Summary
תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזובארי (cPILOT) היא אסטרטגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת המסוגלת להגדיל את מספר הדגימות שניתן לנתח בו-זמנית עם תגיות איזובריות זמינות. התאגדות של פלטפורמה רובוטית הגדילה מאוד את התפוקה הניסיונית, הרבייה והדיוק הכמותי.
Abstract
הצגנו זרימת עבודה פרוטאומיקה כמותית בתפוקה גבוהה, בשילוב תיוג איזוטופי מבשר ותיוג isobaric (cPILOT) מסוגל מולטיפלקס של עד 22 או 24 דגימות עם תגי מסה דו-דם או תגיות isobaric N,N-dimethyl לאוצין isobaric, בהתאמה, בניסוי יחיד. מדגם משופר זה multiplexing מפחית באופן משמעותי את זמני רכישת ספקטרומטריה מסה ומגביר את השירות של ריאגנטים isobaric מסחרי יקר. עם זאת, התהליך הידני של טיפול בדגימה וצעדי pipetting באסטרטגיה יכול להיות עבודה אינטנסיבית, זמן רב, ולהציג אובדן מדגם ושגיאה כמותית. ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות התאגדות של אוטומציה. כאן העבירנו את פרוטוקול CPILOT הידני למכשיר טיפול בנוזלים אוטומטי שיכול להכין מספרי דגימה גדולים (כלומר, 96 דגימות) במקביל. בסך הכל, אוטומציה מגבירה את הכדאיות והרבייה של מדד המחירים לצרכן ומאפשרת שימוש נרחב על ידי חוקרים אחרים עם התקני אוטומציה דומים.
Introduction
ספקטרומטריית מסה (MS) פרוטאומיקה מבוססת הוא כלי מחקר חיוני בזיהוי סמנים ביולוגיים ספציפיים למחלה, הבנת התקדמות המחלה, ויצירת לידים לפיתוח טיפולי. ניתן להשיג זאת ממגוון של דגימות קליניות הקשורות למחלות כגון סרום דם/ פלזמה, נוזלים פרוקסימליים,ורקמות 1,2. גילוי ואימות של סמן ביולוגי Proteomics זכו לאחרונה לשיקול משמעותי בשל העוצמה של אסטרטגיות מרובותמדגם 3,4. מדגם multiplexing היא טכניקה המאפשרת השוואה בו-זמנית וכמות של שני תנאי מדגם או יותר בתוך הזרקת MSאחת 5,6. מדגם multiplexing מושגת על ידי פפטידים ברקוד או חלבונים מדגימות מרובות עם כימי, אנזימטי, או תגים מטבוליים וקבלת מידע MS מכל הדגימות בניסוי אחד MS או MS / MS. בין תגיות isobaric זמין הם ריאגנטים תיוג isobaric (iTRAQ), מסחרי תגים המוניים טנדם (TMT), ובבית מסונתז isobaric N,N-dimethyl leucine (DiLeu) ריאגנטים עם יכולות של עד 16-plex7 ו 21-plex8,בהתאמה.
תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזוברי (cPILOT) הוא טכנולוגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת. cPILOT משלב תיוג איזוטופי של פפטיד N-termini עם אור [-(CH3)2] וכבד [(13 C2H3)2]איזוטופים ב pH נמוך (∼2.5), אשר שומר על שאריות לינזין זמין עבור pH גבוה עוקבות (8.5) תיוג איזוברי באמצעות TMT, דילאו, או תיוג iTRAQ3,9,10,11,12,13,14. ערכת התיוג הכפולה של אסטרטגיית cPILOT מתוארת בדמות משלימה 1 עם שתי דוגמאות באמצעות פפטיד לדוגמה. הדיוק והדיוק של הכימות מבוסס TMT ברמת MS2 יכול להיות בסכנה בשל הנוכחות של מזהמים יונים מבודדים ומפוצלים co-fragmented בשם אפקטההפרעה 15. מגבלה זו ביחסי יון עיתונאי לא מדויק ניתן להתגבר בעזרת ספקטרומטרים מסה Orbitrap טריברי. לדוגמה, ניתן להתגבר על אפקט ההפרעה על-ידי בידוד שיאבזוג dimethylated ברמת MS 1 בספקטרומטר המסה, עצם הפסגה הקלה אוהכבדה לפיצול MS 2 במלכודת היונים הליניארית ולאחר מכן עצם שבר MS2 האינטנסיבי ביותר עבור HCD-MS3 כדי להשיג מידע כמותי. על מנת להגדיל את הסיכויים לבחור את הפפטידים ללא ליסין אמין זמין ליצירת יונים עיתונאיים, רכישת MS3 סלקטיבית המבוססת על שבר y-1 גם ניתן להשתמש והיא גישה אשר יכול לגרום אחוז גבוה יותר של פפטידים הניתנים לכימות עם cPILOT9. השילוב של תיוג קל וכבד מגדיל את יכולות ההטיה לדוגמה על-ידי פקטור של פי 2 לזה שהושג עם תגיות isobaric בודדות. לאחרונה השתמשנו cPILOT לשלב עד 24 דגימות בניסוי יחיד עם Reagents DiLeu16. בנוסף, נעשה שימוש ב-CPILOT כדי ללמוד שינויים חמצוניים לאחרתרגום 14, כולל חנקתחלבון 17, פרוטאומיםגלובליים אחרים 9, והדגימה יישומים על פני דגימות רקמות מרובות במודל עכבר מחלתאלצהיימר 11.
הכנת מדגם איתנה היא צעד קריטי בניסוי של CPILOT והיא יכולה להיות גוזלת זמן, מייגעת ונרחבת. מדגם משופר מולטיפלקסינג דורש צנרת נרחבת ואנשי מעבדה מיומנים, ויש מספר גורמים שיכולים להשפיע במידה רבה על יכולת הרבייה של הניסוי. לדוגמה, יש צורך בטיפול זהיר בדגימות כדי להבטיח זמני תגובה דומים עבור כל הדגימות ולשמור על pH של מאגר מתאים לדגימות דימתילציה קלות וכבדות. יתר על כן, הכנה ידנית של עשרות עד מאות דגימות יכולה לגרום לשגיאה ניסיונית גבוהה. לכן, כדי להפחית את השתנות הכנת המדגם, לשפר את הדיוק הכמותי ולהגדיל את התפוקה הניסיונית, פיתחנו זרימת עבודה אוטומטית של cPILOT. אוטומציה מושגת באמצעות התקן רובוטי לטיפול בנוזלים שיכול להשלים היבטים רבים של זרימת העבודה (איור 1). הכנה לדוגמה מכמת חלבונים לתיוג פפטיד בוצעה על מטפל נוזלי אוטומטי. המטפל הנוזלי האוטומטי משולב עם מערכת לחץ חיובית (PPA) לחילופי חוצץ בין לוחות החילוץ (SPE) של שלב מוצק, שייקר מסלולי והתקן חימום/קירור. הפלטפורמה הרובוטית מכילה 28 מיקומי סיפון כדי להכיל לוחות ומאגרים. ישנם שני תרמילים עם תופסן להעביר את הצלחות בתוך מיקומי הסיפון: ראש pipetting נפח קבוע 96 ערוצים (5-1100 μL) ו 8 ערוצים נפח משתנה בדיקות (1-1000 μL). הפלטפורמה הרובוטית נשלטת באמצעות תוכנה. המשתמש צריך להיות מאומן באופן מקצועי לפני השימוש המטפל נוזלי רובוטי. המחקר הנוכחי מתמקד באוטומציה של זרימת העבודה הידנית של CPILOT, שיכולה להיות עבודה אינטנסיבית לעיבוד יותר מ-12 דגימות באצווה אחת. על מנת להגדיל את התפוקה של גישת CPILOT11, העברתנו את פרוטוקול CPILOT למטפל נוזלי רובוטי כדי לעבד יותר מ-10 דגימות במקביל. האוטומציה גם מאפשרת תגובות דומות עבור כל מדגם במקביל במהלך שלבים שונים של תהליך הכנת המדגם, אשר דרש ממשתמשים מיומנים להשיג במהלך CPILOT ידני. פרוטוקול זה מתמקד בהטמעת התקן הטיפול הנוזלי האוטומטי לביצוע CPILOT. המחקר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול לשימוש במערכת אוטומטית זו ומדגים את ביצועיו באמצעות ניתוח 22-plex "הוכחת הרעיון" של הומוגניאטים כבד העכבר.
Protocol
כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פיטסבורג. עכבר שליטה זכר אחד (C57/BLJ) נרכש מסחרית ושוכן בחטיבת משאבי בעלי חיים במעבדה באוניברסיטת פיטסבורג. עכברים האכילו מעבדת מכרסמים סטנדרטית צ'או אד libitum והוחזקו במחזור אור / כהה 12 שעות. רקמת הכבד נקטף ואוחסנה ב-80°C.
1. חילוץ חלבונים
הערה: שלבים אלה מבוצעים באופן ידני.
- לשטוף את כבד העכבר (100 מ"ג) עם תמיסת מלח והומוגניט עם 500 μL של 8 M אוריאה באמצעות homogenizer מכני באמצעות מטריצת lysing חרוזים עבור 4 m /s עבור 20 s.
הערה: במחקר זה, מעכבי פרוטאז או פוספטאז לא נוספו, אך ניתן להוסיף למאגר במידת הצורך, בהתבסס על הניסוי. כמו כן, ניתן להתאים את שלבי הפקת החלבון בהתאם לסוגי דגימות שונים. - להעביר את הרקמה homogenate לצינור microcentrifuge חדש, לשטוף ולשלב את צינורות lysing עם 100-500 μL של PBS עם 8 M אוריאה.
- צנטריפוגה רקמות הומוגניות (12,800 x g, 4 ° C, ו 15 דקות) ולאסוף את supernatant.
הערה: שאר השלבים מתבצעים על המטפל הנוזלי הרובוטי הזמין במעבדה של המשתמש. המטפל בנוזל חייב להיות מסוגל לשיאף ולחלק מאגרים מסוגי הלוחות שצוינו על-ידי ANCI ואליהם, בהשתתפות מינימלית של המפעיל. - לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) סיסה על פי הוראות היצרן.
- הפעל את PPA, התקן חימום/קירור ומשאבות ואקום וחבר את כל האביזרים עם מטפל בנוזלים. המטפל הנוזלי מראה אור כחול ברגע שהוא מחובר למחשב ומוכן לתפעול.
- כדי לצלחת reagent 1 (96 צלחת גם), להוסיף 30 μL של 25 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL של ציסטאין ו 25 mM 30 μL של iodoacetamide (IAA) לשורות 1, 2, ו 3, בהתאמה.
- הוסף 8 M urea ו 20 mM Tris עם 10 mM CaCl2 (pH 8.2) לצלחת מאגר. להוסיף 500 μL של 5% חומצה formic כדי 2 מ"ל צלחת באר עמוקה, 20 μL של קשין לשורה 1 של צלחת trypsin ומקום במיקום הסיפון כפי שצוין על ידי השיטה.
הערה: IAA ו trypsin נוספו 96 צלחת גם לפני הוספת המדגם. - Aliquot 300 μL של הכבד homogenate לתוך צינור 500 μL ולהניח על צלחת באר עמוקה 2 מ"ל והמקום ב 4 ° C עד תחילת הפרוטוקול. לניסוי זה, 22 aliquots נוצרו הומוגניכבד יחיד.
הערה: הוסף תקן בקרת איכות פנימי (לדוגמה, מקרה אלפא בקר או חלבון אקסוגני אחר) עם יחס 1 μg סטנדרטי: 100 דגימת חלבון μg. - הגדר את אמצעי האחסון של מאגרים שיש להוסיף לדוגמאות לפי שמות משתנים וערך לפי טבלה 1. בהתבסס על BCA, הזן את אמצעי האחסון של מאגר מדגם ונורמליזציה (8 M urea) בגיליון אלקטרוני וצרף לתוכנה(טבלה 2).
הערה: דילול נוסף עם מאגר עשוי להיות נחוץ אם ריכוז החלבון גבוה מדי. הריכוזים וכתוצאה מכך עבור מדגם מרקמת הכבד היה 10 μg/ μL. נפח המאגרים היה אופטימיזציה עבור חלבון μg 100. - הסר צינורות לדוגמה מ- 4 °C, מניחים על מיקום הסיפון שצוין של המטפל הנוזלי האוטומטי, ואפשרו להתחמם במשך 10 דקות.
- פתח את השיטה ובצע את ההוראות כדי למקם את הטיפים הדרושים (1070, 90 ו- 230 μL), וlabware לתוך העמדות הרצויות. לאחר שכל כלי המעבדה והטיפים נמצאים במקומם, הצלב את הסימון עם פריסת הסיפון הסופי ולחץ על הבא כדי להמשיך בפרוטוקול.
הערה: הגדרה המודרכת מודיעה למשתמש להוסיף אמצעי אחסון נדרש של מאגר לכלי המעבדה הספציפיים בהתאם לפרוטוקול ולמיקום הסיפון שיש לשמור.
2. הפחתת דגימה, אלקילציה ועיכול
- טען 230 טיפים μL וגם 90 μL של 8 M אוריאה מהמאגר ולחלק לשורה 1 של שחור 2 מ"ל עמוק היטב צלחת. תפרוק את הטיפים. חזור על שלב זה עד 8 M urea מתווסף לכל הבארות המתאימות 22 דגימות.
הערה: מאגר הפירוק משחרר את המבנה התלת מימדי של החלבון כדי להניב את המבנה הראשי כדי שהטיפסין יוכל לפעול ולשבור את החלבון ביעילות. פיפטה 8 ערוצים יכול לשאוף כרכים שונים עבור 8 ערוצים והוא יכול לחלק למיקומים שונים בכלי המעבדה. בשלב זה שנו כל הערוצים באותו אמצעי אחסון כמוגדר בתוכנה. - לאחר הוספת מאגר denaturation, לטעון את 90 טיפים μL לשאוף 10 μL (מתאים 100 μg) של הומוגניט כבד העכבר באמצעות פיפטה 8 ערוצים לצלחת שחור 2 מ"ל עמוק היטב. תפרוק את הטיפים. חזור על שלב זה עד שכל 22 הדגימות יועברו.
- לאחר כל העברה, לבצע שלב לערבב כדי לשאוף ולחלק 50 μL של תכולת הבאר שלוש פעמים כדי להבטיח ערבוב של החלבון עם המאגר להפגין יחס 1:1.
הערה: הסר את מדגם המניות homogenate והמקם ב- -80 °C. - כדי להפחית את החלבונים denatured, לטעון שורה אחת של 90 טיפים μL לשאוף 3 μL של DTT מצלחת reagent 1. לחלק DTT לשורות 1 ו 2 של שחור 2 מ"ל עמוק צלחת גם לפרוק את הטיפים.
הערה: החלבון: יחס טוחנת DTT נשמר בשעה 1:40 להפחתת איגרות חוב disulfide. החישוב עבור יחס החתרן מבוסס על מסת החלבון של אלבומין סרום חזיר (BSA), שהוא 66.5 x 103 גרם/מול. - אטמו את לוח הדגימה בנייר אלומיניום ודגירה ב-37°C ל-600 שניות ב-300 סל"ד.
- הוסף 30 μL של 0.25 M IAM לשורה 3 של צלחת reagent 1 ממש לפני השימוש והמקום על הסיפון. שחרר את לוח הדגימה וחזור לסיפון.
הערה: IAM רגיש לאור. - טען שורה אחת של 90 טיפים μL, לשאוף 6 μL של IAM מצלחת reagent 1 בשורה 3, ולחלק לשורה 1 של לוח המדגם. תפרוק את הטיפים.
הערה: החלבון: יחס הטוחנת של IAM נשמר בשעה 1:80 עבור כל דגימה. תגובה זו חייבת להיעשות בחושך. - אטמו את לוח הדגימה ודגירה ב-4°C למשך 30 דקות ב-300 סל"ד במכשיר החימום/קירור.
הערה: איטום הלוח מתבצע כדי למנוע את הדגימה מהאור, אידוי ושפיכה מהבאר. - לפתוח את לוח הדגימה ולטעון שורה אחת של 90 טיפים μL ושאפה 5 μL של ציסטאין מצלחת reagent 1 בשורה 2. לחלק שורות 1 ו- 2 של הלוח לדוגמה ולפרוק את הטיפים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
הערה: החלבון: יחס טוחנת L-ציסטאין נשמר בשעה 1:40. - מניחים את לוח הדגימה על שייקר המסלול כדי לבצע ניעור מתוזמן של 1800 סל"ד למשך 30 דקות.
- הוסף 800 μL של 20 mM Tris מאגר עם 10 mM CaCl2 (pH 8.2) לכל באר של הלוח לדוגמה כדי לדלל את ריכוז אוריאה 2 M. לפרוק את הטיפים.
הערה: פעילות Trypsin מתעכבת בריכוזי אוריאה גבוהים יותר ולכן יש להפחית אותה לפחות מ-2 מ'. מחקר זה בוצע עם חלבון יחס טוחנת טריפסין של 50: 1 עבור 14 שעות. - להוסיף 20 μL של שלושה דרך לשורה 1, עמודה 1-12 של צלחת 96 גם ומקום במיקום מסוים על הסיפון.
- טען שורה אחת של 90 טיפים μL, לשאוף 2 μL של שלושה μL משוחת צלחת trypsin 1, ולחלק שורות 1 ו 2 של הלוח לדוגמה. תפרוק את הטיפים.
- אטמו את הצלחת ותדגירה למשך 14 שעות ב-37°C ב-600 סל"ד במכשיר החימום/הקירור.
- לאחר הדגירה, בטלו את לוח הדגימה והוסיפו 5% חומצה פורמית לשורה 3, עמודה 1- 12 של צלחת איסוף באר עמוקה והמקמו אותה על הסיפון שצוין.
- לעצור את העיכול על ידי הוספת 150 μL של 5% חומצה formic משומה 3 של צלחת חומצה formic ולחלק לצלחת מדגם בשורות 1 ו 2. תפרוק את הטיפים.
3. התפלת שלב 1
- להלחית את הפפטידים עם צלחת SPE המכילה 20 מ"ג של חומר טארגה C-18. לתקן את אמצעי האחסון עבור כל חילופי מאגר כמו 600 μL ולתקן את הלחץ 100 mbar.
- טען 1070 טיפים μL ושאף 600 μL של acetonitrile ולחלק שורות 1 ו 2 של צלחת SPE. מניחים את לוחית SPE על PPA ולהפעיל לחץ.
- באמצעות אותם טיפים, לשאוף 600 μL של acetonitrile ולחלק שורות 1 ו 2 של צלחת SPE. מניחים את לוחית SPE על PPA ולהפעיל לחץ.
הערה: ניתן לרוקן את הזרימה לפסולת באמצעות משאבת יניקה. - טען 1070 טיפים μL וגם 600 μL של מאגר A (100 % מים ב 0.1 % חומצה formic) ולחלק שורות 1 ו 2 של לוח SPE. מניחים את לוחית SPE על PPA ולהפעיל לחץ.
הערה: אם אמצעי האחסון של המאגר אינו מפחית באופן משמעותי, נסה להגדיל את הלחץ או הזמן. - טען 2 שורות של 1070 טיפים μL, לשאוף 534 μL של דגימות מעוכלות, ולחלק שורות 1 ו 2 של צלחת SPE. מניחים את לוחית SPE על PPA ולהפעיל לחץ. חזור על שלב זה עד שכל הדוגמאות ייטענו.
הערה: מאז הנפח הכולל לאחר הוספת חומצה formic יהיה 1068 μL ואת הדגימות נוספו בשני מעברים. - טען 2 שורות של טיפים משומשים 1070 μL, לשאוף 600 μL של מאגר A, ולחלק שורות 1 ו 2 של לוח SPE. מניחים את לוחית SPE על PPA ולהפעיל לחץ.
- חזור על השלב שלעיל פעם אחת כדי לנקות את הדגימה.
- טען שורה אחת של 1070 טיפים μL, לשאוף 600 μL של ACN: מים (60:40) ולחלק שורות 1 ו 2 של לוח SPE. מניחים את צלחת ה-SPE מעל צלחת איסוף כדי לחתך את הפפטידים באמצעות PPA ולהפעיל לחץ.
- חזור על השלב שלעיל כדי להגביר את הפפטידים בצלחת האיסוף. מייבשים את צלחת האיסוף לייבוש ומאחסנים ב-80° צלזיוס עד לעיבוד נוסף.
4. תיוג דימתילציה (פפטיד N-טרמיני)
- מקם את הטיפים הדרושים (1070, 90 ו- 230 μL), ואת כלי המעבדה בעמדות הרצויות בתוכנה. לאחר שכל כלי המעבדה והטיפים נמצאים במקומם, הצלב את הסימון עם פריסת הסיפון הסופי ולחץ על הבא כדי להמשיך בפרוטוקול.
- כדי לצלחת ריאגנט 2, להוסיף 450 μL של 1% חומצה אצטית, 50 μL אור פורמלדהיד (CH2O), 50 μL של פורמלדהיד כבד(13CD2O), ו 150 μL של חומצה פורמית לשורות 1, 2, 3 ו 4 בהתאמה.
- כדי לצלחת ריאגנט 3 להוסיף 50 μL של CB אור, 50 μL של CB כבד, לשורות 1 ו 2 ו 50 μL של אמוניה לשורה 3 ו 4.
- טען 2 שורות של 230 טיפים μL וגם 100 μL של 1% חומצה אצטית משורה 1 של צלחת ריאגנט 2 ולחלק פפטידים מיובשים בצלחת מדגם 2 (צלחת אוסף מהצעד התפלה) שורות 1 ו 2 ולבצע טלטול מתוזמן במשך 5 דקות ב 1800 סל"ד.
- טען 90 טיפים μL וגם 16 μL של 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) משורה 2 של צלחת reagent 2 ולחלק לשורה 1 של לוח המדגם. תפרוק את הטיפים.
- טען שורה אחת של 90 טיפים μL וגם 16 μL של 60 mM (4%) 13 םיוה CD2O (20% wt/v) משורה 3 של לוחית reagent 2 ולחלק לשורה 2 של לוח המדגם. תפרוק את הטיפים.
הערה: בשורת מחקר זו 1 מתאים לאור ושורה 2 מתאימה לדגימות דימתילציה כבדות (ראה איור 1). - טען 2 שורות של 90 טיפים μL וגם 16 μL של 24 mM NaBH3CN ו 24 mM NaBD3CN משורה 1 ו 2 של צלחת reagent 3 ולחלק לשורות 1 ו 2, בהתאמה של הלוח לדוגמה.
- פרקו את הטיפים ובצעו שייק מתוזמן במשך 15 דקות ב-1800 סל"ד באמצעות שייקר המסלול.
הערה: הוספת נתרן cyanoborohydride יוזם את התגובה ומכאן כדי להפחית את השונות בין ניסויים שלב זה מבוצע פעם אחת בכל אצווה. - טען 2 שורות של 90 טיפים μL ושאף 32 μL של 1% אמוניה (~ 28-30% v /v) משורים 3 ו 4 של צלחת ריאגנט 3 ולחלק שורות 1 ו 2 בהתאמה של לוח המדגם 2. תפרוק את הטיפים.
הערה: הוספת אמוניה עוצרת את התגובה ומכאן כדי להפחית את השונות בין ניסויים שלב זה מבוצע פעם אחת בכל אצווה. - שלבו כמויות שוות של אור וכבד (1:1) פפטידים דימתילציה לצלחת באר עמוקה חדשה של 2 מ"ל להתפלה.
הערה: במחקר זה 90 μL של תכולת הבאר משוורה 1 שולבה עם 90 μL של שורה 2 מצלחת מדגם 2 לצלחת אוסף חדשה 2 מ"ל (צלחת לדוגמה 3). היחס בין האור: ערבוב כבד תלוי בפרוטוקול הניסיוני, במחקר זה נעשה שימוש ביחס של 1:1. - טען 2 שורות של 230 טיפים μL ושאף 32 μL של 5% חומצה formic לדגימות המשולבות ולבצע טלטול מתוזמן עבור 30 s ב 1800 סל"ד.
הערה: יעילות dimethylation תלוי ה-pH של תערובת התגובה וכל שינוי pH מאגר יגרום תיוג לא שלם של פפטיד N-termini. יעילות Dimethylation צריך להיות גדול מ 97% כאשר חיפשו כשינוי דינמי בפפטיד N-termini. במחקר זה יעילות התיוג של פפטידים קלים וכבדים היו 99.7% ו-99.5% בהתאמה.
5. התפלת שלב 2
- בצע התפלה לדוגמה בדומה לשלב desalt 1 עבור הדגימות המשולבות.
- ייבש את הדגימות בצלחת המדגם באמצעות פינוי מהיר ואחסן ב-80°C עד לעיבוד נוסף.
6. תיוג איסוברי (שאריות Lys)
- בצע את ההתקנה מונחה כלי מעבדה ולמקם את הטיפים הדרושים (1070, 90, ו 230 μL), עם מאגרים מתאימים. לאחר שכל כלי המעבדה והטיפים נמצאים במקומם, הצלב את הסימון עם פריסת הסיפון הסופי ולחץ על הבא כדי להמשיך בפרוטוקול.
- להוסיף 250 μL של 100 mm triethyl אמוניום ביקרבונט (TEAB), 30 μL של הידרוקסילמין (10% עם/ v) לשורות 1, ו 2 של צלחת reagent 4. מקם את צינורות TMT על צלחת 2 מ"ל עמוק היטב לפי הגיליון האלקטרוני בטבלה 3.
- שמור צינור ריק 1.5 מ"ל במחזיק מתלה צינור לצינור פפטידים מתויגים. מניחים את לוח הדגימה המיובש בצלחת עיבוד P9 ו- TMT ב- P14.
- כדי לשחזר את הפפטידים, לטעון 230 טיפים μL ולזום 100 μL של 100 mm triethyl אמוניום ביקרבונט (TEAB) מאגר (pH ~ 8.5) משורה 1 בצלחת TEAB ולחלק פפטידים מיובשים בשורה 3 של צלחת מדגם 3. מניחים את הצלחת על שייקר המסלול במשך 30 שניות ב-1800 סל"ד.
הערה: לשחזר 100 μg של פפטידים dimethylated בריכוז של 1 μg / μL. - טען 90 טיפים μL וגם 10 μL של אצטוניטריל anhydrous מ H12 של צלחת TMT ולחלק לתוך כל צינורות TMT מיובשים.
- הסר את צינורות TMT, מערבולת, וסובב במהירות את הצינורות ולחזור לסיפון בצלחת באר עמוקה.
- טען שורה אחת של 90 טיפים μL ושאף 12.5 μL של פפטידים dimethylated משולב ולחלק לשורה 1 של לוח עיבוד TMT. תפרוק את הטיפים.
הערה: יחס הפפטיד נשמר ב- 1:8 עבור ניסוי זה. - טען שורה אחת של 90 טיפים μL וגם 10 μL של TMT ולחלק לשורה 1 של לוח עיבוד TMT. פורקים את הטיפים, מבצעים שייק מתוזמן למשך שעה אחת ב-1800 סל"ד.
- טען שורה אחת של 90 טיפים μL וגם 8 μL של הידרוקסילאמין (10% w / v) משורה 2 בצלחת TEAB ולחלק לשורה 1 של לוח עיבוד TMT. לפרוק את הטיפים, לבצע טלטול מתזמן במשך 15 דקות ב 1800 סל"ד.
- שלב 30.5 μL של פפטידים המסויגים TMT מצלחת עיבוד TMT לצינור 1.5 מ"ל. בטל את הטיפים לאחר כל העברה.
- הסר את הצינור עם דגימות מאגר ויבש כדי לאדות את האצטוניטריל. פפטידים משוחזרים ב-0.2 מ"ל מים בחומצה תפלה 0.1% ולחזור לסיפון.
הערה: יעילות התיוג של תיוג isobaric היא גם ספציפית ל- pH ויעילות התיוג צריכה להיות מעל 98% לכל הוראות היצרן. במחקר זה יעילות תיוג TMT של ליסין הסתיים פפטידים קלים וכבדים היה 99.4% ו 99.5% בהתאמה.
7. התפלת שלב
- בצע התפלה מדגם דומה desalt 1 עבור מדגם אחד.
- מייבשים את הדגימות ומאחסנים ב-80°C עד לניתוח.
8. ספקטרומטריה כרומטוגרפיה נוזלית-מסה דו-דם (LC-MS/MS) ו-MS3
- לשחזר את הפפטידים במים כיתה MS עם 0.1% FA כדי לקבל ~ 1 μg / μL ריכוז. לסנן דגימות עם צינורות microcentrifuge המכיל מסנן 0.65 μm. פפטידים צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 3 דקות ולמקם את הזרימה דרך לתוך בקבוקון דגימה אוטומטית.
הערה: ריכוז פפטיד ניתן לאשר בשלב זה אם תרצה. הפפטידים יצטרכו להיות מוחזרים במים כיתה LC-MS וכפוף לתסה פפטיד BCA. במחקר זה, אסאי BCA פפטיד לא בוצע וכל כמויות פפטיד התבססו על חלבון ראשוני BCA אסאי. - הכן את מאגרי השלבים הניידים באופן הבא: 100% (v/v) מים עם 0.1% FA (A) ו- 100% ACN עם 0.1% FA (B).
- להזריק 1 μL של מדגם על עמודת מלכודת ארוז עם 2 ס"מ של חומר C18 (3 μm, 100 Å גודל נקבוביות).
הערה: ניקוי לדוגמה על המלכודת הוא כדלקמן: 10 דקות, 100% A; 2 μL/min באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית דו-מיו-מטימטית. - הפעל את שיטת ההפרדה האנליטית. השתמש 100 μm i.d. x 26 ס"מ לייזר משך קצה מותך עמודה נמש סיליקה ארוז עם חומר C18 (2.5 μm, 100 Å). מעבר הצבע הוא: 0-10 דקות, 10% B; 10-30 דקות, 10-15% B; 30-75 דקות, 15-30% B; 75-88 דקות, 30-60% B; 88-92 דקות, 60-90% B; 92-99 דקות, 90% B; 99-100 דקות, 90-10% B, 100-120 דקות, 10% B; 300 00 00:00:00,000 -
- הפעל את רכישת הנתונים עבור ספקטרומטר המסה בזמן ששיטת ההפרדה האנליטית פועלת.
- השתמש בפרמטרים הבאים עבור סריקת סקר MS: 375-1,500 m/z, רזולוציה של 120,000, מחזור זמן 3 s (מהירות מרבית), בקרת רווח אוטומטי (AGC) יעד 4.0e5, זמן הזרקה מרבי 50 ms.
- השתמש בפרמטרים הבאים עבור CID-MS/MS עם מלכודת יון: סריקות רכישה תלויות נתונים (DDA) לכל תוצאה, רוחב בידוד של 2 מ"ל/z, 35% אנרגיית התנגשות מנורמלת (NCE), 0.25 שעות הפעלה, זמן הפעלה של 10 ms, 1.0e4 AGC, 100 ms זמן הזרקה מרבי.
- השתמש בפרמטרים הבאים עבור HCD-MS3 SPS 10: טווח סריקה 100-400 מ'/ז,מספרהסריקות התלויות 10, AGC 5.0e4, זמן הזרקה מרבי 118 ms, אנרגיית התנגשות HCD 55%, MS2 חלון בידוד 2.
9. ניתוח נתונים
- חיפוש קבצי RAW שנוצרו עבור רשימת חלבונים ופפטידים באמצעות תוכנת ניתוח חלבונים מול מסד נתונים מתאים.
הערה: קבצי RAW שנוצרו במחקר זה נערך חיפוש מול מסד נתונים של Uniprot העכבר. - מאחר שיש תיוג קל וכבד בקובץ RAW אחד, חפש בכל קובץ עם שתי זרימות עבודה לפפטידים קלים וכבדים.
- חפש בקבצי RAW מול מסד הנתונים של Uniprot העכבר (07/13/2019) עם רצף 53035 עם הפרמטרים הבאים: מחשוף טריפסין עם מקסימום שני מחשוף שלא נענו, פפטיד עם מינימום 6 חומצות אמינו אורך, 15 עמודים לדקה סובלנות מסה הורה, 1 Da פיצול סובלנות שינויים סטטיים: dimethylation אור (+28.031, פפטיד N-terminus) או דימתילציה כבדה (+36.076 Da, פפטיד N-terminus), פחמימות (+57.021 Da, ג), שינויים דינמיים: חמצון (+15.995 Da, M), תג isobaric 11-plex (229.163 Da, K), 1% FDR, כימות יון כתב עם 30 עמודים לדקה סובלנות שילוב שיא, centroid הבטוח ביותר עבור שיטת אינטגרציה.
הערה: הפסגה dimethylated כבד כולל גם שינוי נוסף שהוא ~ 7 Da (+35.069 Da, פפטיד N-terminus) משיא dimethylated אור ולכן צומת חיפוש אחר יש לשלב כדי לכלול שינוי זה גם. - ביצוע כימות יון כתב בהתבסס על העוצמה, 65% SPS התאמה מסה, יחס S /N ממוצע 10, תיקון isotopic, נורמליזציה וקנה מידה לא בוצעו.
הערה: ניתן לבצע נורמליזציה וקנה מידה בהתבסס על כמות פפטיד כוללת או חלבון ספציפי שנוסף לדגימה. ניתן גם לכלול דגימות QC בערוצים עבור נורמליזציה בין-אצווה או תוך-אצווה בהתבסס על הפניה פנימית דו-זניתמדרג 18. הזיהמים איזוטופיים של ערוצי TMT שונים לא סופקו לחיפוש, מומלץ למשתמשים להוסיף את זיהום האיזוטופ של יונים עיתונאיים שונים.
Representative Results
איור 2 מציג נתוני MS מייצגים של פפטיד שזוהו בכל 22 ערוצי היונים של הכתבים מניסוי של 22-plex cPILOT, כולל שכפולים של זרימת עבודה. איור 2 (למעלה) מתאר זוג שיא טעון כפליים המופרד על-ידי מרווח של 4 Da m/z המציין קבוצת דימתיל אחת המשולבת בפפטיד. זוגות השיא הקלים והכבדים היו מבודדים ומפוצלים באופן עצמאי כדי להניב את רצף הפפטיד. הרצף של הפפטיד הוא G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11פלקס) ומתאים לחלבון Betaine-homocysteine S-מתיל transferase. יונים השברים האינטנסיביים ביותר הן לפסגות הקלות והן לפסגות ה-dimethylated הכבדות(לאמוצגות) היו מבודדות עוד יותר לפיצול MS3, ויונים הכתבים(m/z 126-131) מוצגים בדמות 2 (למטה). עוצמת היונים הכתבת פרופורציונלית ישירות לשפע הפפטיד בדגימה. שפע הפפטיד של הדגימות מרמז על יכולת pipetting של הפלטפורמה הרובוטית הוא אחיד למדי על פני 22 דגימות. בסך הכל, ניסוי זה 22-plex cPILOT הביא 1326 (1209-אור/ 1181 כבד) זיהוי חלבונים הנובעים 3098 (6137 אור / 5872 כבד) פפטידים(טבלה 4). איור 3 מציג את עלילת התיבה של שפע log10 לעומת עוצמת יון כתב הכולל על פני כל 22 הערוצים המציגים שונות בין-טובה/בין-מדגם פחותה. הערכת האוטומציה הכוללת נעשתה על ידי בחינת השגיאה בשפע היונים של הכתבים על פני כל חלבון ב-22 הדגימות. איור 4 מראה כי עיבוד לדוגמה עם הפלטפורמה הרובוטית הביא לערכי CV נמוכים מאוד. באופן ספציפי, לאורך 3098 פפטידים זיהו את קורות החיים הממוצעים בשפע יון כתב היה 12.36 % ו 15.03% עבור פפטידים dimethylated קל וכבד, בהתאמה. בין פפטידים אלה 2032 של פפטידים אלה היה אות יון כתב מעל הסף המינימלי ונחשבו לכמת.
איור 1. זרימת עבודה ניסיונית לעיבוד 22 דגימות במקביל לפרוטוקול אוטומטי של cPILOT. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2. כימות פפטידים על פני 22 דגימות. ספקטרה לדוגמה MS(למעלה) ו-MS 3 (למטה) של פפטיד G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11פלקס) מכמתת בניסוי CPILOT אוטומטי של 22-plex עבור דימתילציה קלה (שמאלית למטה) ופסגות דימתילציה כבדות (מימין למטה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3. עלילת התיבה של עוצמת היונים הכתב הכולל לעומת שפע log10 של 22 דגימות באמצעות מגלה proteome 2.3. קובץ RAW נערך פעמיים פפטידים קלים וכבדים, מזהי חלבונים בנפרד עם TMT כשינוי דינמי, אור (+28.031 Da) וכבד (+36.076 & +35.069 Da) dimethylation בפפטיד N-termini כשינוי סטטי. חיפוש משולב עם כל השינויים לעיל נוהל באמצעות Proteome Discover 2.3 כדי להשיג את יומן 10 שפע של עוצמות פפטיד בכל הערוצים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4. כינור עלילות של שיתוף יעיל של וריאציה של שפע פפטיד מעוצמות יון כתב מסכם על פני ערוצים 126-131 m/z. הפפטיד היה מכמת עם ערך CV ממוצע של 12.36 ו 15.03 עבור אור (2373) וכבד (2533) פפטידים הניתנים לכימות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
דמות משלימה 1. איור של CPILOT עם פפטיד יחיד. הצגת תיוג isotopic של שתי דגימות שונות תיוג isobaric עם TMT126, התערובת שנוצרה הוזרק MS עבור LC-MS3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| שם משתנה | ערך | תיאור |
| דסלת סאומפ1 | 1065 | אמצעי אחסון לשימוש עבור התפלת שלב 1 |
| דסלת זאמפ2 | 392 | אמצעי אחסון לשימוש עבור שלב desalt 2 |
| דסלת זאמפ3 | 100 | אמצעי אחסון לשימוש עבור התפלת שלב 3 |
| ד'ומוד | False | שקר יחתוך את זמני הדגירה ל-30 שניות... |
| DTTVol | 3 | אמצעי אחסון של DTT |
| סנןפלת | טרגה (טארגה) | צלחת המשמשת להתפלה |
| סנןפלאטוול | 600 | אמצעי אחסון להתפלה |
| שטיפת המים | False | מספר מים שוטפים על לוח SPE |
| IAMVol | 2 | כרך של איודואצטאמיד |
| פפטידTMTVol | 12.5 | נפח פפטיד לתיוג TMT |
| לחץ | 100 | לחץ mbar ב PPA |
| ערכת טמפו-אוף | 1 | שינוי בטמפרטורה |
| ת.מ.ט.וול | 10 | אמצעי אחסון של תג Isobaric להווסף |
| טריסוול (1100) | 800 | נפח לדילל מדגם לפני העיכול |
| ניסיון ניסיון ווול | 2 | נפח של שלושה נסיפסין |
| שימוש ב-PopTimer | נכון | True מציג את האפשרויות להפעיל לחץ על הלוח במידת הצורך |
שולחן 1 . רשימת המשתנים המשמשים בפרוטוקול CPILOT אוטומטי.
| דילסורס | דילוול (דילוול) | דסט (Dest) | דסטוול (119) | דילוולום (ת') | מקור מניות | סטוקוול | מדגם וול | זהה מדגם |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | ת"א 35 | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 1 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A2 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 2 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A3 (3) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 3 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A4 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 4 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A5 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 5 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A6 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 6 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | ת"א 35 | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 7 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A8 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 8 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A9 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 9 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | ת"א 35 | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 10 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | ת"א 35 | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 11 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | A12 (12) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 12 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B1 (B1) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 13 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B2 | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 14 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B3 (100) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 15 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B4 (B4) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 16 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B5 (120) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 17 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B6 (B6) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 18 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B7 (100) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 19 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B8 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 20 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B9 (100) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 21 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B10 (10) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 22 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B11 (11) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 23 |
| 8M_Urea | 1 | דגימות | B12 (12) | 90 | Stock_Samples | ת"א 35 | 10 | 24 |
שולחן 2 . נפח של כבד עכבר הומוגניאט ו 8 M אוריאה.
| מקורוול | מקורוול2 | כתב יון | ת.ד. 55 | ת.ד. 2 | אמצעי אחסון | זהה מדגם |
| ת"א 35 | C1 (1) | 126 | ת"א 35 | E1 (E1) | 10 | 1 |
| A3 (3) | C3 (100) | 127N ,ןוהל | A2 (10) | E2 (E2) | 10 | 2 |
| A5 (10) | C5 (100) | 127C (127C) | A3 (3) | E3 (E3) | 10 | 3 |
| ת"א 35 | C7 | 128N ,םינווה | A4 (10) | E4 (E4) | 10 | 4 |
| A9 (10) | C9 (100) | 128C (128C) | A5 (10) | E5 | 10 | 5 |
| ת"א 35 | C11 (11) | 129N (129N) | A6 (10) | E6 (E6) | 10 | 6 |
| B2 | D2 (2) | 129C (129C) | ת"א 35 | E7 (E7) | 10 | 7 |
| B4 (B4) | D4 (D4) | 130N 130N | A8 (10) | E8 (10) | 10 | 8 |
| B6 (B6) | D6 (D6) | 130C - 130C | A9 (10) | E9 (10) | 10 | 9 |
| B8 (10) | D8 (100) | 131N ,ןוהל | ת"א 35 | E10 (10) | 10 | 10 |
| B10 (10) | D10 (10) | 131C (131C) | ת"א 35 | E11 (11) | 10 | 11 |
שולחן 3. המספר הכולל של פפטידים, חלבונים וגפרורים ספקטרליים פפטיד (PSMs).
| 1000000000000 | ||
| אור | כבד | |
| חלבונים | 1209 | 1181 |
| פפטידים | 6137 | 5872 |
| PSMs (PSMs) | 14948 | 16762 |
שולחן 4. ברקוד התגים המיובאריים עם הדגימות הקלות והכבדות המסומנות בסימון.
Discussion
cPILOT היא אסטרטגיית מוליפלקס משופרת שיכולה לנתח עד 24 דגימות בניסוי יחיד. קיבולת ההטיה תלויה במספר שילובי התיוגים באיזוטופיים ואיזובאריים הזמינים. הקדמה של TMTpro7, אשר מסוגל תיוג 16 דגימות בניסוי יחיד, יכול לדחוף את הגבולות של CPILOT ל 32-plex. CPILOT מורכבת ממספר שלבי צנרת ודורשת טיפול נרחב וכישורי משתמש לביצוע הכנה לדוגמה. גם עם משתמש מומחה, שגיאות ידניות הן בלתי נמנעות, אשר מזמינה את השימוש בפלטפורמות רובוטיות כדי לעבד דגימות באסטרטגיית cPILOT. מכיוון ש-CPILOT משתמש בתיוג תלוי pH של הפפטידים, יש לשמור על ה-pH עבור האור ואת סט הדגימות הכבדות. חומציות בסיסית במתינות pH יכול לגרום dimethylation של שני משקעים N-termini ו לינזין. היתרון של cPILOT הוא שזה דורש רק מחצית תגי isobaric מאז פפטיד N-termini עסוקים עם קבוצות דימתיל. זה מאפשר מספר גדול יותר של דגימות להיות מתויג בחצי העלות. טיפול במספרים לדוגמה גדולים יותר מחייב שזמן החשיפה של Reagent יהיה דומה לדוגמה הראשונה והאחרון באצווה. מתקן פיפטה שיכול להכיל עד 32 דגימות במקביל ניתן להשיג בצורה הטובה ביותר עם השימוש במכשירי טיפול בנוזל רובוטי.
על מנת לעבד דגימות מרובות על ידי cPILOT, זרימת העבודה הידנית תוקנה כדי לשלב אוטומציה. המטפל הנוזלי הרובוטי המשמש במחקר זה יש שני תרמילים עם יכולות pipetting 96-ערוצים ו 8 ערוצים, עם תופס למקם את הצלחות 28 מיקומי הסיפון הזמינים. המטפל הנוזלי משולב עם מערכת לחץ חיובית, שייקר מסלול, והתקן לדגימות חום/צינון בצלחת 96 באר. אפליקציית הלחץ החיובי מסייעת בביצוע חילופי חיץ בצלחות SPE במהלך הניקוי, בעוד שמנער המסלול מסייע למערבולת/לערבב את הדגימות. הפלטפורמה הרובוטית תוכנתה לשאוף ולחלק מאגרים ודגימות ל-96 לוחות, דגירה, דגימות מערבולת ולוחיות העברה. נוזלים עם צמיגות שונות, כגון acetonitrile ומים, דורשים שיקולי pipetting ספציפיים שניתן גם לתכנת לתוך השיטה.
זרימת העבודה של CPILOT, החל מכמת חלבון על ידי BCA ועד לתיוג הפפטידים עם תגיות איזובריות (כלומר, TMT), בוצעה במערכת המטפל הנוזלי. הפרוטוקול המלא היה קנה מידה להשתמש 96 צלחות באר עמוק שיכול להכיל 2 מ"ל לכל באר. המאגרים הוכנו לפני תחילת הניסוי והוספו לצלחת 96 באר כדי לאפשר עיבוד מדגם מקבילי. במחקר הנוכחי, 22 שכפולים של זרימת עבודה של הומוגנאט כבד העכבר נוספו צלחות באר עמוקה ונלקחו דרך פרוטוקול cPILOT. לבסוף, דגימה אחת המורכבת כבד עכבר שיווי משקל 22-plex מתויג פפטידים הוזרק ספקטרומטר המסה. עוצמת היונים העיתונאית המתאימה לשפע פפטיד בדגימות הוכיחה כי דגימות המעובדות עם המטפל הנוזלי יש CVs נמוך יותר מאשר הפרוטוקול הידני(נתונים לא מוצגים). הפלטפורמה הרובוטית גם שיפרה מאוד את יכולת הרבייה של עיבוד לדוגמה. שכפול וחוסן הם גורמים חשובים מאוד בעת עיבוד מספר גדול של דגימות. שגיאות Pipetting יכול להוביל לפרשנות שגויה מלאה של הנתונים וכאן הפלטפורמה הרובוטית סיפקה וריאציה בין-מדגם נמוך. כמו כן, השימוש בפלטפורמה הרובוטית ל-CPILOT הפחית את הזמן הנדרש להכנת דגימות. לדוגמה, לאחר פיתוח השיטה האוטומטית, נדרשו 2.5 שעות כדי לעבד 22 דגימות בהשוואה ל-7.5 שעות עבור CPILOT ידני. ניסויים הם מתמשכים במעבדה שלנו כדי להעריך עוד יותר השוואות של זרימות עבודה ידניות ואוטומטיות של CPILOT. בהתבסס על דיווחים קודמים מהמעבדה שלנו, CV%'s של עוצמת יון כתב חלבון בcPILOT ידני היו בממוצע 20% עם כמה חריגים עולה עלערך זה 12.
cPILOT היא אסטרטגיית נגזרות כימית ברמת הפפטיד, שניתן להשתמש בה עבור כל סוג מדגם כגון תאים, רקמות ונוזלי גוף. cPILOT מציעה מולטיפלקס מדגם משופר ועם שילוב של אוטומציה יכול להקל על מולטיפלקס מדגם בתפוקה גבוהה פרוטאומיקה. תפוקה זו נחוצה כדי לקדם עוד יותר מחלות והבנה ביולוגית וגילוי סמן ביולוגי.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מכירים בקרנות סטארט-אפ של אוניברסיטת ונדרבילט ובפרס NIH (R01GM117191) ל-RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
| 2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
| C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
| Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
| Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
| Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
| Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
References
- Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
- Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
- Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
- Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
- King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
- Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).
