מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה
Summary
כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.
Abstract
שבץ איסכמי הוא מצב קליני המאופיין בתת-פרה-דם של רקמת המוח, המובילה למחסור בחמצן וגלוקוז, ולאובדן עצבי כתוצאה מכך. ראיות רבות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין תאי גליה ונוירונאליים מפעילה השפעות מועילות לאחר אירוע איסכמי. לכן, כדי לחקור מנגנוני הגנה פוטנציאליים, חשוב לפתח מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה בסביבה איסכמית. בזאת אנו מציגים גישה פשוטה לבודד אסטרוקיטים ונוירונים מקליפת המוח העוברית חולדה, כי באמצעות מדיה תרבותית ספציפית, מאפשר הקמת תרבויות נוירון- או אסטרוקיטים מועשר או תרבויות neuron-glia עם תשואה גבוהה ושחזור.
כדי ללמוד את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים, אנו מציעים גישה המבוססת על מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבת של אסטרוציטים מצופה צלחות multiwell. שתי התרבויות נשמרות זו מזו על ידי ספירות פרפין קטנות. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית ויישום של טיפולים ספציפיים לכל סוג תא, המייצג יתרון במחקרים רבים.
כדי לדמות את מה שקורה במהלך שבץ איסכמי, התרבויות נתונות לפרוטוקול מניעת חמצן וגלוקוז. פרוטוקול זה מייצג כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה בשבץ איסכמי.
Introduction
על פי נתוני ארגון הבריאות העולמי, כ-5.5 מיליון בני אדם מתים מדי שנה משבץ איסכמי1. מצב זה מאופיין על ידי ההפרעה של זרימת הדם לאזור מוח מסוים, וכתוצאה מכך אובדן הפיך או בלתי הפיך באספקת חמצן וחומרים מזינים לרקמות, אשר משנה את תפקוד הרקמות ומוביל תפקוד מיטוכונדריאלי, dysregulation סידן, excitotoxicity גלוטמט, דלקת ואובדןתאים 2,,3.
מלבד תאי כלי דם, תאי עצביים וגליה מעורבים פתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי4. בפרט, אסטרוציטים חיוניים לתחזוקה של נוירונים ולאחרונה הוצגו לשחק תפקיד קריטי בתגובה נגע איסכמי5. סוג זה של תא גליה מבצע פונקציות של תמיכה מבנית, הגנה מפני סטרס חמצוני, סינתזה של נוירוטרנסמיטורים, ייצוב של תקשורת תא תא, ביןהיתר 6. יחד עם נוירונים, אסטרוציטים לשחק תפקיד ישיר שידור סינפטי, ויסות השחרור של מולקולות כגון אדנוסין טריפוספט, חומצה גמא אמינו בוטירית גלוטמט7. חלק מהפציעה המושרה על ידי איסכמיה נגרמת על ידי שחרור מוגזם של גלוטמט והצטברותו על שסוע סינפטי, המוביל להפעלת יתר של קולטני N-מתיל-D-אספרטט, הפעלת מפלים איתות במורד הזרם, בסופו של דבר וכתוצאה מכך excitotoxicity8. מאז אסטרוציטים מסוגלים להסיר גלוטמט מן הסוע הסינפטי ולהמיר אותו גלוטמין, הם חיוניים בהגנה מפני excitotoxicity, ובכך להפעיל השפעה neuroprotective על איסכמיה. תאים אלה גם לשחק תפקיד בדלקת עצבית איסכמיה המושרה. לאחר העלבון האיסכמי, אסטרוציטים מופעלים עוברים שינויים מורפולוגיים (היפרטרופיה), להתרבות, ולהראות עלייה בביטוי חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP). הם יכולים להיות תגובתיים (אסטרוגליוזיס), שחרור ציטוקינות פרו דלקתיות כגון גורם נמק גידול-α, interleukin-1α ו interleukin-1β, והפקת רדיקלים חופשיים, כולל תחמוצת החנקן וסופרתחמוצת, אשר בתורו יכול לגרוםלמוות עצבי 9,,10. לעומת זאת, אסטרוציטים תגובתיים עשויים גם לשחק אפקט neuroprotective, מאז הם משחררים ציטוקינות אנטי דלקתיות, כגון שינוי גורם גדילה-β, כי הוא upregulated לאחרשבץ 11. יתר על כן, הם יכולים ליצור צלקת גליה, אשר יכול להגביל את התחדשות רקמות על ידי עיכוב נבטים סקסוניים; עם זאת, צלקת גליה זו יכולה לבודד את אתר הפציעה מרקמות קיימא, ובכך למנוע גל מדורג של נזק לרקמות בלתימבוקרות 12,13.
לכן, זה הכרחי כדי לבסס מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה תחת פציעה איסכמית על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות להגביל או להפוך את ההשפעות של פגיעה איסכמית. בהשוואה למודלים אחרים המשמשים לחקר פגיעה איסכמית, כל שם במודלים vivo 14,15,16, תרבויות organotypic17,18,19 ופרוסות מוחחריפה 20,21,22, תרביות תאים ראשיות הן פחות מורכבות, מה שהופך את המחקר של תרומות בודדות של כל סוג תא בפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי ואיך כל סוג תא מגיב למטרות טיפוליות אפשריות. בדרך כלל, על מנת ללמוד את האינטראקציות בין תרבויות מועשר נוירון ותרבויות מועשר אסטרוציט, נוירונים ותאי גליה ממוצא לאחר הלידהמשמשים 23,24, או תאי גליה שלאחר הלידה ונוירוניםעובריים 25,26. בזאת מוצעת גישה פשוטה כדי לבסס נוירון- או אסטרוציט מועשר תרבויות ותרביות נוירון-גליה מאותה רקמה. תאים ראשיים אלה מתקבלים קליפת המוח העוברית חולדה, אזור המושפע לעתים קרובותמשבץ 27,28. יתר על כן, ניתקה של הרקמה מבוצעת רק על ידי הליך מכני. לכן, פרוטוקול זה מאפשר בידוד תאים באותו שלב של התפתחות, באופן מהיר ולא יקר, ועם ביצועים גבוהים ושחזור.
את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים ניתן לחקור באמצעות מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבתית של אסטרוציטים נזרעים צלחות multiwell. ניתן להשתמש בספירות פרפין קטנות כדי להבטיח את ההפרדה של שתי תרביות התא. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית של כל סוג תא לפני שהם מובאים במגע. לדוגמה, ניתן להשתיק גן מסוים באסטרוציטים ולראות כיצד הוא יכול להשפיע על הפגיעות העצבית או הגנה מפני נזק איסכמי המושרה. שיטה מבוססת כדי לגרום לתנאים כמו איסכמי במבחנה היא חמצן ומניעת גלוקוז (OGD)3, אשר מורכב החלפת האטמוספירה הרגילה (95% אוויר ו 5% CO2)על ידי אטמוספרה אנוקסית (95% N2 ו 5% CO2),הקשורים השמטה של גלוקוז.
השיטה המתוארת מתאימה ללימוד האינטראקציות בין תאי עצב ואסטרוציטים בהקשר של שבץ איסכמי, בצורה פשוטה, מהירה, ניתנת לשחזור ולא יקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מורכבת בידוד אסטרוציט ונוירון מרקמות קליפתיות עובריות חולדה, המאפשר הקמת תרבויות נוירון או אסטרוציט מועשר או תרבויות נוירון-גליה. הוא הותאם ממחקרקודם של הקבוצה 5שלנו , שבו תוארו הבידוד של התרביות העובריות הקליפתיות והנוירון ושתי התרבויות התאפיינו. באמצעות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בתמיכה במימון של Fundação para a Ciência e Tecnologia באמצעות פרויקטים UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 והמחווה SFRH/BD/135936/2018 ל-JP, על ידי ‘Programa Operacional do Centro, Centro 2020″ באמצעות הפרויקט CENTRO-01-0145-FEDER-000013 ומימון לפלטפורמה PPBI-פורטוגזית של BioImaging באמצעות פרויקט POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
