu platzieren. Der Flüssigkeitshandler ist mit einem Positivdruckgerät, einem Orbital-Shaker und einer Vorrichtung zum Erhitzen/Kühlen von Proben in der 96-Well-Platte integriert. Der Positivdruckapparat hilft bei der Durchführung von Pufferaustauschen in den SPE-Platten während der Reinigung, während der Orbital-Shaker hilft, die Proben zu wirbeln/zu mischen. Die Roboterplattform wurde so programmiert, dass Sie Puffer und Proben an 96-Well-Platten, Inkubationen, Wirbelproben und Transferplatten ansaugen und verteilen. Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Viskositäten, wie Acetonitril und Wasser, erfordern spezifische Pipettierüberlegungen, die auch in die Methode programmiert werden können.
Der cPILOT-Workflow, angefangen von der Proteinquantifizierung durch BCA bis zur Kennzeichnung der Peptide mit isobarischen Tags (d.h. TMT), wurde auf dem Flüssigkeitshandlersystem durchgeführt. Das komplette Protokoll wurde so skaliert, dass 96 Tiefbrunnenplatten verwendet werden, die 2 ml pro Brunnen aufnehmen können. Die Puffer wurden vor Beginn des Experiments vorbereitet und der 96-Wellplatte hinzugefügt, um eine parallele Probenbearbeitung zu ermöglichen. In der vorliegenden Studie wurden 22 Workflow-Replikationen von Mausleberhomogenat zu den Tiefenbrunnenplatten hinzugefügt und durch das cPILOT-Protokoll übernommen. Schließlich wurde dem Massenspektrometer eine einzige Probe injiziert, die aus den 22-plexe equimolaren Mausleber-Tagged-Peptiden besteht. Reporter-Ionen-Intensitäten, die Peptid-Überfluss in den Proben entsprachen, zeigten, dass Proben, die mit dem Flüssigkeitshandler verarbeitet wurden, niedrigere Lebensläufe haben als das manuelle Protokoll(Daten nicht gezeigt). Die Roboterplattform hat auch die Reproduzierbarkeit der Probenverarbeitung erheblich verbessert. Reproduzierbarkeit und Robustheit sind sehr wichtige Faktoren bei der Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben. Pipettierfehler können zu einer vollständigen Fehlinterpretation der Daten führen und hier sorgte die Roboterplattform für eine geringe Variation zwischen Denbeinern. Auch die Verwendung der Roboterplattform für cPILOT reduzierte die Zeit, die für die Probenvorbereitung benötigt wurde. Zum Beispiel, nach der Entwicklung der automatisierten Methode, benötigte es 2,5 h, um 22 Proben im Vergleich zu 7,5 h für manuelle cPILOT zu verarbeiten. In unserem Labor laufen Experimente, um Vergleiche der manuellen und automatisierten cPILOT-Workflows weiter zu bewerten. Basierend auf früheren Berichten aus unserem Labor lagen die CV%s der Proteinreporter-Ionenintensitäten im Handbuch cPILOT im Durchschnitt bei 20 %, wobei einige Ausreißer diesen Wert12überstiegen.
cPILOT ist eine chemische Derivatisierungsstrategie auf Peptidebene, die für jeden Probentyp wie Zellen, Gewebe und Körperflüssigkeiten verwendet werden kann. cPILOT bietet verbessertes Probenmultiplexing und kann mit der Integration von Automatisierung das Probenmultiplexing mit hohem Durchsatz in der Proteomik erleichtern. Dieser Durchsatz ist notwendig, um Krankheiten und biologisches Verständnis sowie die Entdeckung von Biomarkern weiter voranzutreiben.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen vanderbilt University Start-up Funds und NIH Award (R01GM117191) an RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
| 2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
| C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
| Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
| Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
| Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
| Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
References
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