Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Automatisert prøvemult multipleksing ved hjelp av kombinert forløper isotopisk merking og isobar tagging (cPILOT)

Published: December 18, 2020 doi: 10.3791/61342
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Chemistry, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Memory & Alzheimer's Center, Vanderbilt University Medical Center, 3Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University Medical Center, 4Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Kombinert forløper isotopisk merking og isobar merking (cPILOT) er en forbedret prøve multipleksing strategi som er i stand til å øke antall prøver som kan analyseres samtidig med tilgjengelige isobariske koder. Inkorporering av en robotplattform har økt eksperimentell gjennomstrømning, reproduserbarhet og kvantitativ nøyaktighet.

Abstract

Vi har introdusert en høy gjennomstrømning kvantitativ proteomics arbeidsflyt, kombinert forløper isootopisk merking og isobarisk merking (cPILOT) i stand til multipleksing opp til 22 eller 24 prøver med tandem massekoder eller isobar N, N-dimetyl leucin isobaric koder, henholdsvis i et enkelt eksperiment. Denne forbedrede prøven multipleksing reduserer betydelig massespektrometri oppkjøpstider og øker nytten av de dyre kommersielle isobariske reagenser. Den manuelle prosessen med prøvehåndtering og pipetteringstrinn i strategien kan imidlertid være arbeidskrevende, tidkrevende og innføre prøvetap og kvantitative feil. Disse begrensningene kan overvinnes gjennom inkorporering av automatisering. Her overførte vi den manuelle cPILOT-protokollen til en automatisert væskehåndteringsenhet som kan forberede store prøvenumre (f.eks. 96 prøver) parallelt. Samlet sett øker automatiseringen gjennomførbarheten og reproduserbarheten til cPILOT og muliggjør bred bruk av andre forskere med sammenlignbare automatiseringsenheter.

Introduction

Massespektrometri (MS)-baserte proteomics er et uunnværlig forskningsverktøy for å identifisere sykdomsspesifikke biomarkører, forstå sykdomsprogresjon og skape fører for terapeutisk utvikling. Dette kan oppnås fra en rekke sykdomsrelaterte kliniske prøver som blodserum/plasma, proksimale væsker ogvev 1,2. Proteomics biomarkør oppdagelse og validering har nylig fått betydelig vurdering på grunn av kraften i prøve multiplexing strategier3,4. Eksempelmult multipleksing er en teknikk som muliggjør samtidig sammenligning og kvantifisering av to eller flere prøveforhold innenfor en enkelt MS-injeksjon5,6. Prøve multipleksing oppnås ved barkoding peptider eller proteiner fra flere prøver med kjemiske, enzymatiske, eller metabolske koder og få MS-informasjon fra alle prøver i en enkelt MS eller MS / MS eksperiment. Blant de tilgjengelige isobariske kodene er isobariske merking reagenser (iTRAQ), kommersielle tandem massekoder (TMT), og i huset syntetisert isobar N, N-dimetyl leucin (DiLeu) reagenser med evner opp til 16-plex7 og 21-plex8, henholdsvis.

Kombinert forløper isotopisk merking og isobar merking (cPILOT) er en forbedret prøve multipleksing teknologi. cPILOT kombinerer isotopisk merking av peptid N-termini med lys [−(CH3)2] og tung [−(13C2H3)2] isotoper ved lav pH (∼2,5), som holder lysinrester tilgjengelig for etterfølgende høy pH (8,5) isobar merking ved hjelp av TMT, DiLeu eller iTRAQ merking3,9,10,11,12,13,14. Den doble merkingsordningen for cPILOT-strategien er avbildet i supplerende figur 1 med to prøver ved hjelp av et eksempel peptid. Nøyaktigheten og presisjonen til TMT-basert kvantifisering på MS2-nivå kan kompromitteres på grunn av tilstedeværelsen av forurensende koisoforierte og samtidige fragmenterte ioner som bese som interferenseffekt15. Denne begrensningen i unøyaktige reporterionforhold kan overvinnes ved hjelp av tribrid Orbitrap massespektrometre. Interferenseffekten kan for eksempel overvinnes ved å isolere en topp i et dimetylert par på MS1-nivå i massespektrometeret, utsette den lette eller tunge toppen for MS2-fragmentering i den lineære iionfellen og deretter utsette det mest intense MS2-fragmentet for HCD-MS3 for å oppnå kvantitativ informasjon. For å øke sjansene for å velge peptider uten lysin aminer tilgjengelig for å generere reporter ioner, en selektiv MS3 oppkjøp basert på y-1 fragment kan også brukes og er en tilnærming som kan resultere i en høyere prosentandel av peptider kvantifiserbar med cPILOT9. Kombinasjonen av lett og tung merking øker prøve multipleksing evner av en faktor på 2x til det oppnås med individuelle isobariske koder. Vi har nylig brukt cPILOT til å kombinere opptil 24 prøver i et enkelt eksperiment med DiLeu reagenser16. I tillegg cPILOT har blitt brukt til å studere oksidative post-translasjonellemodifikasjoner 14 inkludert protein nitrasjon17,andre globale proteomer9, og har vist anvendelser på tvers av flere vevsprøver i en Alzheimers sykdom mus modell11.

Robust prøveklargjøring er et kritisk skritt i et cPILOT-eksperiment og kan være tidkrevende, arbeidskrevende og omfattende. Forbedret prøve multipleksing krever omfattende pipettering og dyktige laboratoriepersonell, og det er flere faktorer som kan påvirke reproduserbarheten av eksperimentet. For eksempel er nøye håndtering av prøver nødvendig for å sikre lignende reaksjonstider for alle prøver og for å opprettholde passende buffer pH for lette og tunge dimetylert prøver. Videre kan manuell fremstilling av titalls til hundrevis av prøver introdusere høy eksperimentell feil. Derfor, for å redusere variasjonen i prøveforberedelsen, forbedre kvantitativ nøyaktighet og øke eksperimentell gjennomstrømning, utviklet vi derfor en automatisert cPILOT-arbeidsflyt. Automatisering oppnås ved hjelp av en robotvæskehåndteringsenhet som kan fullføre mange aspekter av arbeidsflyten (figur 1). Prøvepreparat fra proteinkvantifisering til peptidmerking ble utført på en automatisert væskebehandling. Den automatiserte væskebehandlingen er integrert med et positivt trykkapparat (PPA) for bufferutveksling mellom SPE-platene (solidfase), orbital shaker og en varme-/kjøleenhet. Robotplattformen inneholder 28 dekksplasseringer for å romme plater og buffere. Det er to pods med en griper for å overføre platene innenfor dekksplasseringene: et 96-kanals fast volumpipetteringshode (5-1100 μL) og 8-kanals variable volumpromer (1-1000 μL). Robotplattformen styres ved hjelp av en programvare. Brukeren må være profesjonelt opplært før du bruker robotvæskebehandlingen. Den nåværende studien fokuserer på å automatisere den manuelle cPILOT-arbeidsflyten, som kan være arbeidsintensiv for behandling av mer enn 12 prøver i ett enkelt parti. For å øke gjennomstrømningen av cPILOT-tilnærmingen11,overførte vi cPILOT-protokollen til en robotvæskebehandling for å behandle mer enn 10 prøver parallelt. Automatiseringen muliggjør også lignende reaksjoner for hver prøve parallelt under ulike trinn i prøveforberedelsesprosessen, noe som krevde høyt utdannede brukere å oppnå under manuell cPILOT. Denne protokollen fokuserer på implementeringen av den automatiserte væskehåndteringsenheten for å utføre cPILOT. Den nåværende studien beskriver protokollen for bruk av dette automatiserte systemet og demonstrerer ytelsen ved hjelp av en 22-plex "proof-of-concept" analyse av museleverhomogenater.

Protocol

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Pittsburgh. En mannlig kontrollmus (C57/BLJ) ble kjøpt kommersielt og plassert i Division of Laboratory Animal Resources ved University of Pittsburgh. Mus ble matet standard gnager laboratorium chow ad libitum og holdt i en 12 h lys / mørk syklus. Levervev ble høstet og lagret ved -80 °C.

1. Protein ekstraksjon

MERK: Disse trinnene utføres manuelt.

  1. Vask museleveren (100 mg) med saltvann og homogenat med 500 μL 8 M urea ved hjelp av en mekanisk homogenisator ved hjelp av lysingmatrise A perler for 4 m/s i 20 s.
    MERK: I denne studien ble protease- eller fosfatasehemmere ikke lagt til, men kan legges til bufferen om nødvendig, basert på forsøket. Også proteinekstraksjonstrinn kan justeres tilsvarende for ulike prøvetyper.
  2. Overfør vevet homogenat til en ny mikrocentrifuge rør, skyll og kombinere lysing rør med 100-500 μL PBS med 8 M urea.
  3. Sentrifuge homogenisert vev (12,800 x g,4 °C, og 15 min) og samle supernatant.
    MERK: Resten av trinnene utføres på robotvæskebehandlingen som er tilgjengelig i brukerens laboratorium. Væskebehandleren må være i stand til å aspirere og dispensere buffere fra og til ANCI-spesifiserte platetyper, med minimal operatørdeltakelse.
  4. Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en bicinchoninsyreanalyse (BCA) i henhold til produsentens instruksjoner.
  5. Slå på PPA, varme-/kjøleapparatet og vakuumpumpene, og koble alt tilbehøret til væskehåndtereren. Væskebehandleren viser et blått lys når det er koblet til datamaskinen og klar til bruk.
  6. For å reagensplate 1 (96 brønnplate), tilsett 30 μL på 25 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL cystein og 25 mM 30 μL iodoacetamid (IAA) til radene 1, 2 og 3.
  7. Tilsett 8 M urea og 20 mM Tris med 10 mM CaCl2 (pH 8.2) i en reservoarplate. Tilsett 500 μL av 5 % maursyre til 2 ml dyp brønnplate, 20 μL trypsin til rad 1 av trypsinplaten og plasser på dekksstedet som spesifisert av metoden.
    MERK: IAA og trypsin ble lagt til 96-brønnplaten før de la til prøven.
  8. Aliquot 300 μL av leveren homogenat i en 500 μL rør og plasser på en 2 ml dyp brønnplate og plasser ved 4 ° C til starten av protokollen. For dette eksperimentet ble 22 aliquots generert fra enkeltleverhomogenatet.
    MERK: Tilsett en intern kvalitetskontrollstandard (f.eks. storfe alfa-casein eller annet eksogent protein) med forholdet 1 μg standard: 100 μg proteinprøve.
  9. Definer volumet av buffere som skal legges til eksemplene etter variabelnavn og verdi i henhold til tabell 1. Basert på BCA angir du volumet av prøve- og normaliseringsbuffer (8 M urea) på et regneark og legger ved programvaren (tabell 2).
    MERK: Ytterligere fortynning med buffer kan være nødvendig hvis proteinkonsentrasjonen er for høy. De resulterende konsentrasjonene for prøve fra levervevet var 10 μg/μL. Volumet av buffere ble optimalisert for 100 μg protein.
  10. Fjern prøverør fra 4 °C, plasser på den angitte dekkplasseringen til den automatiserte væskehåndtereren, og la det varme i 10 min.
  11. Åpne metoden og følg instruksjonene for å plassere de nødvendige tipsene (1070, 90 og 230 μL), og labware i ønsket posisjon. Når alle labware og tips er på plass, krysssjekk med den endelige dekk layout og klikk Neste for å fortsette protokollen.
    MERK: Det veiledede oppsettet informerer brukeren om å legge til et nødvendig buffervolum i den spesifikke labwareen, avhengig av protokollen og dekksplasseringen som skal oppbevares.

2. Prøvereduksjon, alkylasjon og fordøyelse

  1. Legg 230 μL-spisser og aspirer 90 μL på 8 M urea fra reservoaret og dispenser til rad 1 av den svarte 2 ml dype brønnplaten. Losse tipsene. Gjenta dette trinnet til 8 M urea legges til alle brønnene som tilsvarer de 22 prøvene.
    MERK: Denmetningsbufferen slapper av proteinets tredimensjonale struktur for å gi den primære strukturen slik at trypsin kan virke og bryte proteinet effektivt. Den 8-kanals pipette kan aspirere forskjellige volumer for 8 kanaler og kan dispensere til forskjellige steder i labware. I dette trinnet alle kanalene aspirert det samme volumet som definert i programvaren.
  2. Etter å ha lagt til denaturation buffer, laste 90 μL tips og aspirere 10 μL (tilsvarer 100 μg) av musen leveren homogenate ved hjelp av 8-kanals pipette til svart 2 ml dyp brønnplate. Losse tipsene. Gjenta dette trinnet til alle de 22 prøvene overføres.
  3. Etter hver overføring, utfør et blandingstrinn for å aspirere og dispensere 50 μL av brønninnholdet tre ganger for å sikre blanding av proteinet med bufferen for å vise et 1:1-forhold.
    MERK: Fjern lagerhomogenateprøven og plasser i -80 °C.
  4. For å redusere denaturerte proteinene, legg i en rad med 90 μL-spisser og aspirer 3 μL DTT fra reagensplaten 1. Dispenser DTT til rad 1 og 2 av den svarte 2 ml dype brønnplaten og loss spissene.
    MERK: Proteinet: DTT molarforholdet opprettholdes ved 1:40 for reduksjon av disulfidbindinger. Beregningen for molarforholdet er basert på proteinmassen av storfe serumalbumin (BSA), som er 66,5 x 103 g / mol.
  5. Forsegle prøveplaten med aluminiumsfolie og inkuber ved 37 °C i 600 s ved 300 o/min.
  6. Tilsett 30 μL på 0,25 M IAM i rad 3 av reagensplaten 1 like før bruk og plasser på dekk. Løsne prøveplaten og gå tilbake til decket.
    MERK: IAM er lysfølsom.
  7. Legg i én rad med 90 μL-spisser, aspirer 6 μL IAM fra reagensplaten 1 på rad 3, og dispenser til rad 1 av prøveplaten. Losse tipsene.
    MERK: Proteinet: IAM molarforholdet opprettholdes kl. Denne reaksjonen må gjøres i mørket.
  8. Tetningsprøveplaten og inkuber ved 4 °C i 30 min ved 300 o/min på varme-/kjøleenheten.
    MERK: Forsegling av platen utføres for å hindre at prøven lyser, fordamper og søler fra brønnen.
  9. Løsne prøveplaten og legg en rad med 90 μL-spisser og aspirer 5 μL cystein fra reagensplaten 1 på rad 2. Dispenser til rad 1 og 2 av prøveplaten og loss spissene. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
    MERK: Proteinet: L-cystein molar forholdet opprettholdes kl 1:40.
  10. Plasser prøveplaten på orbital shaker for å utføre en tidsstrist på 1800 rpm i 30 min.
  11. Tilsett 800 μL μL 20 mM Tris buffer med 10 mM CaCl2 (pH 8.2) til hver brønn av prøveplaten for å fortynne ureakonsentrasjonen til 2 M. Loss spissene.
    MERK: Trypsinaktiviteten er hindret ved høyere ureakonsentrasjoner, og derfor må den reduseres til mindre enn 2 M. Denne studien ble utført med et protein for å trypsin molar ratio på 50: 1 for 14 h.
  12. Tilsett 20 μL trypsin i rad 1, kolonne 1-12 av en 96 brønnplate og plasser på et angitt sted på dekk.
  13. Legg i én rad med 90 μL-spisser, aspirer 2 μL trypsin fra trypsinplaterad 1, og dispenser til rad 1 og 2 på prøveplaten. Losse tipsene.
  14. Tetningsplaten og inkuber i 14 timer ved 37 °C ved 600 o/min på varme-/kjøleenheten.
  15. Etter inkubasjon, unseal prøveplaten og tilsett 5% maursyre til rad 3, kolonne 1- 12 av en dyp brønnoppsamlingsplate og legg den på spesifisert dekk.
  16. Stopp fordøyelsen ved å tilsette 150 μL av 5 % maursyre fra rad 3 på maursyreplaten og dispenser til prøveplaten på rad 1 og 2. Losse tipsene.

3. Avsalting trinn 1

  1. Avsalt peptidene med SPE-plate som inneholder 20 mg Targa C-18 materiale. Fest volumet for hver bufferutveksling som 600 μL og fest trykket til 100 mbar.
  2. Legg 1070 μL-spissene og aspirer 600 μL acetonitril og dispenser til radene 1 og 2 av SPE-platen. Plasser SPE-platen på PPA og trykk på.
  3. Bruk de samme spissene, aspirer 600 μL acetonitril og dispenser til radene 1 og 2 av SPE-platen. Plasser SPE-platen på PPA og trykk på.
    MERK: Gjennomstrømningen kan dreneres til avfall ved hjelp av en sugepumpe.
  4. Legg 1070 μL-spisser og aspirer 600 μL buffer A (100 % vann i 0,1 % maursyre) og dispenser til radene 1 og 2 av SPE-platen. Plasser SPE-platen på PPA og trykk på.
    MERK: Hvis buffervolumet ikke reduseres betydelig, prøv å øke trykket eller tiden.
  5. Legg 2 rader med 1070 μL-spisser, aspirer 534 μL med fordøyde prøver, og dispenser til radene 1 og 2 av SPE-platen. Plasser SPE-platen på PPA og trykk på. Gjenta dette trinnet til alle prøvene er lastet inn.
    MERK: Siden det totale volumet etter tilsetning av maursyre vil være 1068 μL og prøvene ble lagt til i to passeringer.
  6. Legg 2 rader med brukte 1070 μL-spisser, aspirer 600 μL buffer A, og dispenser til radene 1 og 2 av SPE-platen. Plasser SPE-platen på PPA og trykk på.
  7. Gjenta trinnet ovenfor én gang for å rengjøre prøven.
  8. Legg 1 rad med 1070 μL-spisser, aspirer 600 μL ACN: Vann (60:40) og dispenser til radene 1 og 2 av SPE-platen. Plasser SPE-platen på toppen av en oppsamlingsplate for å elute peptidene ved hjelp av PPA og trykk.
  9. Gjenta trinnet ovenfor for å elute peptidene i oppsamlingsplaten. Tørk oppsamlingsplaten til tørrhet og oppbevar ved -80 ° C til videre behandling.

4. Dimetylering Merking (peptid N-termini)

  1. Plasser de nødvendige tipsene (1070, 90 og 230 μL), og labware i ønskede posisjoner i programvaren. Når alle labware og tips er på plass, krysssjekk med den endelige dekk layout og klikk Neste for å fortsette protokollen.
  2. For å reagensplate 2, tilsett 450 μL μL av 1 % eddiksyre, 50 μL lysformelldehyd (CH2O), 50 μL tung formaldehyd (henholdsvis 13CD2O) og 150 μL maursyre til rad 1, 2, 3 og 4.
  3. For å reagensplate 3 tilsett 50 μL lys CB, 50 μL tung CB, til radene 1 og 2 og 50 μL Ammoniakk til rad 3 og 4.
  4. Legg 2 rader med 230 μL-spisser og aspirer 100 μL 1 % eddiksyre fra rad 1 av reagensplaten 2 og dispenser til de tørkede peptidene i prøveplaten 2 (oppsamlingsplate fra avsaltingstrinnet) radene 1 og 2 og utfør en tidsstristing i 5 min ved 1800 o/min.
  5. Legg 90 μL-spisser og aspirer 16 μL på 60 mM (4 %) 2LMO (37 % mt/v) fra 2.rad på reagensplaten 2 og dispenser til 1.rad på prøveplaten. Losse tipsene.
  6. Legg i 1 rad med 90 μL-spisser og aspirer 16 μL på 60 mM (4 %) 13.10. CD2O (20 % wt/v) fra rad 3 på reagensplaten 2 og dispenser til rad 2 på prøveplaten. Losse tipsene.
    MERK: I denne studierad 1 tilsvarer lys og rad 2 tilsvarer tunge dimetylerte prøver (se figur 1).
  7. Legg 2 rader med 90 μL-spisser og aspirer 16 μL på 24 mM NaBH3CN og 24 mM NaBD3CN fra rad 1 og 2 av reagensplaten 3 og dispenser til henholdsvis rad 1 og 2 på prøveplaten.
  8. Losse spissene og utføre en tidsstrist i 15 min ved 1800 rpm ved hjelp av orbital shaker.
    MERK: Tilsetning av natriumcyanoborohydrid initierer reaksjonen slik at reaksjonen dermed reduserer variabiliteten mellom eksperimenter dette trinnet utføres én gang per batch.
  9. Legg 2 rad med 90 μL-spisser og aspirer 32 μL 1 % ammoniakk (~28-30 % v/v) fra radene 3 og 4 i reagensplaten 3 og dispenser til rad 1 og 2 på prøveplaten 2. Losse tipsene.
    MERK: Hvis du legger til ammoniakk, stopper reaksjonen dermed for å redusere variasjonen mellom eksperimenter dette trinnet utføres én gang per batch.
  10. Kombiner like store mengder lett og tung (1:1) dimetylert peptider til en ny 2 ml dyp brønnplate for avsalting.
    MERK: I denne studien ble 90 μL av brønninnholdet fra rad 1 kombinert med 90 μL på rad 2 fra prøveplate 2 til en ny 2 ml oppsamlingsplate (prøveplate 3). Forholdet mellom lys: tung blanding avhenger av eksperimentell protokoll, i denne studien ble det brukt et 1:1-forhold.
  11. Legg 2 rader med 230 μL-spisser og aspirer 32 μL 5 % maursyre til de kombinerte prøvene og utfør en tidsinnstristing i 30 s ved 1800 o/min.
    MERK: Dimetyleringseffektiviteten avhenger av pH-en til reaksjonsblandingen, og enhver endring i buffer pH vil resultere i ufullstendig merking av peptid N-termini. Dimetyleringseffektiviteten bør være større enn 97 % når den søkes som dynamisk endring ved peptid N-termini. I denne studien var merkingseffektiviteten til lette og tunge peptider henholdsvis 99,7 % og 99,5 %.

5. Avsalting trinn 2

  1. Utfør prøvedesalting som ligner på desalt trinn 1 for de kombinerte prøvene.
  2. Tørk prøvene i prøveplaten med en hastighetsvac og oppbevar ved -80 °C til videre behandling.

6. Isobar merking (Lys rester)

  1. Følg oppsettet av veiledet labware og plasser de nødvendige tipsene (1070, 90 og 230 μL), med passende buffere. Når alle labware og tips er på plass, krysssjekk med den endelige dekk layout og klikk Neste for å fortsette protokollen.
  2. Tilsett 250 μL på 100 mM trietyl ammoniumbikarbonat (TEAB), 30 μL hydroksylamin (10 % w/v) i rad 1 og 2 reagensplate 4. Plasser TMT-rørene på 2 ml dypbrønnplate i henhold til regnearket i tabell 3.
  3. Oppbevar et tomt 1,5 ml rør i en rørstativholder for å samle de merkede peptidene. Plasser den tørkede prøveplaten på P9- og TMT-behandlingsplaten ved P14.
  4. For å rekonstituere peptidene, legg i 230 μL-spisser og aspirer 100 μL på 100 mM trietyl ammoniumbikarbonat (TEAB) buffer (pH ~ 8,5) fra rad 1 på TEAB-plate og dispenser til tørkede peptider på rad 3 av prøveplaten 3. Plasser platen på orbital shaker i 30 s ved 1800 omdr./min.
    MERK: Rekonstituer 100 μg dimetylert peptider i en konsentrasjon på 1 μg/μL.
  5. Legg 90 μL-spisser og aspirer 10 μL vannfri acetonitril fra H12 på TMT-platen og dispenser inn i hvert av de tørkede TMT-rørene.
  6. Fjern TMT rør, vortex, og rask spinne rørene og gå tilbake til dekk i dyp brønnplate.
  7. Legg 1 rad med 90 μL-spisser og aspirer 12,5 μL av de kombinerte dimetylert peptider og dispenser til rad 1 av TMT behandlingsplaten. Losse tipsene.
    MERK: TMT: peptid forholdet ble opprettholdt på 1:8 for dette eksperimentet.
  8. Legg 1 rad med 90 μL-spisser og aspirer 10 μL TMT og dispenser til rad 1 av TMT-behandlingsplaten. Losse tipsene, utfør en tidsstrist i 1 time ved 1800 omdr./min.
  9. Legg 1 rad med 90 μL-spisser og aspirer 8 μL hydroksylamin (10 % w/v) fra rad 2 ved TEAB-platen og dispenser til rad 1 på TMT-behandlingsplaten. Losse tipsene, utføre en tidsstristing i 15 min ved 1800 rpm.
  10. Kombiner 30,5 μL av TMT-merkede peptider fra TMT-behandlingsplaten til 1,5 ml rør. Last ut tipsene etter hver overføring.
  11. Fjern røret med de samlede prøvene og tørk for å fordampe acetonitril. Rekonstituerte peptider i 0,2 ml vann i 0,1 % maursyre og gå tilbake til dekket.
    MERK: Merkingseffektiviteten til isobar merking er også pH-spesifikk, og merkeeffektiviteten bør være over 98 % i henhold til produsentens instruksjoner. I denne studien var TMT merking effektivitet av lysin avsluttet lys og tunge peptider var 99,4% og 99,5% henholdsvis.

7. Avsalting trinn

  1. Utfør prøvedesalting som ligner på desalt 1 for en prøve.
  2. Tørk prøvene og oppbevar i -80 °C til analyse.

8. Flytende kromatografi–Tandem massespektrometri (LC-MS/MS) og MS3

  1. Rekonstituer peptidene i MS-graders vann med 0,1 % FA for å oppnå konsentrasjon på ~1 μg/μL. Filtrer prøver med mikrocentrifugerør som inneholder et 0,65 μm filter. Sentrifugepeptider ved 12 000 x g i 3 min og plasser strømmen gjennom i et automatisk prøvehette hetteglass.
    MERK: Peptidkonsentrasjonen kan bekreftes på dette stadiet hvis ønskelig. Peptidene må rekonstitueres i LC-MS-graders vann og utsettes for en BCA peptidanalyse. I denne studien ble peptid BCA-analysen ikke utført, og alle peptidmengder var basert på første protein BCA-analyse.
  2. Klargjør mobilfasebufferne på følgende måte: 100 % (v/v) vann med 0,1 % FA (A) og 100 % ACN med 0,1 % FA (B).
  3. Injiser 1 μL prøve på en fellesøylenke fullpakket med 2 cm C18 materiale (3 μm, 100 Å porestørrelse).
    MERK: Prøverengjøring på fellen er som følger: 10 min, 100% A; 2 μL/min ved hjelp av et 2D flytende kromatografisystem.
  4. Kjør den analytiske separasjonsmetoden. Bruk en 100 μm i.d. x 26 cm laser trukket-tip smeltet silika kapillær kolonne fullpakket med C18 materiale (2,5 μm, 100 Å). Gradienten er: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min.
  5. Kjør datainnsamlingen for massespektrometeret mens den analytiske separasjonsmetoden kjører.
    1. Bruk følgende parametere for MS-undersøkelsesskanningen: 375-1500 m/z, 120 000 oppløsning, syklustid 3 s (topphastighet), automatisk forsterkningskontroll (AGC) mål 4.0e5, maksimal injeksjonstid 50 ms.
    2. Bruk følgende parametere for CID–MS/MS med ionfelle: Dataavhengig anskaffelse (DDA)-skanninger per resultat, 2 m/z isolasjonsbredde, 35 % normalisert kollisjonsenergi (NCE), 0,25 aktivering q, 10 ms aktiveringstid, 1,0e4 AGC, 100 ms maksimal injeksjonstid.
    3. Bruk følgende parametere for HCD–MS3 SPS 10: Skanneområde 100-400 m/z, antall avhengige skanninger 10, AGC 5.0e4, maksimal injeksjonstid 118 ms, HCD kollisjonsenergi 55 %, MS2-isolasjonsvindu 2.

9. Dataanalyse

  1. Søk generert RAW-filer for listen over proteiner og peptider ved hjelp av en proteinanalyse programvare mot en passende database.
    MERK: RAW-filene som genereres i denne studien ble søkt mot en mus Uniprot database.
  2. Siden det er både lett og tung merking i en RAW-fil, kan du søke i hver fil med to arbeidsflyter etter lette og tunge dimetylerte peptider.
  3. Søk i RAW-filer mot mus Uniprot database (07/13/2019) med 53035 sekvens med følgende parametere: trypsin cleavage med maksimalt to tapte cleavages, peptid med minimum 6 aminosyrer lengde, 15 ppm foreldre massetoleranse, 1 Da fragmentering toleranse Statiske modifikasjoner: lett dimetylering (+28.031, peptid N-terminus) eller tung dimetylering (+36.076 Da, peptid N-terminus), karbamifenyl (+57.021 Da, C), Dynamiske modifikasjoner: oksidasjon (+15.995 Da, M), 11-plex isobaric tag (229.163 Da, K), 1% FDR, reporter ion kvantifisering med 30 ppm peak integrasjon toleranse, mest trygg centroid for integrering metode.
    MERK: Den tunge dimetylert toppen inkluderer også en annen modifikasjon som er ~ 7 Da (+ 35.069 Da, peptid N-terminus) fra den lette dimetyated toppen og derfor en annen søkenode bør innlemmes for å inkludere denne endringen også.
  4. Utfør reporterion kvantifisering basert på intensiteten, 65% SPS massekamp, gjennomsnittlig S / N-forhold 10, isotopisk korreksjon, normalisering og skalering ble ikke utført.
    MERK: Normalisering og skalering kan utføres basert på total peptidmengde eller et bestemt protein som legges til prøven. QC-eksempler kan også inkluderes i kanalene for normalisering mellom partier eller intrabundne partier basert på en tosidig intern referanseskalering18. De isotopiske forurensningene av forskjellige TMT-kanaler ble ikke gitt til søket, brukerne rådes til å legge til isotopforurensning av forskjellige reporterioner.

Representative Results

Figur 2 viser representative MS-data for et peptid identifisert i alle 22 reporterionkanaler fra et 22-plex cPILOT-eksperiment, inkludert arbeidsflyt replikerer. Figur 2 (øverst) viser et dobbelt ladet topppar atskilt med 4 Da m/z-avstand som indikerer en enkelt dimetylgruppe innlemmet i peptidet. De lette og tunge dimetylerte toppparene ble isolert og fragmentert uavhengig for å gi sekvensen av peptidet. Sekvensen av peptid er G(dimethyl)AAELMQQK (TMT-11plex) og tilsvarer proteinet Betaine-homocystein S-metyltransferase. De mest intense fragmentionene for både de lette og tunge dimetylerttoppene (ikke vist)ble ytterligere isolert for MS3 fragmentering og reporterionene (m/z 126-131) er vist i figur 2 (bunn). Reporterionintensitetene er direkte proporsjonale med peptidoverfloden i prøven. Peptid overflod av prøvene innebærer pipettering evne til robotplattformen er ganske ensartet over de 22 prøvene. Totalt resulterte dette 22-plex cPILOT-eksperimentet i 1326 (1209-lette/1181-tunge) proteiner som følge av 3098 (6137 lys/5872 tunge) peptider (tabell 4). Figur 3 viser boksplottet av log10 overflod versus total reporter ion intensiteter på tvers av alle de 22 kanalene som viser mindre inter-well / inter-sample variasjon. Evalueringen av den totale automatiseringen ble gjort ved å undersøke feilen i reporterion overflod over hvert protein i de 22 prøvene. Figur 4 viser at prøvebehandling med robotplattformen resulterte i svært lave CV-verdier. Spesielt, på tvers av 3098 peptider identifisert gjennomsnittlig CV i reporter ion overflod var 12,36 % og 15,03 % for lette og tunge dimetyated peptider, henholdsvis. Blant disse peptidene 2032 av disse peptidene hadde reporter ion signal over minimumsterskelen og ble ansett kvantifiserbar.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentell arbeidsflyt for å behandle 22 prøver parallelt med en automatisert cPILOT-protokoll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Kvantifisering av peptider på tvers av 22 prøver. Eksempel MS (øverst) og MS3 (nederst) spektra av peptid G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) kvantifisert i 22-plex automatisert cPILOT eksperiment for lys dimetylert (nederst til venstre) og tunge dimetyated (nederst til høyre) topper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Box plot av total reporter ion intensiteter versus log10 overflod av 22 prøver ved hjelp av proteome oppdager 2.3. Raw-filen ble søkt to ganger etter lette og tunge peptider, proteiner IDer separat med TMT som dynamisk modifikasjon, lys (+28.031 Da) og tung (+36.076 & +35.069 Da) dimetylering ved peptid N-termini som statisk modifikasjon. Et kombinert søk med alle de ovennevnte modifikasjoner ble kjørt ved hjelp av Proteome Discover 2.3 for å få Log 10 Overflod av peptid intensiteter på tvers av alle kanalene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Fiolin plott av co-effektiv av variasjon av peptid overflod fra oppsummerte reporter ion intensiteter på tvers av kanaler 126-131 m / z. Peptidet ble kvantifisert med en gjennomsnittlig CV-verdi på 12,36 og 15,03 for lette (2373) og tunge (2533) kvantifiserbare peptider. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstall 1. Illustrasjon av cPILOT med ett enkelt peptid. Viser isotoppisk merking av to forskjellige prøver og isobar merking med TMT126,ble den resulterende blandingen injisert til MS for LC-MS3. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Variabelt navn Verdi Beskrivelse
DesaltSamp1 1065 Volum som skal brukes til avsalt trinn 1
DesaltSamp2 392 Volum som skal brukes til avsalt trinn 2
DesaltSamp3 100 Volum som skal brukes til desalt trinn 3
Devmode Falske False vil kutte ned inkubasjonstiden til 30sec- True vil følge inkubasjonstidspunktet i protokollen.
DTTVol 3 Volum av DTT
FilterPlate Targa Plate som brukes til desalting
FilterPlateVol 600 Volum for avsalting
HAWaterWashes Falske Antall vannvasker på SPE-platen
IAMVol 2 Volum av iodoacetamid
PeptidTMTVol 12.5 Volum av peptid for TMT merking
Press 100 mbartrykk ved PPA
TempOffSet 1 Temperaturendring
TMTVol 10 Isobarisk tag volum som skal legges til
TrisVol 800 Volum for å fortynne prøven før fordøyelsen
TrypsinVol 2 Volum av trypsin
BrukPopTimer Sant True viser alternativene for å legge trykk på platen om nødvendig

Tabell 1. Liste over variabler som brukes i automatisert cPILOT-protokoll.

DilKilde DilVel Dest DestWell DilVolume StockKilde Stockwell EksempelVol Eksempelid
8M_Urea 1 Prøver A1 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 1
8M_Urea 1 Prøver A2 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 2
8M_Urea 1 Prøver A3 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 3
8M_Urea 1 Prøver A4 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 4
8M_Urea 1 Prøver A5 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 5
8M_Urea 1 Prøver A6 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 6
8M_Urea 1 Prøver A7 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 7
8M_Urea 1 Prøver A8 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 8
8M_Urea 1 Prøver A9 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 9
8M_Urea 1 Prøver A10 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 10
8M_Urea 1 Prøver A11 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 11
8M_Urea 1 Prøver A12 Inn 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 12
8M_Urea 1 Prøver B1 Leilighet 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 13
8M_Urea 1 Prøver B2 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 14
8M_Urea 1 Prøver B3 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 15
8M_Urea 1 Prøver B4 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 16
8M_Urea 1 Prøver B5 Gjestgiveri 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 17
8M_Urea 1 Prøver B6 Gjestgiveri 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 18
8M_Urea 1 Prøver B7 (andre personer) 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 19
8M_Urea 1 Prøver B8 Gjestgiveri 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 20
8M_Urea 1 Prøver B9 Gjestgiveri 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 21
8M_Urea 1 Prøver B10 Leilighet 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 22
8M_Urea 1 Prøver B11 Leilighet 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 23
8M_Urea 1 Prøver B12 Leilighet 90 Stock_Samples A1 (andre personer) 10 24

Tabell 2. Volum av mus leveren homogenate og 8 M urea.

KildeBrønn KildeBrønn2 Reporter Ion DestWell1 Leilighet DestWell2 Leilighet Volum Eksempelid
A1 (andre personer) C1 (andre personer) 126 A1 (andre personer) E1 10 1
A3 (andre personer) C3 (andre personer) 127N (andre personer) A2 (andre personer) E2 10 2
A5 (andre personer) C5 (andre personer) 127C (andre) A3 (andre personer) E3 10 3
A7 (andre personer) C7 (andre personer) 128N (andre personer) A4 (andre personer) E4 10 4
A9 (andre personer) C9 (andre personer) 128C (andre) A5 (andre personer) E5 10 5
A11 (andre personer) C11 (andre personer) 129. A6 (andre personer) E6 10 6
B2 D2 Leilighet 129C (andre) A7 (andre personer) E7 10 7
B4 (andre personer) D4 130N (andre personer) A8 (andre personer) E8 10 8
B6 Gjestgiveri D6 130C (andre) A9 (andre personer) E9 10 9
B8 Gjestgiveri D8 131. A10 (andre personer) E10 10 10
B10 Leilighet D10 Inn 131C (andre) A11 (andre personer) E11 10 11

Tabell 3. Totalt antall peptider, proteiner og peptidspektrale kamper (PSM).

Automatisert cPILOT
Lys Tunge
Proteiner 1209 1181
Peptider 6137 5872
PsMs 14948 16762

Tabell 4. Barkoding isobariske koder med lette og tunge merkede prøver.

Discussion

cPILOT er en forbedret multipleksstrategi som kan analysere opptil 24 prøver i ett enkelt eksperiment. Multipleksingskapasiteten avhenger av antall tilgjengelige isotopiske og isobariske merkingskombinasjoner. Innføring av TMTpro7, som er i stand til å tagge 16 prøver i enkelt eksperiment, kan presse grensene for cPILOT til 32-plex. cPILOT består av flere pipetteringstrinn og krever omfattende pleie- og brukerferdigheter for å utføre prøveklargjøring. Selv med en ekspertbruker er manuelle feil uunngåelige, noe som inviterer til bruk av robotplattformer til å behandle prøver i cPILOT-strategien. Siden cPILOT benytter pH-avhengig merking av peptidene, må pH opprettholdes for lyset og det tunge dimetylertsettet med prøver. Mildt sur-grunnleggende pH kan resultere i dimetylering av både N-termini og lysinrester. En fordel med cPILOT er at det krever bare halvparten av isobariske koder siden peptid N-termini er opptatt med dimetylgrupper. Dette gir et større antall prøver å bli merket til halve prisen. Håndtering av større utvalgsnumre krever at reagenseksponeringstidene er like for den første og den siste prøven i en satsvis. En pipettedispenser som kan romme opptil 32 prøver parallelt, kan best oppnås ved bruk av robotvæskehåndteringsenheter.

For å behandle flere eksempler av cPILOT ble den manuelle arbeidsflyten endret for å innlemme automatisering. Robotvæskehåndteren som brukes i denne studien har to pods med 96-kanals og 8-kanals pipetteringsevner, med en griper for å plassere platene på de tilgjengelige 28 dekksstedene. Væskehåndtereren er integrert med et positivt trykkapparat, orbital shaker og en enhet for å varme/kjøle prøver i 96-brønnplaten. Det positive trykkapparatet bidrar til å utføre bufferutvekslinger i SPE-platene under opprydding, mens orbital shakeren bidrar til å virvle/ blande prøvene. Robotplattformen ble programmert til å aspirere og dispensere buffere og prøver til 96-brønnsplater, inkubere, vortexprøver og overføringsplater. Væsker med forskjellige viskositeter, som acetonitril og vann, krever spesifikke pipetteringshensyn som også kan programmeres inn i metoden.

CPILOT-arbeidsflyten, fra BCA-proteinkvantifisering til merking av peptider med isobariske koder (det vil si TMT), ble utført på væskebehandlingssystemet. Den komplette protokollen ble skalert til å bruke 96 dype brønnplater som kan holde 2 ml per brønn. Bufferne ble forberedt før starten av eksperimentet og lagt til 96 brønnplaten for å tillate parallell prøvebehandling. I den nåværende studien ble 22 arbeidsflyttrans repliker av musleverhomogenat lagt til de dype brønnplatene og tatt gjennom cPILOT-protokollen. Til slutt ble en enkelt prøve bestående av 22-plex equimolar muslevermerket peptider injisert til massespektrometeret. Reporter ion intensiteter tilsvarende peptid overflod i prøvene viste at prøver behandlet med væske handler har lavere CVer enn den manuelle protokollen (data ikke vist). Robotplattformen forbedret også reproduserbarheten ved prøvebehandling. Reproduserbarhet og robusthet er svært viktige faktorer ved behandling av et stort antall prøver. Pipetteringsfeil kan føre til fullstendig feiltolkning av dataene, og her ga robotplattformen lav inter-sample variasjon. Også ved hjelp av robotplattformen for cPILOT reduserte tiden det tar å forberede prøver. For eksempel, etter å ha utviklet den automatiserte metoden, krevde det 2,5 t for å behandle 22 prøver i forhold til 7,5 t for manuell cPILOT. Eksperimenter pågår i laboratoriet vårt for å evaluere sammenligninger av de manuelle og automatiserte cPILOT-arbeidsflytene ytterligere. Basert på tidligere rapporter fra vårt laboratorium, var CV%s av proteinreporterionintensiteter i den manuelle cPILOT i gjennomsnitt 20% med noen outliers som overstiger denne verdien12.

cPILOT er en kjemisk derivatiseringsstrategi på peptidnivå, som kan brukes til enhver prøvetype som celler, vev og kroppsvæsker. cPILOT tilbyr forbedret prøveplumksering, og med inkorporering av automatisering kan det lette multiplummering av prøve multiplekser med høy gjennomstrømning i proteomics. Denne gjennomstrømningen er nødvendig for å fremme sykdom og biologisk forståelse og biomarkøroppdagelse.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Vanderbilt University Start-up Funds og NIH award (R01GM117191) til RASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
2 ml black deep well plate Analytical Sales and Services, Inc. 59623-23BKGC Any brand of black 96-well plate is sufficient
2 ml clear deep well plate VWR 75870-796
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Agilent 500µL plate Agilent 203942-100 Reagent plate for adding buffers
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Analytical balance Mettler Toledo AL54
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Biomek i7 hybrid Beckmann Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) Bruker This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
Centrifuge with plate rotor Thermo Scientific 69720
Micro 21R Centrifuge Sorval 5437
Dionex 3000 UHPLC Thermo Scientific This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass Spectrometer Thermo Scientific This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) Thermo Fisher Scientific 90061
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific
Reservior plate 200ml Agilent 204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
Targa 20 mg SPE plates Nest Group, Inc. HNS S18V These are C18 cartridges
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Tris Biorad 161-0716
Biomek 24-Place Tube Rack Holder Beckmann 373661
Urea Biorad 161-0731
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  2. Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
  3. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  4. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  5. Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  8. Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
  9. Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  10. Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  11. King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
  12. King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
  13. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  14. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
  15. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  16. Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
  17. Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  18. Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).

Tags

Kjemi Utgave 166 Høy gjennomstrømming Proteomics Dimethylation cPILOT robot væske handler Automatisering Isobaric Tags
Automatisert prøvemult multipleksing ved hjelp av kombinert forløper isotopisk merking og isobar tagging (cPILOT)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arul, A. B., Robinson, R. A. S.… More

Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (166), e61342, doi:10.3791/61342 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter