Summary
Комбинированная изотопная маркировка прекурсоров и изобарическая маркировка (cPILOT) — это усовершенствованная стратегия мультиплексирования образцов, способная увеличить количество образцов, которые могут быть проанализированы одновременно с доступными изобарическими тегами. Включение роботизированной платформы значительно увеличило экспериментальную пропускную способность, воспроизводимость и количественную точность.
Abstract
Мы ввели высокую пропускную способность количественного рабочего процесса протеомика, комбинированные изотопной маркировки прекурсоров и изобаричной пометки (cPILOT), способные мультиплексирования до 22 или 24 образцов с тандемной массы метки или изобарик N,N-диметил лейцин изобарические метки, соответственно, в одном эксперименте. Это усовершенствование мультиплексирования образцов значительно сокращает время приобретения масс-спектрометрии и увеличивает полезность дорогих коммерческих изобаричных реагентов. Тем не менее, ручной процесс обработки образцов и трубопроводов шаги в стратегии может быть трудоемким, трудоемким, и ввести потери выборки и количественные ошибки. Эти ограничения можно преодолеть путем включения автоматизации. Здесь мы передали ручной протокол cPILOT автоматизированному устройству обработки жидкостей, которое может параллельно готовить большие выборочных номера (т.е. 96 образцов). В целом автоматизация повышает осуществимость и воспроизводимость cPILOT и позволяет широко использовать другие исследователи с сопоставимыми устройствами автоматизации.
Introduction
Масс-спектрометрия (MS) на основе протеомии является незаменимым инструментом исследования в выявлении конкретных биомаркеров заболевания, понимание прогрессирования заболевания, и создание приводит к терапевтическому развитию. Это может быть достигнуто из целого ряда связанных с болезнями клинических образцов, таких как сыворотка крови / плазма, проксимальные жидкости,и ткани 1,2. Открытие биомаркеров Proteomics и проверка в последнее время получили значительное внимание из-за мощности образца мультиплексированиястратегии 3,4. Пример мультиплексирования является методом, который позволяет одновременное сравнение и количественная оценка двух или более условий выборки в рамках одной инъекции MS5,6. Мультиплексирование образцов достигается путем штрихкодирования пептидов или белков из нескольких образцов с химическими, энзиматичными или метаболическими тегами и получения информации о MS из всех образцов в одном эксперименте MS или MS/MS. Среди доступных изобаричных тегов – изобаричные метки реагентов (iTRA), коммерческие тандемные метки массы (TMT), а в доме синтезированы изобарик N,N-dimethyl leucine (DiLeu) реагенты с возможностями до 16-plex7 и 21-plex8,соответственно.
Комбинированная изотопная маркировка прекурсоров и изобаричная маркировка (cPILOT) — это усовершенствованная технология мультиплексирования образцов. cPILOT сочетает в себе изотопную маркировку пептида N-термини со светом (CH3)2и тяжелым q(13C2H 3 )2- изотопами принизком рН (∼2,5), который сохраняет остатки лизина доступными для последующего высокого рН (8,5) изобарической маркировки с использованием TMT, DiLeu, или iTRA'пометки 3,9,10,11,12,13,14. Схема двойной маркировки стратегии cPILOT изображена на дополнительном рисунке 1 с двумя образцами с использованием пептида примера. Точность и точность количественной оценки на основе ТМТ на уровне MS2 могут быть скомпрометированы из-за наличия загрязняющих совместно изолированных и фрагментированных ионов, которые называются эффектом интерференции15. Это ограничение в неточных коэффициентах ионов репортера может быть преодолено с помощью трехбридных масс-спектрометров Orbitrap. Например, эффект интерференции можно преодолеть, изолировав пик в диметилированной паре на уровне MS1 в масс-спектрометре, подвергая свет или тяжелый пик фрагментации MS2 в линейной ионные ловушки, а затем подвергая наиболее интенсивный фрагмент MS2 для HCD-MS3 для получения количественной информации. Для того, чтобы увеличить шансы на выбор пептидов без лизина аминов, доступных для генерации ионов репортера, селективный MS3 приобретение на основе y-1 фрагмент также может быть использован и является подходом, который может привести к более высокий процент пептидов количественно с cPILOT9. Сочетание легкой и тяжелой маркировки увеличивает возможности мультиплексирования выборки в 2 раз, что достигается с помощью отдельных изобаричных тегов. Недавно мы использовали cPILOT для объединения до 24 образцов в одном эксперименте с реагентами DiLeu16. Кроме того cPILOT был использован для изучения окислительныхпост-переводческих модификаций 14 в том числебелка нитрат 17, другиеглобальные протеомы 9, и продемонстрировал применение через несколько образцов тканей в болезни Альцгеймера мышимодели 11.
Надежная подготовка образцов является важным шагом в эксперименте cPILOT и может быть трудоемкой, трудоемкой и обширной. Улучшенный мультиплексирование образцов требует обширного трубопроводного и высококвалифицированного лабораторного персонала, и есть несколько факторов, которые могут сильно повлиять на воспроизводимость эксперимента. Например, тщательная обработка образцов необходима для обеспечения аналогичного времени реакции для всех образцов и поддержания соответствующего буферного рН для легких и тяжелых диметилированных образцов. Кроме того, ручная подготовка десятков и сотен образцов может привести к высокой экспериментальной ошибке. Поэтому, чтобы уменьшить изменчивость подготовки выборки, повысить количественную точность и увеличить экспериментальную пропускную способность, мы разработали автоматизированный рабочий процесс cPILOT. Автоматизация достигается с помощью роботизированного жидкостного устройства обработки, которое может завершить многие аспекты рабочего процесса(рисунок 1). Подготовка образца от количественной оценки белка до маркировки пептидов проводилась на автоматизированном жидком обработчике. Автоматизированный жидкостный обработчик интегрирован с аппаратом положительного давления (PPA) для буферных обменов между твердоф фазаными пластинами извлечения (SPE), орбитальным шейкером и нагревательно-охлаждающим устройством. Роботизированная платформа содержит 28 палубных локаций для размещения пластин и буферов. Есть два стручка с захватом для передачи пластин в пределах палубы местах: 96-канал фиксированного объема трубы голову (5-1100 йл) и 8 каналов переменного объема зондов (1-1000 l). Роботизированная платформа управляется с помощью программного обеспечения. Пользователь должен быть профессионально обучен перед использованием роботизированного жидкого обработчика. Настоящее исследование посвящено автоматизации ручного рабочего процесса cPILOT, который может быть трудоемким для обработки более 12 образцов в одной партии. Для увеличения пропускной способности подхода11cPILOT мы передали протокол cPILOT роботизированному обработчику жидкости для параллельной обработки более 10 образцов. Автоматизация также позволяет проводить аналогичные реакции для каждой выборки параллельно на различных этапах процесса подготовки выборки, что требовало от высококвалифицированных пользователей достижения в ходе ручного cPILOT. Этот протокол фокусируется на внедрении автоматизированного устройства обработки жидкости для проведения cPILOT. Настоящее исследование описывает протокол использования этой автоматизированной системы и демонстрирует ее производительность с помощью 22-plex "доказательство концепции" анализ однородности печени мыши.
Protocol
Все протоколы животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Университете Питтсбурга. Одна мышь управления мужчиной (C57/BLJ) была приобретена на коммерческой основе и размещена в отделе лабораторных ресурсов животных в Университете Питтсбурга. Мышей кормили стандартными грызунами лаборатории чау-ад libitum и держали в 12 ч свет / темный цикл. Ткань печени была собрана и сохранена при 80 градусах Цельсия.
1. Извлечение белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги выполняются вручную.
- Вымойте печень мыши (100 мг) солевым раствором и гомогенатом с 500 л 8 М мочевины с помощью механического гомогенизатора с использованием лизерной матрицы А бусинки на 4 м/с на 20 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, протеазы или ингибиторы фосфатазы не были добавлены, но могут быть добавлены в буфер, если это необходимо, на основе эксперимента. Кроме того, шаги по извлечению белка могут быть соответствующим образом скорректированы для различных типов образцов. - Перенесите гомогенат ткани в новую микроцентрифугную трубку, промойте и объедините лизные трубки со 100-500 МКЛ PBS с 8 М мочевиной.
- Центрифуза гомогенизированных тканей (12800 х г, 4 КК, и 15 мин) и собирать супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные шаги выполняются на роботизированном жидком обработчике, доступном в лаборатории пользователя. Обработчик жидкости должен быть способен аспирировать и распределять буферы из и в типы указанных ANCI пластин, с минимальным участием оператора. - Определите концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с инструкциями производителя.
- Включите PPA, нагревательное/охлаждающее устройство, а также вакуумные насосы и соедините все аксессуары с жидким обработчиком. Обработчик жидкости показывает синий свет, как только он подключен к компьютеру и готов к работе.
- К реагентной пластине 1 (96 хорошо пластины), добавить 30 йл из 25 мМ 1,4-дитиотрейтол (DTT), 25 мМ 30 йл цистеина и 25 мМ 30 йл иодоацетамида (IAA) к строкам 1, 2 и 3, соответственно.
- Добавьте 8 м мочевины и 20 мМ Трис с 10 мМ CaCl2 (рН 8,2) к пластине резервуара. Добавьте 500 мкл 5% миновой кислоты в 2 мл глубокой пластины колодца, 20 мкл трипсина, чтобы грести 1 трипсиновой пластины и поместите в расположение палубы, как указано методом.
ПРИМЕЧАНИЕ: IAA и трипсин были добавлены в 96 хорошо пластины до добавления в образец. - Aliquot 300 МКЛ гомогената печени в трубку 500 МКЛ и место на 2 мл глубокой пластины хорошо и место при 4 градусов по Цельсию до начала протокола. Для этого эксперимента, 22 aliquots были созданы из одного гомогената печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте внутренний стандарт контроля качества (например, альфа-кейсин крупного рогатого скота или другой экзогенный белок) с соотношением 1 мкг стандарта: 100 мкг образца белка. - Определите объем буферов, которые будут добавлены в выборки по переменным именам и значениям в соответствии с таблицей 1. Основываясь на BCA, введите объем буфера выборки и нормализации (8 М мочевины) на электронной таблице и приложите к программному обеспечению(таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшее разбавление буфером может быть необходимо, если концентрация белка слишком высока. В результате концентрация образцов из ткани печени составила 10 мкг/л. Объем буферов был оптимизирован для 100 мкг белка. - Удалите пробные трубки из 4 градусов по Цельсию, поместите на указанную палубу расположение автоматизированного жидкого обработчика и дайте прогреться в течение 10 минут.
- Откройте метод и следуйте инструкциям, чтобы поместить необходимые советы (1070, 90 и 230 йл), и labware в нужных позициях. После того, как все labware и советы на месте, перекрестная проверка с окончательным макет палубы и нажмите Далее, чтобы продолжить протокол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Управляемая настройка информирует пользователя о необходимости добавления необходимого объема буфера в конкретную лабораторную программу в зависимости от протокола и местоположения колоды, которое необходимо сохранить.
2. Снижение выборки, алкилирование и пищеварение
- Загрузите 230 наконечников и аспират 90 МКЛ 8 М мочевины из резервуара и обойтись до строки 1 из черных 2 мл глубокой пластины хорошо. Разгрузите советы. Повторите этот шаг до тех пор, пока 8 М мочевины не будет добавлена ко всем скважинам, соответствующим 22 образцам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер денатурации раскручивает трехмерную структуру белка, чтобы дать первичную структуру, чтобы трипсин может эффективно действовать и ломать белок. 8-канная пипетка может аспирировать различные объемы для 8 каналов и может распределяться по разным местам в лабораторных условиях. На этом этапе все каналы аспирировали тот же объем, что и в программном обеспечении. - После добавления буфера денатурации загрузите 90 кончиков йл и аспирировать 10 МКЛ (соответствует 100 мкг) однородной печени мыши с помощью 8-канального пипетки к черной пластине глубиной 2 мл. Разгрузите советы. Повторите этот шаг до тех пор, пока не будут переданы все 22 образца.
- После каждой передачи, выполнить шаг смеси, чтобы аспирировать и обойтись 50 йл содержимого колодец трижды, чтобы обеспечить смешивание белка с буфером, чтобы показать соотношение 1:1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите образец стока гомогената и поместите в -80 градусов по Цельсию. - Чтобы уменьшить денатурированные белки, загрузите один ряд из 90 кончиков йл и аспират 3 йл DTT из реагентной пластины 1. Обойти DTT для строк 1 и 2 из черных 2 мл глубокой пластины хорошо и выгрузить советы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок: ДТТ моляр соотношение поддерживается в 1:40 для снижения дисульфидных связей. Расчет соотношения моляров основан на белковой массе крупного рогатого скота альбумин сыворотки (BSA), которая составляет 66,5 х 103 г/мол. - Печать образца пластины с алюминиевой фольгой и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на 600 с при 300 об/мин.
- Добавьте 30 МКЛ из 0,25 M IAM, чтобы грести 3 реагентной пластины 1 перед использованием и поместите на палубу. Распаветь образец пластины и вернуться на палубу.
ПРИМЕЧАНИЕ: IAM светочувствительным. - Загрузите один ряд из 90 кончиков йл, аспирировать 6 МКМ из реагентной пластины 1 в строке 3, и обойтись до строки 1 образца пластины. Разгрузите советы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок: IAM моляр соотношение поддерживается на 1:80 для каждого образца. Эта реакция должна быть сделана в темноте. - Печать образца пластины и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут при 300 об /мин на нагревательное / охлаждающее устройство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уплотнение пластины выполняется для предотвращения образца от света, испарения и разлива из колодец. - Распутать образец пластины и загрузить один ряд из 90 йл советы и аспирировать 5 йл цистеина из реагентной пластины 1 в строке 2. Выдать строки 1 и 2 образца пластины и выгрузить советы. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белок: L-цистеин моляр соотношение поддерживается в 1:40. - Поместите образец пластины на орбитальный шейкер для выполнения время встряхнуть 1800 об / мин в течение 30 мин.
- Добавьте 800 МКЛ буфера 20 мм Трис с 10 мМ CaCl2 (pH 8.2) к каждой колодец образца пластины, чтобы разбавить концентрацию мочевины до 2 М. Разгрузите кончики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин активность препятствует при более высоких концентрациях мочевины и, следовательно, она должна быть сокращена до менее чем 2 М. Это исследование было выполнено с белком трипсина молар соотношение 50: 1 для 14 ч. - Добавьте 20 йл трипсина в строку 1, колонку 1-12 из 96 пластины колодца и поместите в указанном месте на палубе.
- Загрузите один ряд из 90 кончиков йл, аспирировать 2 йл трипсина из трипсиновой пластины строки 1, и обойтись до строк 1 и 2 образца пластины. Разгрузите советы.
- Печать пластины и инкубировать в течение 14 ч при 37 градусов по Цельсию при 600 об /мин на нагревательное / охлаждающее устройство.
- После инкубации, распечатать образец пластины и добавить 5% formic кислоты строки 3, столб 1- 12 глубокой пластины сбора колодца и поместите его на указанной палубе.
- Остановите пищеварение, добавив 150 МКЛ 5% кремовой кислоты из строки 3 из пластины миновой кислоты и обойтись до образца пластины на строках 1 и 2. Разгрузите советы.
3. Десалирование шаг 1
- Desalt пептиды с пластиной SPE, содержащей 20 мг targa C-18 материала. Зафиксим громкость для каждого буферного обмена как 600 МЛ и зафиксим давление до 100 мбара.
- Загрузите 1070 наконечников и аспирировать 600 йл ацетонитрила и разгрузите до рядов 1 и 2 пластины SPE. Поместите пластину SPE на PPA и нанесите давление.
- Используя те же советы, аспирировать 600 йл ацетонитрила и обойтись до строк 1 и 2 пластины SPE. Поместите пластину SPE на PPA и нанесите давление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поток через может быть осушена в отходы с помощью всасывающего насоса. - Загрузите 1070 наконечников и аспират 600 МКЛ буфера А (100% воды в 0,1% кремовой кислоты) и разпределите до рядов 1 и 2 пластины SPE. Поместите пластину SPE на PPA и нанесите давление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем буфера не уменьшается значительно попробуйте увеличить давление или время. - Загрузите 2 ряда из 1070 наконечников, аспирировать 534 МКЛ переваренных образцов и раздать строкам 1 и 2 пластины SPE. Поместите пластину SPE на PPA и нанесите давление. Повторите этот шаг до тех пор, пока все образцы не будут загружены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку общий объем после добавления мякотью кислоты составит 1068 йл и образцы были добавлены в два прохода. - Загрузите 2 ряда использованных 1070 наконечников, аспирировать 600 МКЛ буфера А и раздать строкам 1 и 2 пластины SPE. Поместите пластину SPE на PPA и нанесите давление.
- Повторите выше шаг один раз, чтобы очистить образец.
- Загрузите 1 ряд из 1070 наконечников, аспирировать 600 МКЛ ACN: Вода (60:40) и обойтись до строк 1 и 2 пластины SPE. Поместите пластину SPE поверх пластины коллекции, чтобы утаить пептиды с помощью PPA и применить давление.
- Повторите выше шаг, чтобы elute пептиды в коллекции пластины. Высушите коллекционую пластину до сухости и храните при -80 градусов по Цельсию до дальнейшей обработки.
4. Диметиляционная маркировка (пептид N-термини)
- Поместите необходимые советы (1070, 90 и 230 МЛ), а также лабораторные программы в нужные позиции в программном обеспечении. После того, как все labware и советы на месте, перекрестная проверка с окончательным макет палубы и нажмите Далее, чтобы продолжить протокол.
- К реагентной пластине 2 добавьте 450 МКЛ из 1% уксусной кислоты, 50 йл светового формальдегида (CH2O), 50 мкл тяжелого формальдегида (13CD2O) и 150 мл формовой кислоты к рядам 1, 2, 3 и 4 соответственно.
- К реагентной пластине 3 добавить 50 МКЛ света CB, 50 МКЛ тяжелого ЦБ, к строкам 1 и 2 и 50 МКЛ аммиака в строку 3 и 4.
- Загрузите 2 ряда из 230 кончиков хл и аспират 100 йл 1% уксусной кислоты из ряда 1 реагентной пластины 2 и выполнить высушенные пептиды в образце пластины 2 (сбор пластины из десалирования шаг) строки 1 и 2 и выполнять время встряхивания в течение 5 минут при 1800 об/мин.
- Загрузите 90 наконечников и аспират 16 МКЛ из 60 мМ (4%) CH2O (37% wt/v) из строки 2 реагентной пластины 2 и обойтись до строки 1 образца пластины. Разгрузите советы.
- Загрузите 1 ряд из 90 наконечников и аспират 16 МКЛ 60 мМ (4%) 13 Лет CD2O (20% wt/v) из строки 3 реагентной пластины 2 и обойтись до строки 2 образца пластины. Разгрузите советы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании строка 1 соответствует свету, а строка 2 соответствует тяжелым диметилированным образцам (см. рисунок 1). - Загрузите 2 ряда из 90 наконечников и аспират 16 МКЛ из 24 мМ NaBH3CN и 24 мМ NaBD3CN из ряда 1 и 2 реагентной пластины 3 и выпределите до рядов 1 и 2, соответственно, образца пластины.
- Разгрузите кончики и выполните приурочных встряхивания в течение 15 минут при 1800 об/мин с помощью орбитального шейкера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление цыаноборогидрида натрия инициирует реакцию, следовательно, чтобы уменьшить изменчивость между экспериментами этот шаг выполняется один раз на партию. - Загрузите 2 ряда из 90 наконечников и аспират 32 МКЛ из 1% аммиака (28-30% v/v) из рядов 3 и 4 реагентной пластины 3 и выпределите до рядов 1 и 2 соответственно образца пластины 2. Разгрузите советы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление аммиака останавливает реакцию, следовательно, чтобы уменьшить изменчивость между экспериментами этот шаг выполняется один раз на партию. - Объедините равные объемы легких и тяжелых (1:1) диметилированных пептидов с новой пластиной глубиной 2 мл для дезавуирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании 90 МКЛ содержимого колодец из строки 1 было объединено с 90 йл строки 2 из образца пластины 2 на новый 2 мл пластины сбора (Образец плиты 3). Соотношение света: тяжелое смешивание зависит от экспериментального протокола, в данном исследовании было использовано соотношение 1:1. - Загрузите 2 ряда из 230 наконечников и аспират 32 МКЛ 5% кремовой кислоты к комбинированным образцам и выполните приурочили тряску на 30 с при 1800 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность диметиляции зависит от рН реакционной смеси, и любое изменение буферного рН приведет к неполной маркировке пептида N-термини. Эффективность диметриляции должна быть больше, чем 97% при поиске в качестве динамической модификации на пептид N-термини. В этом исследовании эффективность маркировки легких и тяжелых пептидов составила 99,7% и 99,5% соответственно.
5. Десалирование шаг 2
- Выполните опреснив образец, похожий на десалт шаг 1 для комбинированных образцов.
- Высушите образцы в пробной пластине, используя скоростной вакуум, и храните при -80 градусов по Цельсию до дальнейшей обработки.
6. Изобарические метки (остатки Lys)
- Следуйте управляемой установки лабораторных программ и разместить необходимые советы (1070, 90 и 230 йл), с соответствующими буферами. После того, как все labware и советы на месте, перекрестная проверка с окончательным макет палубы и нажмите Далее, чтобы продолжить протокол.
- Добавьте 250 МКЛ из 100 мМ триетиламина бикарбоната (TEAB), 30 МКЛ гидроксиламина (10% ж/в) в ряды 1 и 2 реагентной пластины 4. Поместите трубы TMT на 2 мл глубокой пластины в соответствии с таблицей в таблице 3.
- Храните пустую трубку 1,5 мл в трубке стойки для объединения помеченных пептидов. Поместите высушенную тарелку образца на P9 и TMT обработки пластины на P14.
- Чтобы восстановить пептиды, загрузите 230 кончиков МКЛ и аспирировать 100 МКЛ из 100 мМ триэтиламия бикарбоната (TEAB) буфер (рН 8,5) из строки 1 на пластине TEAB и обойтись до высушенных пептидов в строке 3 образца пластины 3. Поместите пластину на орбитальный шейкер на 30 с при 1800 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановить 100 мкг диметилированных пептидов в концентрации 1 мкг/йл. - Загрузите 90 кончиков ГЛ и аспират 10 ГЛ ацетонитриля ангидроуса из H12 пластины TMT и разпределите в каждую из высушенных трубок TMT.
- Удалите трубы TMT, вихрь, и быстро спина труб и вернуться на палубу в глубокой пластины хорошо.
- Загрузите 1 ряд из 90 наконечников и аспират 12,5 МКЛ комбинированных диметилированных пептидов и выпределите в ряд 1 перерабатывающей пластины TMT. Разгрузите советы.
ПРИМЕЧАНИЕ: TMT: пептид соотношение было сохранено на 1:8 для этого эксперимента. - Загрузите 1 ряд из 90 наконечников и аспирировать 10 МКЛ TMT и выпределите в ряд 1 из ТМТ вычислительной пластины. Разгрузите наконечники, выполните приустановить встряхивания в течение 1 часа при 1800 об/мин.
- Загрузите 1 ряд из 90 кончиков йл и аспират 8 йл гидроксиламина (10% ж / в) из строки 2 на пластине TEAB и обойтись до строки 1 из TMT обработки пластины. Разгрузите кончики, выполните приустановку встряхивания в течение 15 минут при 1800 об/мин.
- Объедините 30,5 мл помеченных ТМТ пептидов из перерабатывающей пластины ТМТ в трубку 1,5 мл. Разгрузите чаевые после каждой передачи.
- Удалите трубку с объединились образцы и сухой, чтобы испаряться ацетонитрил. Восстановить пептиды в 0,2 мл воды в 0,1% кремовой кислоты и вернуться на палубу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность маркировки изобаричной маркировки также специфична для рН, а эффективность маркировки должна быть выше 98% в соответствии с инструкциями производителя. В этом исследовании эффективность маркировки TMT лизина прекращено легких и тяжелых пептидов составил 99,4% и 99,5% соответственно.
7. Десалирование шаг
- Выполните опреснив образец, похожий на desalt 1 для одного образца.
- Высушите образцы и храните в -80 градусов по Цельсию до анализа.
8. Ликвидная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) и MS3
- Восстановить пептиды в воде класса MS с 0,1% FA для получения концентрации 1 мкг/ОЛ. Образцы фильтра с микроцентрифугами, содержащими фильтр 0,65 мкм. Центрифуга пептиды на 12000 х г в течение 3 минут и место потока через в авто-образец флакона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация пептида может быть подтверждена на данном этапе при желании. Пептиды должны быть восстановлены в воде класса LC-MS и подлежат анализу пептида BCA. В этом исследовании, пептид BCA анализ не был выполнен, и все пептидные количества были основаны на первоначальном анализе белка BCA. - Подготовка буферов мобильной фазы следующим образом: 100% (v/v) вода с 0,1% FA (A) и 100% ACN с 0,1% FA (B).
- Ввись 1 йл образца на столбец ловушки, упакованный с 2 см материала C18 (3 мкм, 100 й пор размер).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец очистки на ловушку заключается в следующем: 10 мин, 100% А; 2 мл/мин с использованием 2D жидкой хроматографии. - Запустите метод аналитического разделения. Используйте 100 мкм, то есть х 26 см лазер вытащил наконечник сплавленной кремния капиллярной колонке упакованы с C18 материала (2,5 мкм, 100 ). Градиент: 0-10 мин, 10% B; 10-30 мин,10-15% Б; 30-75 мин,15-30% Б; 75-88 мин,30-60% Б; 88-92 мин,60-90% Б; 92-99 мин., 90% Б; 99-100 мин,90-10% Б, 100-120 мин, 10% Б; 300 нл/мин, 120 мин.
- Запустите сбор данных для масс-спектрометра во время работы аналитического метода разделения.
- Используйте следующие параметры для сканирования обследования MS: 375-1500 м/з,разрешение 120 000, время цикла 3 с (максимальная скорость), автоматическое управление усилением (AGC) цель 4.0e5, максимальное время впрыска 50 мс.
- Используйте следующие параметры для CID-MS/MS с ионной ловушкой: сканирование данных зависимого приобретения (DDA) на результат, ширина изоляции 2 м/z, 35% нормализованная энергия столкновения (NCE), 0,25 активации q, 10 ms время активации, 1.0e4 AGC, 100 мс максимальное время впрыска.
- Используйте следующие параметры для HCD-MS3 SPS 10: Диапазон сканирования 100-400 м/з,количество зависимых сканирований 10, AGC 5.0e4, максимальное время впрыска 118 мс, энергия столкновения HCD 55%, MS2 изоляционные окна 2.
9. Анализ данных
- Поиск генерируемых RAW файлов для списка белков и пептидов с помощью программного обеспечения анализа белка против соответствующей базы данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: RAW файлы, созданные в этом исследовании были обысканы с помощью мыши Uniprot базы данных. - Поскольку в одном файле RAW есть как легкая, так и тяжелая маркировка, ищите каждый файл с двумя рабочими процессами для легких и тяжелых диметилированных пептидов.
- Поиск файлов RAW по базе данных мыши Uniprot (07/13/2019) с последовательностью 53035 со следующими параметрами: расщепление трипсина с максимум двумя пропущенными расщеплениями, пептид с минимальной длиной 6 аминокислот, 15 промилле родительской толерантности к массе, 1 Da фрагментации толерантности Статические модификации: свет диметилирования (No 28,031, пептид N-термин) или тяжелые диметиляции (No 36,076 Da, пептид N-термин), карбамидометил (No 57,021 Da, C), Динамические модификации: окисление (No15.995 Da, M), 11-plex изобаричный тег (229.163 Da, K), 1% FDR, репортер ион количественной оценки с 30 ppm пик интеграции толерантности, наиболее уверенно центроид для интеграционного метода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тяжелый dimethylated пик также включает в себя еще одну модификацию, которая является No 7 Da (No 35,069 Da, пептид N-терминуса) от света dimethylated пика и, следовательно, другой поисковый узел должен быть включен включить эту модификацию также. - Выполнить репортер ионной количественной оценки на основе интенсивности, 65% SPS массовое совпадение, среднее соотношение S / N 10, изотопная коррекция, нормализация и масштабирование не были выполнены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация и масштабирование могут быть выполнены на основе общего количества пептида или конкретного белка, добавленного в образец. Образцы КК также могут быть включены в каналы для межпраковой или внутрипартийной нормализации на основе двуххвостого внутреннего эталонногомасштабирования 18. Изотопные загрязнения различных каналов TMT не были предоставлены для поиска, пользователям рекомендуется добавить изотоп загрязнения различных ионов репортера.
Representative Results
На рисунке 2 показаны репрезентативные данные MS пептида, идентифицированные во всех 22 ионных каналах репортеров из 22-плексного эксперимента cPILOT, включая репликацию рабочего процесса. На рисунке 2 (вверху) изображена вдвойне заряженная пиковая пара, разделенная интервалом 4 Da m/z с указанием одной диметиловой группы, включенной в пептид. Легкие и тяжелые диметилированные пиковые пары были изолированы и фрагментированы независимо, чтобы дать последовательность пептида. Последовательность пептида G(диметил)ААЕЛМЗК (ТМТ-11плекс) и соответствует белку бетаин-гомоцистеин S-метилэстазы. Наиболее интенсивные ионы фрагментов как для легких, так и для тяжелых диметилированныхпиков (не показанных) были дополнительно изолированы для фрагментации MS3, а ионы репортеров(m/z 126-131) показаны на рисунке 2 (внизу). Ионные интенсивности репортера прямо пропорциональны изобилию пептидов в образце. Пептидное изобилие образцов подразумевает, что способность роботизированной платформы достаточно однородна в 22 образцах. В целом, этот 22-плексный эксперимент cPILOT привел к 1326 (1209-легкий/1181-тяжелый) белков идентификации в результате 3098 (6137-легкий/5872-тяжелый) пептиды (Таблица 4). Рисунок 3 показывает поле участок log10 изобилие по сравнению с общей интенсивности ионов репортера во всех 22 каналов, показывающих меньшие меж-хорошо / между образцами изменчивости. Оценка общей автоматизации была сделана путем изучения ошибки в изобилии ионов репортера по каждому белку в 22 образцах. На рисунке 4 показано, что обработка образцов с помощью роботизированной платформы привела к очень низким значениям резюме. В частности, по 3098 пептидов определены средние резюме в репортер ион изобилие было 12,36% и 15,03% для легких и тяжелых dimethylated пептидов, соответственно. Среди этих пептидов 2032 из этих пептидов был репортер ионный сигнал выше минимального порога и были признаны количественно.
Рисунок 1. Экспериментальный рабочий процесс для обработки 22 образцов параллельно с автоматизированным протоколом cPILOT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Количественная оценка пептидов в 22 образцах. Пример MS (вверху) и MS3 (внизу) спектра пептида G(диметил)ААЕЛМЗК (TMT-11plex) количественно в 22-plex автоматизированного эксперимента cPILOT для легкого диметилированного (внизу слева) и тяжелых dimethylated (внизу справа) пиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Коробка участок общего репортера ионных интенсивностей по сравнению с log10 обилие 22 образцов с использованием протеом первооткрыватель 2.3. Файл RAW дважды искал легкие и тяжелые пептиды, белки СВУ отдельно с TMT в качестве динамической модификации, свет (28,031 да) и тяжелый (36,076 евро и 35,069 да) диметиляция на пептид N-термини в качестве статической модификации. Комбинированный поиск со всеми вышеперечисленными модификациями был запущен с помощью Proteome Discover 2.3 для получения log 10 Обилие пептидной интенсивности по всем каналам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Скрипичные сюжеты соэфлитного вариации пептидного изобилия от суммированы репортерской ионные интенсивности по каналам 126-131 м/z. Пептид был количественно со средним значением CV 12,36 и 15,03 для света (2373) и тяжелых (2533) поддающихся количественной оценке пептидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1. Иллюстрация cPILOT с одним пептидом. Показаны изотопные маркировки двух различных образцов и изобарик пометки с TMT126, в результате смесь была введена в MS для LC-MS3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Переменное имя | Значение | Описание |
| DesaltSamp1 | 1065 | Объем, который будет использоваться для дезальты шаг 1 |
| DesaltSamp2 | 392 | Объем, который будет использоваться для дезальты шаг 2 |
| DesaltSamp3 | 100 | Объем, который будет использоваться для дезальты шаг 3 |
| Devmode | Ложных | Ложные сократит инкубацио время до 30sec- Правда будет следовать инкубации времени в протоколе. |
| DTTVol | 3 | Объем DTT |
| ФильтрПлате | Targa | Плита, используемая для дезавуирования |
| ФильтрПлатеВол | 600 | Объем для дезавуирования |
| HAWaterWashes | Ложных | Количество промывок воды на плите SPE |
| IAMVol | 2 | Объем иодоацетамида |
| ПептидTMTVol | 12.5 | Объем пептида для маркировки TMT |
| Давления | 100 | давление мбара в PPA |
| ТемпОффСет | 1 | Изменение температуры |
| ТМТВол | 10 | Исобарический объем тегов, который будет добавлен |
| ТрисВол | 800 | Объем для разбавления образца до пищеварения |
| ТрипсинВол | 2 | Объем трипсина |
| ИспользованиеPopTimer | Истинный | Правда отображает варианты для оказания давления на пластину, если это необходимо |
Таблица 1. Список переменных, используемых в автоматизированном протоколе CPILOT.
| ДилИсточник | ДилУэлл | Dest | DestWell | ДилВум | СтокИсточник | Стоквелл | ОбразецВол | ОбразецID |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 1 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 2 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 3 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 4 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 5 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 6 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 7 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 8 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 9 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 10 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 11 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | A12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 12 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 13 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 14 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 15 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 16 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 17 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 18 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 19 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 20 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 21 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 22 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 23 |
| 8M_Urea | 1 | Образцы | B12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 24 |
Таблица 2. Объем гомогената печени мыши и 8 М мочевины.
| ИсточникУэлл | ИсточникWell2 | Репортер Ион | DestWell1 | DestWell2 | Объем | ОбразецID |
| A1 | C1 | 126 | A1 | E1 | 10 | 1 |
| A3 | C3 | 127N | A2 | E2 | 10 | 2 |
| A5 | C5 | 127C | A3 | E3 | 10 | 3 |
| A7 | C7 | 128N | A4 | E4 | 10 | 4 |
| A9 | C9 | 128C | A5 | E5 | 10 | 5 |
| A11 | C11 | 129N | A6 | E6 | 10 | 6 |
| B2 | D2 | 129C | A7 | E7 | 10 | 7 |
| B4 | D4 | 130N | A8 | E8 | 10 | 8 |
| B6 | D6 | 130C | A9 | E9 | 10 | 9 |
| B8 | D8 | 131N | A10 | E10 | 10 | 10 |
| B10 | D10 | 131C | A11 | E11 | 10 | 11 |
Таблица 3. Общее количество пептидов, белков и пептидных спектральных совпадений (PSMs).
| Автоматизированный cPILOT | ||
| Свет | Тяжелых | |
| Белки | 1209 | 1181 |
| Пептиды | 6137 | 5872 |
| PSMs | 14948 | 16762 |
Таблица 4. Баркодирование изобарических тегов с легкими и тяжелыми маркированными образцами.
Discussion
cPILOT является усовершенствованная стратегия мультиплексирования, которая может анализировать до 24 образцов в одном эксперименте. Емкость мультиплексирования зависит от количества доступных изотопных и изобарических комбинаций меток. Внедрение TMTpro7, который способен помечать 16 образцов в одном эксперименте, может раздвинуть границы cPILOT до 32-plex. cPILOT состоит из нескольких шагов по трубе и требует тщательного ухода и навыков пользователя для выполнения подготовки образца. Даже с экспертом пользователя, ручные ошибки неизбежны, что предлагает использовать роботизированные платформы для обработки образцов в стратегии cPILOT. Так как cPILOT использует рН зависимых пометки пептидов, рН необходимо поддерживать для света и тяжелых dimethylated набор образцов. Мягко кисло-основной рН может привести к диметиляции как N-термини и лизина остатков. Преимущество cPILOT в том, что он требует только половины изобаричных тегов, так как пептид N-термини заняты диметил-группами. Это дает большее количество образцов, которые будут маркированы на половину стоимости. Обработка больших номеров выборки требует, чтобы время воздействия реагентов было аналогичным для первого и последнего образца в партии. Дозатор пипеток, который может вместить до 32 образцов параллельно, может быть лучше всего достигнут с помощью роботизированных жидкостных устройств обработки.
Для обработки нескольких образцов cPILOT в ручной рабочий процесс были внесены поправки, предусматривающие автоматизацию. Роботизированный жидкий обработчик, используемый в этом исследовании, имеет два стручка с 96-канальными и 8-канальными способностями трубоупожимить, с захватом, чтобы разместить пластины в доступных 28 местах палубы. Обработчик жидкости интегрирован с аппаратом положительного давления, орбитальным шейкером и устройством для нагрева/охлаждения образцов в пластине 96 хорошо. Аппарат положительного давления помогает выполнять буферные обмены в пластинах SPE во время очистки, в то время как орбитальный шейкер помогает вихрь / смешать образцы. Роботизированная платформа была запрограммирована на аспират и распределение буферов и образцов на 96-колодец пластин, инкубации, вихревых образцов и переносных пластин. Жидкости с различными вязкостями, такие как ацетонитрил и вода, требуют конкретных соображений трубопроводов, которые также могут быть запрограммированы в метод.
Рабочий процесс cPILOT, начиная от количественной оценки белка BCA и маркировки пептидов изобарических тегов (т.е. TMT), был выполнен в системе обработчика жидкостей. Полный протокол был масштабирован, чтобы использовать 96 глубоких пластин, которые могут в течение 2 мл на колодец. Буферы были подготовлены до начала эксперимента и добавлены к пластине 96, чтобы позволить параллельную обработку образца. В настоящем исследовании, 22 рабочих процессов репликации однородной печени мыши были добавлены в глубокие пластины хорошо и приняты через протокол cPILOT. Наконец, один образец, состоящий из 22-plex equimolar мыши печени помечены пептиды были введены в масс-спектрометр. Ионные интенсивности репортеров, соответствующие пептидным изобилиям в образцах, показали, что образцы, обработанные с помощью жидкого обработчика, имеют более низкие резюме, чем ручной протокол(данные не показаны). Роботизированная платформа также значительно улучшила воспроизводимость обработки образцов. Воспроизводимость и надежность являются очень важными факторами при обработке большого количества образцов. Ошибки трубопроводов могут привести к полной неправильной интерпретации данных, и здесь роботизированная платформа обеспечивает низкую меж образец вариации. Также использование роботизированной платформы для CPILOT сократило время, необходимое для подготовки образцов. Например, после разработки автоматизированного метода потребовалось 2,5 ч для обработки 22 образцов по сравнению с 7,5 ч для ручного cPILOT. В нашей лаборатории идут эксперименты по дальнейшей оценке сравнений ручных и автоматизированных рабочих процессов cPILOT. Основываясь на предыдущих отчетах из нашей лаборатории, CV%'s белка репортер ионных интенсивностей в ручной cPILOT были в среднем 20% с некоторыми выбросами превышает этозначение 12.
cPILOT является химической стратегией производной на пептидном уровне, которая может быть использована для любого типа образцов, таких как клетки, ткани и жидкости организма. cPILOT предлагает расширенный мультиплексирование образцов и с включением автоматизации может облегчить высокой пропускной способностью образца мультиплексирования в протеомии. Эта пропускная способность необходима для дальнейшего развития болезни и биологического понимания и открытия биомаркеров.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают стартовые фонды Университета Вандербильта и премию NIH (R01GM117191) RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
| 2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
| C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
| Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
| Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
| Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
| Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
References
- Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
- Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
- Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
- Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
- King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
- Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).
