Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Automatiseret prøve multiplexing ved hjælp af kombineret precursor isotop mærkning og isoobaric tagging (cPILOT)

Published: December 18, 2020 doi: 10.3791/61342
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Memory & Alzheimer's Center, Vanderbilt University Medical Center, 3Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University Medical Center, 4Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Kombineret prækursor isotop mærkning og isoobaric tagging (cPILOT) er en forbedret prøve multiplexing strategi, der er i stand til at øge antallet af prøver, der kan analyseres samtidig med tilgængelige isobaric tags. Inkorporering af en robotplatform har øget den eksperimentelle overførselshastighed, reproducerbarhed og kvantitative nøjagtighed betydeligt.

Abstract

Vi har indført en høj kapacitet kvantitative proteomics workflow, kombineret prækursor isotop mærkning og isobænsk tagging (cPILOT) i stand til multiplexing op til 22 eller 24 prøver med tandem masse tags eller isobaric N, N-dimethyl leucin isobaric tags, henholdsvis i et enkelt eksperiment. Denne forbedrede prøve multiplexing reducerer massespektrometri erhvervelse gange og øger nytten af de dyre kommercielle isoobaric reagenser. Den manuelle proces med prøvehåndterings- og pipetteringstrin i strategien kan dog være arbejdskrævende, tidskrævende og indføre prøvetab og kvantitative fejl. Disse begrænsninger kan overvindes ved at indarbejde automatisering. Her overførte vi den manuelle cPILOT-protokol til en automatiseret væskehåndteringsenhed, der kan tilberede store prøvenumre (dvs. 96 prøver) parallelt. Generelt øger automatisering gennemførligheden og reproducerbarheden af cPILOT og giver mulighed for bred brug af andre forskere med sammenlignelige automatiseringsenheder.

Introduction

Massespektrometri (MS)-baserede proteomics er et uundværligt forskningsredskab til at identificere sygdomsspecifikke biomarkører, forstå sygdomsprogression og skabe kundeemner til terapeutisk udvikling. Dette kan opnås fra en række sygdomsrelaterede kliniske prøver såsom blodserum/plasma, proksimale væsker og væv1,2. Proteomics biomarkør opdagelse og validering har for nylig fået betydelige overvejelser på grund af styrken af prøve multiplexing strategier3,4. Prøveud flerekspifikation er en teknik, der muliggør samtidig sammenligning og kvantificering af to eller flere prøvebetingelser inden for en enkeltMS-injektion 5,6. Prøve multiplexing opnås ved barcoding peptider eller proteiner fra flere prøver med kemiske, enzymatiske eller metaboliske tags og indhente MS oplysninger fra alle prøver i en enkelt MS eller MS / MS eksperiment. Blandt de tilgængelige isobaric tags er isobaric tagging reagenser (iTRAQ), kommercielle tandem masse tags (TMT), og i hus syntetiseret isobaric N, N-dimethyl leucin (DiLeu) reagenser med kapaciteter op til 16-plex7 og 21-plex8, hhv.

Kombineret prækursorisotopmærkning og isobaric tagging (cPILOT) er en forbedret prøve multiplexing teknologi. cPILOT kombinerer isotopmærkning af peptid N-termini med lys [−(CH3)2]og tung [−(13C2H3)2] isotoper ved lav pH (∼2.5), som holder lysinresterne til rådighed for efterfølgende høj pH(8.5) isobaric mærkning ved hjælp af TMT DiLeu eller iTRAQ-tagging3,9,10,11,12,13,14. CPILOT-strategiens dobbelte mærkningsordning er afbildet i supplerende figur 1 med to prøver ved hjælp af et eksempel peptid. Nøjagtigheden og præcisionen af den TMT-baserede kvantificering på MS2-niveau kan bringes i fare på grund af tilstedeværelsen af kontaminerende co-isolerede og co-fragmenterede ioner, der betegnes som interferenseffekten15. Denne begrænsning i unøjagtige reporter ion nøgletal kan overvindes ved hjælp af tribrid Orbitrap massespektrometre. For eksempel kan interferenseffekten overvindes ved at isolere en top i et dimethyleret par på MS1-niveauet i massespektrometeret, udsætte den lette eller tunge top for MS2-fragmentering i den lineære ionfælde og derefter udsætte det mest intense MS2-fragment for HCD-MS3 for at få kvantitative oplysninger. For at øge chancerne for at vælge peptider uden lysinaminer til rådighed for at generere reporterioner, en selektiv MS3 erhvervelse baseret på y-1 fragment også kan anvendes og er en tilgang, som kan resultere i en højere procentdel af peptider kvantificerbare med cPILOT9. Kombinationen af let og tung mærkning øger prøve multiplexing kapaciteter med en faktor på 2x til den, der opnås med individuelle isoobaric tags. Vi har for nylig brugt cPILOT til at kombinere op til 24 prøver i et enkelt eksperiment med DiLeu reagenser16. Derudover er cPILOT blevet anvendt til at studere oxidative post-translationelle modifikationer 14 , herunder proteinnitration17, andre globale proteomer9, og har demonstreret anvendelser på tværs af flere vævsprøver i en Musemodel11 forAlzheimers sygdom.

Robust prøveforberedelse er et kritisk trin i et cPILOT-eksperiment og kan være tidskrævende, besværligt og omfattende. Forbedret prøve multiplexing kræver omfattende pipettering og højt kvalificerede laboratoriepersonale, og der er flere faktorer, der kan stærkt påvirke reproducerbarheden af eksperimentet. F.eks. er omhyggelig håndtering af prøver nødvendig for at sikre lignende reaktionstider for alle prøver og for at opretholde passende bufferpH for lette og tunge dimethylerede prøver. Desuden kan manuel forberedelse af snesevis til hundredvis af prøver medføre en høj eksperimentel fejl. For at reducere variationen i prøveforberedelse, forbedre den kvantitative nøjagtighed og øge den eksperimentelle gennemløb har vi derfor udviklet en automatiseret cPILOT-arbejdsgang. Automatisering opnås ved hjælp af en robot væskehåndteringsenhed, der kan fuldføre mange aspekter af arbejdsprocessen (Figur 1). Prøvepræparatet fra proteinant kvantificering til peptidmærkning blev udført på en automatiseret væskehandler. Den automatiserede væskebehandler er integreret med et PPA (positivetryk) til bufferudvekslinger mellem spe-pladerne (solid phase extraction), orbitalshasker og en varme-/køleanordning. Robotplatformen indeholder 28 dækslokationer, der passer til plader og buffere. Der er to bælg med en griber til at overføre pladerne inden for dækket steder: en 96-kanals fast volumen pipettering hoved (5-1100 μL) og 8 kanal variabel volumen sonder (1-1000 μL). Robotplatformen styres ved hjælp af en software. Brugeren skal trænes professionelt, før der anvendes robotvæskebehandleren. Denne undersøgelse fokuserer på automatisering af den manuelle cPILOT arbejdsgang, som kan være arbejdskrævende til behandling af mere end 12 prøver i et enkelt parti. For at øge gennemløbet af cPILOT approach11overførte vi cPILOT-protokollen til en robotvæskebehandler for at behandle mere end 10 prøver parallelt. Automatiseringen giver også mulighed for lignende reaktioner for hver prøve parallelt under forskellige trin i prøveforberedelsesprocessen, hvilket krævede, at højtuddannede brugere kunne opnå under manuel cPILOT. Denne protokol fokuserer på implementering af den automatiserede væskehåndteringsenhed til udførelse af cPILOT. Denne undersøgelse beskriver protokollen for brug af dette automatiserede system og demonstrerer dens ydeevne ved hjælp af en 22-plex "proof-of-concept" analyse af muselever homogenater.

Protocol

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -anvendelse ved University of Pittsburgh. En mandlig kontrol mus (C57/BLJ) blev købt kommercielt og anbragt i Division of Laboratory Animal Resources ved University of Pittsburgh. Mus blev fodret standard gnaver laboratorium chow ad libitum og holdes i en 12 h lys / mørk cyklus. Levervæv blev høstet og opbevaret ved −80 °C.

1. Proteinekstraktion

BEMÆRK: Disse trin udføres manuelt.

  1. Muselever (100 mg) vaskes med saltvand og homogeniseres med 500 μL 8 M urinstof ved hjælp af en mekanisk homogenisator ved hjælp af lysingmatrix A perler i 4 m/s i 20 s.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev protease- eller fosfatasehæmmere ikke tilsat, men kan om nødvendigt føjes til bufferen baseret på forsøget. Også, protein ekstraktion skridt kan justeres i overensstemmelse hermed for forskellige prøvetyper.
  2. Vævshomogenat overføres til et nyt mikrocentrifugerør, skylles og kombineres lysrørene med 100-500 μL PBS med 8 M urinstof.
  3. Centrifuge det homogeniserede væv (12.800 x g,4 °C og 15 min) og opsaml supernatanten.
    BEMÆRK: Resten af trinene udføres på den robotvæskebehandler, der er tilgængelig i brugerens laboratorium. Væskebehandleren skal kunne indsugnings- og dispenserepude fra og til ANCI-specificerede pladetyper med minimal deltagelse af operatøren.
  4. Proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af en bicinoninsyreanalyse (BCA) i henhold til producentens anvisninger.
  5. Tænd for elkøbsaftalen, varme-/køleapparatet og vakuumpumperne, og tilslut alt tilbehør med væskebehandler. Væskebehandleren viser et blåt lys, når den er tilsluttet computeren og klar til brug.
  6. Til reagensplade 1 (96 brøndplade) tilsættes 30 μL på 25 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL cystein og 25 mM 30 μL iodoacetamid (IAS) til henholdsvis række 1, 2 og 3.
  7. Der tilsættes 8 M urinstof og 20 mM Tris med 10 mM CaCl2 (pH 8.2) til en reservoirplade. Der tilsættes 500 μL 5 % myresyre til 2 ml dyb brøndplade, 20 μL trypsin til række 1 af trypsinpladen og placer på dækplaceringen som angivet ved metoden.
    BEMÆRK: IAA og trypsin blev tilføjet til 96 brøndpladen, før der blev tilføjet til prøven.
  8. Aliquot 300 μL af leveren homogeniseres i et 500 μL rør og anbringes på en 2 ml dyb brøndplade og anbringes ved 4 °C indtil protokollens begyndelse. Til dette eksperiment blev der genereret 22 aliquots fra enkeltlever homogenate.
    BEMÆRK: Der tilsættes en intern kvalitetskontrolstandard (f.eks. alfaepiks eller andet eksogent protein) med forholdet 1 μg standard: 100 μg proteinprøve.
  9. Definer mængden af buffere, der skal føjes til stikprøverne, efter variabelnavne og værdi pr. tabel 1. Baseret på BCA skal du indtaste mængden af prøve- og normaliseringsbuffer (8 M urinstof) på et regneark og vedhæfte til softwaren (tabel 2).
    BEMÆRK: Yderligere fortynding med buffer kan være nødvendig, hvis proteinkoncentrationen er for høj. De resulterende koncentrationer for prøve fra levervævet var 10 μg/μL. Mængden af buffere blev optimeret til 100 μg protein.
  10. Prøverørene fjernes fra 4 °C, anbringes på den automatiske væskehandlers angivne dæks placering, og varm i 10 minutter.
  11. Åbn metoden, og følg vejledningen for at placere de nødvendige spidser (1070, 90 og 230 μL) og labware i de ønskede positioner. Når alle labware og tips er på plads, krydstjek med den endelige dæk layout og klik på Næste for at fortsætte protokollen.
    BEMÆRK: Den guidede opsætning informerer brugeren om at tilføje en påkrævet mængde buffer til det specifikke labware afhængigt af protokollen og den dækplacering, der skal bevares.

2. Prøvereduktion, alkylering og fordøjelse

  1. 230 μL spidser og aspirere 90 μL 8 M urinstof fra beholderen og dispenseres til række 1 af den sorte 2 ml dybe brøndplade. Aflæs spidserne. Dette trin gentages, indtil der tilsættes 8 M urinstof til alle de brønde, der svarer til de 22 prøver.
    BEMÆRK: Denatureringsbufferen afvikler proteinets tredimensionelle struktur for at give den primære struktur, så trypsinen kan handle og bryde proteinet effektivt. Den 8-kanals pipette kan aspirere forskellige mængder for de 8 kanaler og kan dispensere til forskellige steder i labware. I dette trin alle kanaler indsugning den samme volumen som defineret i softwaren.
  2. Efter tilsætning af denatureringsbufferen skal de 90 μL-spidser og aspirere 10 μL (svarer til 100 μg) muselever homogenat ved hjælp af 8-kanals pipetten til den sorte 2 ml dybe brøndplade. Aflæs spidserne. Gentag dette trin, indtil alle 22 prøver er overført.
  3. Efter hver overførsel udføres et blandingstrin for at aspirere og afsende 50 μL af brøndindholdet tre gange for at sikre blanding af proteinet med bufferen for at udvise et 1:1-forhold.
    BEMÆRK: Bestanden homogenatprøven fjernes, og den anbringes i -80 °C.
  4. For at reducere de denaturerede proteiner skal der indlæses en række 90 μL spidser og aspirere 3 μL DTT fra reagenspladen 1. Dispenser DTT til række 1 og 2 af den sorte 2 ml dybe brøndplade og aflæs spidserne.
    BEMÆRK: Proteinet: DTT molar ratio opretholdes på 1:40 for reduktion af disulfid obligationer. Beregningen af molarforholdet er baseret på proteinmassen af kvægserumalbumin (BSA), som er 66,5 x 103 g/mol.
  5. Prøvepladen forsegles med aluminiumsfolie og inkuberes ved 37 °C i 600 s ved 300 omdrejninger i minuttet.
  6. Der tilsættes 30 μL 0,25 M IAM til række 3 reagensplade 1 lige før brug og læg den på dækket. Tag prøvepladen afse og vend tilbage til dækket.
    BEMÆRK: IAM er lysfølsom.
  7. Der indbelæses en række med 90 μL spidser, der aspirere 6 μL IAM fra reagenspladen 1 ved række 3, og der dispenseres til række 1 på prøvepladen. Aflæs spidserne.
    BEMÆRK: Proteinet: IAM-molarforholdet holdes på 1:80 for hver prøve. Denne reaktion skal ske i mørke.
  8. Prøvepladen forsegles og inkuberes ved 4 °C i 30 min. ved 300 omdr./min. på varme-/køleanordningen.
    BEMÆRK: Forsegling af pladen udføres for at forhindre prøven i at lyse, fordampe og spilde fra brønden.
  9. Prøvepladen skal åbnes, og der indbelægges en række på 90 μL spidser, og der aspirere 5 μL cystein fra reagenspladen 1 ved række 2. Dispenseres til række 1 og 2 af prøvepladen og aflæsse spidserne. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
    BEMÆRK: Proteinet: L-cysteintandforhold opretholdes kl.
  10. Anlæer prøvepladen på orbitalshakeren for at udføre en tidsspærret rystelse på 1800 omdrejninger i minuttet i 30 min.
  11. Der tilsættes 800 μL 20 mM Tris-buffer med 10 mM CaCl2 (pH 8.2) til hver brønd på prøvepladen for at fortynde urinstofkoncentrationen til 2 M. Losse spidserne.
    BEMÆRK: Trypsin aktivitet hindres ved højere urinstof koncentrationer og dermed det skal reduceres til mindre end 2 M. Denne undersøgelse blev udført med et protein til trypsin molar forholdet på 50: 1 for 14 timer.
  12. Der tilsættes 20 μL trypsin til række 1, kolonne 1-12 af en 96 brøndplade og placer på et bestemt sted på dækket.
  13. Der indlæses en række med 90 μL spidser, aspirere 2 μL trypsin fra trypsinpladerækken 1, og der dispenseres til række 1 og 2 i prøvepladen. Aflæs spidserne.
  14. Pladen og inkuber i 14 timer ved 37 °C ved 600 omdrejninger i minuttet på varme-/køleanordningen.
  15. Efter inkubationen skal prøvepladen ikke åbnes, og der tilsættes 5 % myresyre til række 3, kolonne 1- 12 på en dyb brøndopsamlingsplade, og den anbringes på det angivne dæk.
  16. Fordøjelsen standses ved at tilsætte 150 μL 5 % myresyre fra række 3 i myresyrepladen, og der dispenseres til prøvepladen i række 1 og 2. Aflæs spidserne.

3. Afsaltningstrin 1

  1. Afsalt pepderne med SPE plade indeholdende 20 mg Targa C-18 materiale. Fastgør lydstyrken for hver bufferudbytte som 600 μL, og fastgør trykket til 100 mbar.
  2. 1070 μL spidser og aspirere 600 μL acetonitril og dispenseres til række 1 og 2 af SPE plade. Anvend SPE-pladen på elkøbsaftalen, og tryk.
  3. Ved hjælp af de samme spidser aspirere 600 μL acetonitril og dispenseres til række 1 og 2 af SPE plade. Anvend SPE-pladen på elkøbsaftalen, og tryk.
    BEMÆRK: Gennemstrømningen kan drænes til affald ved hjælp af en sugepumpe.
  4. 1070 μL spidser og aspirere 600 μL buffer A (100 % vand i 0,1 % myresyre) og der dispenseres til række 1 og 2 af SPE-pladen. Anvend SPE-pladen på elkøbsaftalen, og tryk.
    BEMÆRK: Hvis bufferens volumen ikke reducerer betydeligt, skal du prøve at øge trykket eller tiden.
  5. 2 rækker med 1070 μL spidser, aspirere 534 μL fordøje prøver, og dispenseres til række 1 og 2 af SPE plade. Anvend SPE-pladen på elkøbsaftalen, og tryk. Gentag dette trin, indtil alle prøverne er indlæst.
    BEMÆRK: Da det samlede volumen efter tilsætning af myresyre vil være 1068 μL, og prøverne blev tilføjet i to gennemløb.
  6. Der indlæses 2 rækker med brugte 1070 μL spidser, aspirere 600 μL buffer A, og der dispenseres til række 1 og 2 af SPE-pladen. Anvend SPE-pladen på elkøbsaftalen, og tryk.
  7. Gentag ovenstående trin én gang for at rense prøven.
  8. 1 række med 1070 μL spidser, aspirere 600 μL ACN: Vand (60:40) og dispenseres til række 1 og 2 af SPE-pladen. Anvend SPE-pladen oven på en opsamlingsplade for at elutere peptiderne ved hjælp af elkøber og tryk.
  9. Gentag ovenstående trin for at fremkalde peptiderne i opsamlingspladen. Opsamlingspladen tørres af og opbevares ved -80°C indtil videre forarbejdning.

4. Mærkning af dimethylering (peptid N-termini)

  1. Ansluder de nødvendige spidser (1070, 90 og 230 μL), og labware i de ønskede positioner i softwaren. Når alle labware og tips er på plads, krydstjek med den endelige dæk layout og klik på Næste for at fortsætte protokollen.
  2. Til reagensplade 2 tilsættes 450 μL 1% eddikesyre, 50 μL let formaldehyd (CH2O), 50 μL tung formaldehyd (13CD2O) og 150 μL myresyre i henholdsvis række 1, 2, 3 og 4.
  3. For reagensplade 3 tilsættes 50 μL let CB, 50 μL tung CB, til række 1 og 2 og 50 μL ammoniak til række 3 og 4.
  4. 2 rækker med 230 μL spidser og aspirere 100 μL 1% eddikesyre fra række 1 af reagensplade 2, og dispenseres til de tørrede peptider i prøveplade 2 (opsamlingsplade fra afsaltningstrinnet) række 1 og 2 og udføre en tidsindrykning i 5 min.
  5. Belastning 90 μL spidser og aspirere 16 μL på 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) fra række 2 af reagensplade 2 og dispenseres til række 1 på prøvepladen. Aflæs spidserne.
  6. Belastning 1 række med 90 μL spidser og aspirere 16 μL på 60 mM (4%) kr. CD2O (20% wt/v) fra række 3 i reagensplade 2 og dispenseres til række 2 på prøvepladen. Aflæs spidserne.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse svarer række 1 til lys, og række 2 svarer til tunge dimethylerede prøver (se figur 1).
  7. 2 rækker med 90 μL spidser og aspirere 16 μL på henholdsvis 24 mM NaBH3KN og 24 mM NaBD3CN fra række 1 og 2 af reagensplade 3 og afsendes til henholdsvis række 1 og 2 af prøvepladen.
  8. Aflæs spidserne og udføre en tidsspærret ryste i 15 min ved 1800 rpm ved hjælp af orbital shaker.
    BEMÆRK: Tilsætning af natriumcyanoborohydrid initierer reaktionen, og dermed reducere variabilitet mellem eksperimenter udføres dette trin én gang pr. batch.
  9. 2 rækker med 90 μL spidser og aspirere 32 μL 1 % ammoniak (~28-30 % v/v) fra række 3 og 4 reagensplade 3 og dispenseres til henholdsvis række 1 og 2 af prøvepladen 2. Aflæs spidserne.
    BEMÆRK: Tilføjelse af ammoniak stopper reaktionen dermed for at reducere variabiliteten mellem eksperimenter dette trin udføres én gang pr. batch.
  10. Kombiner lige store mængder lette og tunge (1:1) dimethylerede peptider til en ny 2 ml dyb brøndplade til afsaltning.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 90 μL af brøndindholdet fra række 1 kombineret med 90 μL række 2 fra prøveplade 2 til en ny 2 ml opsamlingsplade (prøveplade 3). Forholdet mellem lys: kraftig blanding afhænger af den eksperimentelle protokol, i denne undersøgelse blev der anvendt et 1:1-forhold.
  11. 2 rækker med 230 μL spidser og aspirere 32 μL 5 % myresyre til de kombinerede prøver, og der udføres en tidsindt omrystning i 30 s ved 1800 o/min.
    BEMÆRK: Dimethylationseffektiviteten afhænger af reaktionsblandingens pH-værdi, og enhver ændring i bufferpH vil resultere i ufuldstændig mærkning af peptidet N-termini. Dimethylering effektivitet bør være større end 97%, når der søges som dynamisk modifikation på peptid N-termini. I denne undersøgelse var mærkningseffektiviteten af lette og tunge peptider henholdsvis 99,7 % og 99,5 %.

5. Afsaltningstrin 2

  1. Prøveudsalkning, der svarer til afsaltningstrin 1 for de kombinerede prøver, udførs.
  2. Prøverne tørres i prøvepladen med en hastighedsvac og opbevares ved -80 °C indtil videre forarbejdning.

6. Isobaric mærkning (Lys rester)

  1. Følg den guidede labware opsætning og placere de nødvendige tips (1070, 90 og 230 μL), med passende buffere. Når alle labware og tips er på plads, krydstjek med den endelige dæk layout og klik på Næste for at fortsætte protokollen.
  2. Der tilsættes 250 μL 100 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB), 30 μL hydroxylamin (10% w/v) til række 1 og 2 reagensplade 4. TMT-rørene anbringes på den 2 ml dybsænseplade pr. regneark i tabel 3.
  3. Hold et tomt 1,5 ml rør i en rørholder til gruppering af de mærkede peptider. Den tørrede prøveplade anbringes ved P9- og TMT-forarbejdningspladen ved P14.
  4. Peptiderne skal rekonstitueres ved at lægge 230 μL-spidser og aspirere 100 μL 100 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB) buffer (pH ~8.5) fra række 1 ved TEAB-plade og dispenseres til de tørrede peptider ved række 3 i prøvepladen 3. Placer pladen på orbital shaker i 30 s på 1800 rpm.
    BEMÆRK: Rekonstituere 100 μg dimethylerede peptider i en koncentration på 1 μg/μL.
  5. 90 μL spidser og aspirere 10 μL vandfri acetonitril fra H12 fra TMT-pladens H12, og de af dem læsses af i hvert af de tørrede TMT-rør.
  6. Fjern TMT rør, vortex, og hurtig spin rørene og vende tilbage til dækket i dyb brønd plade.
  7. 1 række med 90 μL spidser og aspirere 12,5 μL af de kombinerede dimethylerede peptider, og der dispenseres til rækken 1 i TMT-behandlingspladen. Aflæs spidserne.
    BEMÆRK: TMT: peptidforholdet blev fastholdt på 1:8 for dette eksperiment.
  8. 1 række med 90 μL spidser og aspirere 10 μL TMT, og der dispenseres til tmt-behandlingspladens række 1. Fjern spidserne, udfør en tidsshakes i 1 time ved 1800 omdrejninger i minuttet.
  9. 1 række med 90 μL spidser og aspirere 8 μL hydroxylamin (10% w/v) fra række 2 ved TEAB-pladen, og der dispenseres til række 1 i TMT-behandlingspladen. Fjern spidserne, udføre en timet ryster i 15 min ved 1800 rpm.
  10. Kombiner 30,5 μL af TMT-mærkede peptider fra TMT-behandlingspladen til 1,5 ml rør. Fjern spidserne efter hver overførsel.
  11. Fjern røret med de samlede prøver og tør for at fordampe acetonitrilen. Rekonstituer peptider i 0,2 ml vand i 0,1 % myresyre og vende tilbage til dækket.
    BEMÆRK: Mærkningseffektiviteten af isoobaric mærkning er også pH-specifik, og mærkningseffektiviteten bør være over 98 % pr. producentens anvisninger. I denne undersøgelse TMT mærkning effektivitet lysin afsluttet lys og tunge peptider var 99,4% og 99,5% hhv.

7. Afsaltningstrin

  1. Udfør prøve afsaltning svarende til afsalt 1 for en prøve.
  2. Prøverne tørres, og de opbevares i -80 °C, indtil de analyseres.

8. Flydende kromatografi–Tandem Massespektrometri (LC-MS/MS) og MS3

  1. Genkonstituer peptiderne i MS-vand med 0,1% FA for at opnå ~1 μg/μL koncentration. Filterprøver med mikrocentrifugerør indeholdende et filter på 0,65 μm. Centrifuge peptider ved 12.000 x g i 3 min og placere strømmen igennem i en auto-sampler hætteglas.
    BEMÆRK: Peptidkoncentrationen kan bekræftes på nuværende tidspunkt, hvis det ønskes. Peptiderne skal rekonstitueres i vand af LC-MS-kvalitet og underkastes en BCA-peptidanalyse. I denne undersøgelse blev peptidet BCA-analyse ikke udført, og alle peptidmængder var baseret på første protein BCA-analyse.
  2. Forbered de mobile fasebuffere på følgende måde: 100 % (v/v) vand med 0,1 % FA (A) og 100 % ACN med 0,1 % FA (B).
  3. Prøven indsprøjtes 1 μL på en fældesøjle, der er pakket med 2 cm C18-materiale (3 μm, 100 Å porestørrelse).
    BEMÆRK: Prøverengøring på fælden er som følger: 10 min, 100% A; 2 μL/min. ved hjælp af et 2D flydende kromatografisystem.
  4. Kør den analytiske separationsmetode. Brug en 100 μm i.d. x 26 cm lasertrukket spids smeltet silica kapillær søjle pakket med C18 materiale (2,5 μm, 100 Å). Gradienten er: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min.
  5. Kør dataindsamlingen for massespektrometeret, mens den analytiske separationsmetode kører.
    1. Brug følgende parametre til MS-undersøgelsesscanningen: 375-1.500 m/z,120.000 opløsning, cyklustid 3 s (tophastighed), automatisk forstærkningskontrol (AGC) mål 4.0e5, maksimal injektionstid 50 ms.
    2. Brug følgende parametre for CID-MS/MS med ionfælde: DDA-scanninger (data dependent acquisition) pr. resultat, 2 m/z isolationsbredde, 35 % normaliseret kollisionsenergi (NCE), 0,25 aktiveringstid, 10 ms aktiveringstid, 1,0e4 AGC, 100 ms maksimal injektionstid.
    3. Brug følgende parametre for HCD-MS3 SPS 10: Scanområde 100-400 m/z, antal afhængige scanninger 10, AGC 5.0e4, maksimal injektionstid 118 ms, HCD kollisionsenergi 55%, MS2 isolationsvindue 2.

9. Dataanalyse

  1. Søg genererede RAW-filer til listen over proteiner og peptider ved hjælp af en proteinanalysesoftware mod en passende database.
    BEMÆRK: DE RAW-filer, der blev genereret i denne undersøgelse, blev søgt mod en Uniprot-mus-database.
  2. Da der er både let og tung mærkning i en RAW-fil, søge hver fil med to arbejdsgange for lette og tunge dimethylerede peptider.
  3. Søg i RAW-filerne mod Mouse Uniprot-databasen (07-13-2019) med 53035-sekvens med følgende parametre: trypsin spaltning med højst to mistede spaltninger, peptid med minimum 6 aminosyrer længde, 15 ppm forælder masse tolerance, 1 Da fragmentering tolerance Statiske ændringer: lys dimethylering (+28.031, peptid N-terminus) eller kraftig dimethylering (+36.076 Da, peptid N-terminus), carbamidomethyl (+57.021 Da, C), Dynamiske ændringer: oxidation (+15.995 Da, M), 11-plex isobaric tag (229.163 Da, K), 1% FDR, reporter ion kvantificering med 30 ppm peak integration tolerance, mest selvsikre centroid for integration metode.
    BEMÆRK: Den tunge dimethylerede top omfatter også en anden ændring, som er ~ 7 Da (+35.069 Da, peptid N-terminus) fra den lette dimethylerede top og derfor en anden søgning node bør indarbejdes til at omfatte denne ændring også.
  4. Udfør reporter ion kvantificering baseret på intensiteten, 65% SPS masse match, gennemsnitlige S / N forhold 10, isotop korrektion, normalisering og skalering blev ikke udført.
    BEMÆRK: Normalisering og skalering kan udføres på basis af den samlede peptid eller et bestemt protein, der tilsættes prøven. QC-prøver kan også indgå i kanalerne til normalisering mellem partier eller batcher baseret på en tosidet internreferenceskalering 18. Isotopforureningen af forskellige TMT-kanaler blev ikke givet til søgningen, brugere rådes til at tilføje isotopforurening af forskellige reporterioner.

Representative Results

Figur 2 viser repræsentative MS-data for et peptid identificeret i alle 22 reporterionkanaler fra et 22-plex cPILOT-eksperiment, herunder workflow-replikater. Figur 2 (øverst) viser et dobbelt ladet toppar adskilt af 4 Da m/z-afstand, der angiver en enkelt dimethylgruppe, der er indbygget i peptidet. De lette og tunge dimethylerede peak par blev isoleret og fragmenteret uafhængigt for at give sekvensen af peptidet. Peptidets sekvens er G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) og svarer til proteinet Betaine-homocystein S-methyl transferase. De mest intense fragmentioner for både lette og tunge dimethylerede toppe (ikke vist) blev yderligere isoleret for MS3-fragmentering, og reporterionionerne (m/z 126-131) er vist i figur 2 (nederst). Reporterionintensiteterne står i direkte forhold til peptidtætheden i prøven. Peptid overflod af prøverne indebærer pipettering evne robot platform er temmelig ensartet på tværs af de 22 prøver. Samlet resulterede dette 22-plex cPILOT-eksperiment i 1326 (1209-let/1181-tunge) proteiner fra 3098 (6137-let/5872-tunge) peptider (Tabel 4). Figur 3 viser kasseplottet log10-forekomst i forhold til de samlede reporterionintensiteter på tværs af alle de 22 kanaler, der viser mindre variation mellem godt og mellemprøven. Evalueringen af den samlede automatisering blev udført ved at undersøge fejlen i reporter iontæthed på tværs af hvert protein i de 22 prøver. Figur 4 viser, at prøvebehandling med robotplatformen resulterede i meget lave CV-værdier. Specifikt var det gennemsnitlige CV i reporteriontæthed 12,36 % og 15,03 % for henholdsvis lette og tunge dimethylerede peptider på cv'et i forhold til 3098. Blandt disse peptider havde 2032 af disse peptider reporter ionsignal over minimumsgrænsen og blev anset for kvantificerbare.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentel arbejdsgang til behandling af 22 prøver parallelt med en automatiseret cPILOT-protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Kvantificering af peptider på tværs af 22 prøver. Eksempel MS (top) og MS3 (bund) spektre af peptid G (dimethyl)AAELMQQK (TMT-11plex) kvantificeret i 22-plex automatiseret cPILOT eksperiment for lys dimethyleret (nederst til venstre) og tunge dimethylerede (nederst til højre) toppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Box plot af samlede reporter ion intensiteter versus log10 overflod af 22 prøver ved hjælp af proteome discoverer 2,3. RAW-filen blev søgt to gange efter lette og tunge peptider, proteiner id'er separat med TMT som dynamisk modifikation, lys (+28.031 Da) og tunge (+36.076 & +35.069 Da) dimethylation ved peptid N-termini som statisk modifikation. En kombineret søgning med alle de ovennævnte ændringer blev kørt ved hjælp af Proteome Discover 2,3 for at opnå Log 10 Abundance af peptid intensiteter på tværs af alle kanaler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Violin plots af co-effektiv variation af peptid overflod fra summede reporter ion intensiteter på tværs af kanaler 126-131 m / z. Peptidet blev kvantificeret med en gennemsnitlig CV-værdi på 12,36 og 15,03 for lette (2373) og tunge (2533) kvantificerbare peptider. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Illustration af cPILOT med et enkelt peptid. Den resulterende blanding blev injiceret til MS for LC-MS3, der viste isotopmærkning af to forskellige prøver og isotopmærkning med TMT126. Klik her for at downloade denne fil.

Variabelnavn Værdi Beskrivelse
AfsaltSamp1 1065 Volumen, der skal anvendes til afsalt trin 1
DesaltSamp2 392 Volumen, der skal anvendes til afsalt trin 2
AfsaltSamp3 100 Volumen, der skal anvendes til afsalt trin 3
Devmode Falsk Falsk vil skære ned inkubationstiderne til 30sec- True vil følge inkubation timing i protokollen.
DTTVol 3 Mængden af DTT
Filterplate Targa Plade, der anvendes til afsaltning
FilterPlateVol 600 Lydstyrke til afsaltning
HAWaterWashes Falsk Antal vandvaske på SPE-pladen
IAMVol 2 Mængden af iodoacetamid
PeptidETMTVol 12.5 Mængden af peptid til TMT-mærkning
Pres 100 mbartryk ved elkøbsaftale
TempOffSet 1 Ændring i temperatur
TMTVol 10 Isobaric tag volumen, der skal tilføjes
TrisVol 800 Volumen til fortyndelse af prøve før fordøjelsen
TrypsinVol 2 Mængden af trypsin
BrugPopTimer Sandt True viser mulighederne for at lægge pres på pladen, hvis det er nødvendigt

Tabel 1. Liste over variabler, der anvendes i automatiseret cPILOT-protokol.

DilKilde DilWell Dest DestWell DilVolume StockSource Stockwell EksempelVol Eksempel-id
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 1
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 2
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 3
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 4
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 5
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 6
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 7
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 8
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 9
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 10
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 11
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 12
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 13
8M_Urea 1 Prøver B2 90 Stock_Samples kr. 10 14
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 15
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 16
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 17
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 18
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 19
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 20
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 21
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 22
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 23
8M_Urea 1 Prøver kr. 90 Stock_Samples kr. 10 24

Tabel 2. Mængden af muselever homogenat og 8 M urinstof.

KildeWell KildeWell2 Reporter Ion DestWell1 DestWell2 Volumen Eksempel-id
kr. kr. 126 kr. dagens e-kr. 10 1
kr. kr. kr. kr. dagens e-kr. 10 2
kr. kr. kr. kr. dagens e-kr. 10 3
kr. kr. kr. kr. dagens e-kr. 10 4
kr. kr. kr. kr. dagens e-kr. 10 5
kr. kr. kr. kr. dagens e-kr. 10 6
B2 kr. kr. kr. kr. 10 7
kr. kr. 130N kr. dagens e-kr. 10 8
kr. kr. 130C kr. kr. 10 9
kr. kr. kr. kr. dagens e-kr. 10 10
kr. kr. 131C kr. dagens e-kr. 10 11

Tabel 3. Samlet antal peptider, proteiner og peptidsspektrale tændstikker (PSM'er).

Automatiseret cPILOT
Lys Tunge
Proteiner 1209 1181
Peptider 6137 5872
PsM'er 14948 16762

Tabel 4. Barcoding de isoobariske tags med lette og tunge mærkede prøver.

Discussion

cPILOT er en forbedret multiplexing-strategi, der kan analysere op til 24 prøver i et enkelt eksperiment. Multiplexing kapacitet afhænger af antallet af tilgængelige isotop og isoobaric tagging kombinationer. Introduktion af TMTpro7, som er i stand til at mærke 16 prøver i enkelt eksperiment, kan skubbe grænserne for cPILOT til 32-plex. cPILOT består af flere pipetteringstrin og kræver omfattende pleje og brugerfærdigheder for at udføre prøveforberedelse. Selv med en ekspertbruger er manuelle fejl uundgåelige, hvilket opfordrer brugen af robotplatforme til at behandle prøver i cPILOT-strategien. Da cPILOT anvender pH-afhængig mærkning af peptiderne, skal pH-punktet opretholdes for lyset og det tunge dimethylerede sæt prøver. Mildt sur-basis pH kan resultere i dimethylering af både N-termini og lysin rester. En fordel ved cPILOT er, at det kun kræver halvdelen af de isobiske tags, da peptid N-termini er optaget af dimethylgrupperne. Dette giver et større antal prøver, der skal mærkes til halv pris. Håndtering af større stikprøvetal kræver, at reagenseksponeringstider er ens for den første og den sidste prøve i et parti. En pipettedispenser, der kan rumme op til 32 prøver parallelt, kan bedst opnås ved brug af robotvæskehåndteringsenheder.

For at behandle flere prøver af cPILOT blev den manuelle arbejdsgang ændret for at omfatte automatisering. Den robotvæske handler, der anvendes i denne undersøgelse har to bælg med 96-kanals og 8-kanals pipetting evner, med en griber til at placere pladerne i de tilgængelige 28 dæk steder. Væskebehandleren er integreret med et positivt trykapparat, orbital shaker og en anordning til opvarmning/afkøling af prøver i 96 brøndpladen. Det positive trykapparat hjælper med at udføre bufferudvekslinger i SPE-pladerne under oprydningen, mens orbitalshaskeren hjælper med at hvirvel/blande prøverne. Robotplatformen blev programmeret til at aspirere og dispensere buffere og prøver til 96-brøndplader, inkubere, vortexprøver og overførselsplader. Væsker med forskellige viskositeter, såsom acetonitril og vand, kræver specifikke pipettering overvejelser, der også kan programmeres til metoden.

CPILOT-arbejdsgangen, der startede fra BCA's proteinantificering til mærkning af peptiderne med isobiske tags (dvs. Den komplette protokol blev skaleret til at bruge 96 dybe brøndplader, der kan rumme 2 ml pr. brønd. Bufferne blev udarbejdet før forsøgets start og tilsat 96 brøndpladen, således at der kunne foretages en parallel prøveforarbejdning. I denne undersøgelse blev der tilføjet 22 workflow-replikater af muselever homogenat til de dybe brøndplader og taget gennem cPILOT-protokollen. Endelig blev der injiceret en enkelt prøve bestående af de 22-plex equimolar-muselever, der mærkede peptider, til massespektrometeret. De understøttende ionintensiteter svarende til peptidtætheden i prøverne viste, at prøver, der er behandlet med væskebehandleren, har lavere CV'er end den manuelle protokol (ikke viste data). Robotplatformen forbedrede også i høj grad reproducerbarheden af prøvebehandling. Reproducerbarhed og robusthed er meget vigtige faktorer under behandling af et stort antal prøver. Pipetteringsfejl kan føre til fuldstændig fejlfortolkning af dataene, og her leverede robotplatformen lav variation mellem prøverne. Ved hjælp af robotplatformen til cPILOT reducerede det den tid, det tog at forberede prøver. For eksempel krævede den efter at have udviklet den automatiserede metode 2,5 timer at behandle 22 prøver i forhold til 7,5 timer for manuel cPILOT. Der er forsøg i gang i vores laboratorium for yderligere at evaluere sammenligninger af manuelle og automatiserede cPILOT-arbejdsgange. Baseret på tidligere rapporter fra vores laboratorium var CV%s af proteinreporterionintensiteter i den manuelle cPILOT i gennemsnit 20% med nogle afvigende værdier, der oversteg denneværdi 12.

cPILOT er en kemisk derivatiseringsstrategi på peptidniveau, der kan bruges til enhver prøvetype som celler, væv og kropsvæsker. cPILOT tilbyder forbedret prøve multiplexing og med inkorporering af automatisering kan lette høj-throughput prøve multiplexing i proteomics. Denne gennemløb er nødvendig for yderligere at fremme sygdom og biologisk forståelse og biomarkør opdagelse.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Vanderbilt University Start-up fonde og NIH pris (R01GM117191) til RASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
2 ml black deep well plate Analytical Sales and Services, Inc. 59623-23BKGC Any brand of black 96-well plate is sufficient
2 ml clear deep well plate VWR 75870-796
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Agilent 500µL plate Agilent 203942-100 Reagent plate for adding buffers
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Analytical balance Mettler Toledo AL54
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Biomek i7 hybrid Beckmann Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) Bruker This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
Centrifuge with plate rotor Thermo Scientific 69720
Micro 21R Centrifuge Sorval 5437
Dionex 3000 UHPLC Thermo Scientific This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass Spectrometer Thermo Scientific This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) Thermo Fisher Scientific 90061
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific
Reservior plate 200ml Agilent 204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
Targa 20 mg SPE plates Nest Group, Inc. HNS S18V These are C18 cartridges
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Tris Biorad 161-0716
Biomek 24-Place Tube Rack Holder Beckmann 373661
Urea Biorad 161-0731
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  2. Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
  3. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  4. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  5. Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  8. Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
  9. Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  10. Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  11. King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
  12. King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
  13. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  14. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
  15. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  16. Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
  17. Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  18. Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).

Tags

Kemi High-throughput Proteomics Dimethylation cPILOT robot væske handler Automation Isobaric Tags
Automatiseret prøve multiplexing ved hjælp af kombineret precursor isotop mærkning og isoobaric tagging (cPILOT)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arul, A. B., Robinson, R. A. S.… More

Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (166), e61342, doi:10.3791/61342 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter