İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli
Summary
Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.
Abstract
İskemik inme beyin dokusunun hipoperfüzyon uğrama ile karakterize klinik bir durumdur, oksijen ve glikoz yoksunluğu yol, ve sonuç nöronal kaybı. Çok sayıda kanıt glial ve nöronal hücreler arasındaki etkileşim bir iskemik olaydan sonra yararlı etkileri uygulamak düşündürmektedir. Bu nedenle, potansiyel koruyucu mekanizmaları keşfetmek için, bir iskemik ortamda nöron-glia etkileşimleri incelenmesine olanak sağlayan modeller geliştirmek önemlidir. Burada, astrositleri ve nöronları sıçan embriyonik korteksinden izole etmek için basit bir yaklaşım saklıyız ve özel kültür ortamını kullanarak, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile nöron veya astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya nöron-glia kültürlerinin kurulmasına olanak sağlıyor.
Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için, kapaklarda kültürlenen nöronların çok kuyu plakalı bir monokat astrositle temas halinde tutuldukları ortak kültür sistemine dayalı bir yaklaşım öneriyoruz. İki kültür küçük parafin küreleri tarafından ayrı tutulur. Bu yaklaşım bağımsız manipülasyon ve birçok çalışmada bir avantaj temsil eden her hücre tipi, özel tedavilerin uygulanması sağlar.
Iskemik inme sırasında meydana gelen leri simüle etmek için, kültürler oksijen ve glikoz yoksunluğu protokolüne tabi tutulur. Bu protokol iskemik inme nöron-glia etkileşimlerinin rolünü incelemek için yararlı bir araç temsil eder.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre, yaklaşık 5.5 milyon kişi her yıl iskemik inme1ölür. Bu durum belirli bir beyin bölgesine kan akışının kesilmesi ile karakterizedir, doku fonksiyonunu değiştirir ve mitokondriyal disfonksiyon, kalsiyum disregülasyonu, glutamat eksitotoksisite, inflamasyon ve hücre kaybı 2 yol açan doku, oksijen ve besin kaynağı nda geri dönüşümlü veya geri dönüşümsüz kaybı ile sonuçlanan2,3.
Vasküler hücrelerin yanı sıra, nöronal ve glial hücreler iskemik inme patofizyolojisi katılır4. Özellikle, astrositler nöronların bakımı için gerekli olan ve son zamanlarda iskemik lezyon yanıtı kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir5. Glial hücre Bu tür yapısal destek fonksiyonları gerçekleştirir, oksidatif strese karşı savunma, nörotransmitterlerin sentezi, hücre-hücre iletişiminin stabilizasyonu, diğerleri arasında6. Nöronlar ile birlikte, astrositler sinaptik iletim doğrudan bir rol oynamak, adenozin trifosfat, gama-aminobutirik asit ve glutamat gibi moleküllerin salınımını düzenleyen7. Iskemi tarafından indüklenen yaralanma nın bir kısmı glutamat aşırı salınımı ve sinaptik yarık onun birikimi neden olur, N-metil-D-aspartat reseptörlerinin aşırı aktivasyonuyol, aşağı sinyal kaskadlar aktive, sonuçta eksitotoksisite neden8. Astrositler sinaptik yarık glutamat kaldırmak ve glutamin dönüştürmek mümkün olduğundan, onlar eksitotoksisite karşı savunmada çok önemlidir, bu nedenle iskemi üzerinde bir nöroprotektif etki uygulayarak. Bu hücreler aynı zamanda iskemi kaynaklı nöroinflamasyon bir rol oynamaktadır. Iskemik hakaretten sonra aktive astrositler morfolojik değişikliklere (hipertrofi), çoğalır ve glial fibrillary asidik protein (GFAP) ekspresyonunda artış gösterirler. Onlar reaktif olabilir (astrogliosis), tümör nekroz faktör-α, interlökin-1α ve interlökin-1β gibi pro-inflamatuar sitokinler serbest, ve serbest radikaller üreten, nitrik oksit ve süperoksit de dahil olmak üzere, hangi sırayla nöronal ölüm neden olabilir9,10. Buna karşılık, reaktif astrositler de nöroprotektif bir etki oynayabilir, onlar anti-inflamatuar sitokinler serbest beri, büyüme faktörü dönüştürme gibi-β, inme sonra upregulated olduğunu11. Ayrıca, onlar bir glial yara oluşturabilir, hangi aksonal filizlenme inhibe doku rejenerasyonu sınırlayabilir; ancak, Bu glial yara uygun doku yaralanma site izole edebilirsiniz, böylece kontrolsüz doku hasarı basamaklı bir dalga önlenmesi12,13.
Bu nedenle, iskemik yaralanmanın etkilerini sınırlayan veya tersine çeviren tedavi stratejileri bulmak için iskemik yaralanma altında nöron-glia etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanıyan modeller oluşturmak zorunludur. Iskemik yaralanma çalışma için kullanılan diğer modeller ile karşılaştırıldığında, yani in vivo modelleri14,15,16, organotipik kültürler17,18,19 ve akut beyin dilimleri20,21,22, birincil hücre kültürleri daha az karmaşıktır, hangi mümkün iskemik inme patofizyolojisi her hücre tipibireysel katkıları çalışma yapar ve nasıl her hücre tipi olası terapötik hedeflere yanıt verir. Tipik olarak, nöron zenginleştirilmiş kültürler ve astrosit zenginleştirilmiş kültürler arasındaki etkileşimleri incelemek için, nöronlar ve postnatal kökenli glial hücrelerkullanılır 23,24, veya doğum sonrası glial hücreler ve embriyonik nöronlar25,26. Burada nöron kurmak için basit bir yaklaşım önerilmektedir- veya astrosit zenginleştirilmiş kültürler ve nöron-glia kültürleri aynı dokudan. Bu birincil hücreler sıçan embriyonik korteks elde edilir, bir bölge sık inme etkilenen27,28. Ayrıca, doku dissociation sadece mekanik bir prosedür ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, bu protokol, hücrelerin gelişimin aynı aşamasında, hızlı ve ucuz bir şekilde ve yüksek performans ve tekrarlanabilirlik ile izole sağlar.
Astrositler ve nöronlar arasındaki çapraz konuşma, kapaklarda kültürlenen nöronların çok kuyu plakalı bir astrosit tek tabakası ile temas halinde tutuldukları bir ortak kültür sistemi kullanılarak incelenebilir. Küçük parafin küreler iki hücre kültürleri ayrılmasını sağlamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım, temas edilmeden önce her hücre türünün bağımsız manipülasyonuna olanak tanır. Örneğin, astrositlerde belirli bir geni susturmak ve iskemik kaynaklı hasara karşı nöronal kırılganlığı veya korumayı nasıl etkileyebileceğini görmek mümkündür. In vitro iskemik benzeri koşulları indüklemek için kurulmuş bir yöntem oksijen ve glikoz yoksunluğu (OGD)3, hangi normal atmosfer yerine oluşur (95% hava ve 5% CO2) bir anoksik atmosfer ile (95% N2 ve% 5 CO2),glikoz ihmali ile ilişkili.
Açıklanan yöntem, iskemik inme bağlamında nöronlar ve astrositler arasındaki etkileşimleri basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ucuz bir şekilde incelemek için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntem sıçan embriyonik kortikal doku dan astrosit ve nöron izolasyon oluşur, nöron kurulması sağlayan- veya astrosit zenginleştirilmiş kültürler veya nöron-glia kültürleri. Bu bizim grup 5 bir önceki çalışmadan uyarlanmıştır5, kortikal nöron-glia ve nöron zenginleştirilmiş embriyonik kültürlerizolasyon tarif edildi ve iki kültür karakterize. Bu kültürleri kullanarak, Roque ve ark astrositbir iskemik hasara yanıt önemli bir rol oynadığını bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Fundação para a Ciência e a Tecnologia tarafından Projeler UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 ve burs SFRH/BD/135936/2018 jp aracılığıyla fon desteği kabul, tarafından ”Programa Operacional do Centro, Centro 2020″ proje centro-01-0145-FEDER-000013 ve Proje POCI-01-0145-FEDER-022122 ile BioImaging PPBI-Portekizplatformu finansman.
Materials
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
