Här presenterar vi ett enkelt tillvägagångssätt med hjälp av specifika kulturmedier som möjliggör inrättandet av neuron- och astrocyter-berikade kulturer, eller neuron-glia kulturer från den embryonala cortex, med hög avkastning och reproducerbarhet.
Ischemisk stroke är ett kliniskt tillstånd som kännetecknas av hypoperfusion av hjärnvävnad, vilket leder till syre och glukos deprivation, och den därav följande neuronal förlust. Många bevis tyder på att samspelet mellan stödjeceller och neuronala celler utöva positiva effekter efter en ischemisk händelse. Därför, att utforska potentiella skyddsmekanismer, Det är viktigt att utveckla modeller som gör det möjligt att studera neuron-glia interaktioner i en ischemisk miljö. Häri presenterar vi en enkel strategi för att isolera astrocyter och nervceller från råtta embryonala cortex, och att genom att använda specifika kultur media, möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer med hög avkastning och reproducerbarhet.
För att studera överhörning mellan astrocyter och nervceller föreslår vi ett tillvägagångssätt baserat på ett samkultursystem där nervceller odlade i täckliner upprätthålls i kontakt med ett monolayer av astrocyter pläterade i multiwell plattor. De två kulturerna underhålls ifrån varandra av små paraffinsfärer. Detta tillvägagångssätt möjliggör oberoende manipulation och tillämpning av specifika behandlingar på varje celltyp, vilket utgör en fördel i många studier.
För att simulera vad som sker under en ischemisk stroke utsätts kulturerna för ett protokoll för syre- och glukosbrist. Detta protokoll representerar ett användbart verktyg för att studera rollen av neuron-glia interaktioner i ischemisk stroke.
Enligt uppgifter från Världshälsoorganisationen, cirka 5,5 miljoner människor dör varje år från ischemisk stroke1. Detta tillstånd kännetecknas av avbrott i blodflödet till en viss hjärnregion, vilket resulterar i en reversibel eller irreversibel förlust i tillförseln av syre och näringsämnen till vävnaden, vilket förändrar vävnadsfunktionen och leder till mitokondriell dysfunktion, kalciumdysreglering, glutamat excitotoxicitet, inflammation och cellförlust2,3.
Bortsett från vaskulära celler, neuronala och gliaceller är inblandade i patofysiologi av den ischemiska stroke4. I synnerhet är astrocyter väsentliga för underhåll av nervceller och nyligen visades spela en avgörande roll i svaret på den ischemiska lesion5. Denna typ av gliacell utför funktioner av strukturellt stöd, försvar mot oxidativ stress, syntes av signalsubstanser, stabilisering av cell-cell kommunikation, bland annat6. Tillsammans med nervceller, astrocyter spelar en direkt roll i synaptisk överföring, reglera frisättningen av molekyler såsom adenosintrifosfat, gamma-aminosmörsyra och glutamat7. En del av den skada som induceras av ischemi orsakas av den överdrivna frisättningen av glutamat och dess ackumulering vid den synaptiska spalten, vilket leder till överaktivering av N-metyl-D-aspartatreceptorer, aktiverande nedströms signalerande kaskader, vilket slutligen resulterar i excitotoxicitet8. Eftersom astrocyter har möjlighet att ta bort glutamat från den synaptiska spalten och omvandla den till glutamin, de är avgörande för att försvara sig mot excitotoxicitet, och därigenom utövar en nervskyddande effekt på ischemi. Dessa celler spelar också en roll i ischemi-inducerad neuroinflammation. Efter den ischemiska förolämpning, aktiverade astrocyterna genomgå morphologic förändringar (hypertrofi), proliferera, och visa en ökning av stödjeceller fibrillary sura protein (GFAP) uttryck. De kan bli reaktiva (astrogliosis), släppa proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekros faktor-α, interleukin-1α och interleukin-1β, och producerar fria radikaler, inklusive kväveoxid och superoxid, som i sin tur kan framkalla neuronal död9,10. Däremot kan reaktiva astrocyter också spela en nervskyddande effekt, eftersom de släpper antiinflammatoriska cytokiner, såsom omvandla tillväxtfaktor-β, som är uppreglerad efter stroke11. Dessutom kan de generera ett gliavärde ärr, som kan begränsa vävnadsregenerering genom att hämma axonal groning; emellertid kan detta glia ärr isolera skadestället från livskraftig vävnad, vilket förhindrar en kaskadvåg av okontrollerad vävnadsskada12,13.
Således är det absolut nödvändigt att fastställa modeller som tillåter att studera neuron-glia interaktioner under en ischemisk skada i syfte att hitta terapeutiska strategier som begränsar eller vända effekterna av ischemisk skada. Jämfört med andra modeller som används för att studera ischemisk skada, nämligen in vivo modeller 14,15,16, organotypiska kulturer17,18,19 och akut hjärnskivor20,21,22, primära cellkulturer är mindre komplexa, vilket gör det möjligt att studera individuella bidrag av varje celltyp i patofysiologin i ischemisk stroke och hur varje celltyp svarar på möjliga terapeutiska mål. Typiskt, för att studera interaktioner mellan neuron-berikade kulturer och astrocyter-berikade kulturer, nervceller och gliaceller av postnatalt ursprung används23,24, eller postnatala gliaceller och embryonala nervceller25,26. Häri föreslås en enkel metod för att etablera neuron- eller astrocyte-berikade kulturer och neuron-glia kulturer från samma vävnad. Dessa primära celler erhålls från råtta embryonala cortex, en region som ofta påverkas av stroke27,28. Dessutom utförs dissociationen av vävnaden endast genom ett mekaniskt förfarande. Därför tillåter detta protokoll isolera celler i samma utvecklingsstadium, på ett snabbt och billigt sätt, och med hög prestanda och reproducerbarhet.
Överhörningen mellan astrocyter och nervceller kan utforskas med hjälp av en co-kultur system där nervceller odlade i täckplattor upprätthålls i kontakt med ett monolager av astrocyter seedade i multiwell plattor. Små paraffinsfärer kan användas för att säkerställa separationen av de två cellkulturerna. Detta tillvägagångssätt tillåter oberoende manipulation av varje celltyp innan de bringas i kontakt. Det är till exempel möjligt att tysta en specifik gen i astrocyter och se hur den kan påverka den neuronala sårbarheten eller skyddet mot ischemisk-inducerad skada. En etablerad metod för att inducera ischemisk-liknande förhållanden in vitro är syre och glukos deprivation (OGD)3, som består i att ersätta den regelbundna atmosfären (95% luft och 5% CO2) med en anoxic atmosfär (95% N2 och 5% CO2), samband med utelämnandet av glukos.
Den beskrivna metoden är lämplig för att studera interaktionerna mellan nervceller och astrocyter i samband med ischemisk stroke, på ett enkelt, snabbt, reproducerbart och billigt sätt.
Metoden här beskrivs består av astrocyten och neuron isolering från råtta embryonal kortikal vävnad, vilket möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer. Den var anpassad från en tidigare studie av vår grupp5, där kortikala neuronen–glia och neuron-berikade embryonala kulturer isolering beskrevs och de två kulturerna kännetecknas. Använda dessa kulturer, Roque et al. fann att astrocyter spelar en nyckelroll i att svara på en ischemi…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansieringsstödet genom Fundação para a Ciência e a Tecnologia through Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 och stipendium SFRH/BD/135936/2018 till JP, genom ”Programa Operacional do Centro, Centro 2020″ genom projektet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 och finansiering till PPBI-Portugisiska plattformen för bioimaging genom projektet POCI-01-0145-FEDER-022122.
24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |