Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie
Summary
Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.
Abstract
Ischemische beroerte is een klinische aandoening gekenmerkt door hypoperfusie van hersenweefsel, wat leidt tot zuurstof- en glucosedeprivatie, en het daaruit voortvloeiende neuronale verlies. Tal van aanwijzingen dat de interactie tussen glia- en neuronale cellen gunstige effecten uitoefent na een ischemische gebeurtenis. Daarom, om potentiële beschermende mechanismen te verkennen, is het belangrijk om modellen te ontwikkelen die het mogelijk maken neuron-glia interacties in een ischemische omgeving te bestuderen. Hierin presenteren we een eenvoudige aanpak om astrocyten en neuronen te isoleren van de rat embryonale cortex, en dat met behulp van specifieke cultuur media, maakt de oprichting van neuron- of astrocyten verrijkt culturen of neuron-glia culturen met een hoge opbrengst en reproduceerbaarheid.
Om de crosstalk tussen astrocyten en neuronen te bestuderen, stellen we een aanpak voor op basis van een co-cultuursysteem waarbij neuronen gekweekt in coverslips in contact worden gehouden met een monolaag van astrocyten in multiwellplaten. De twee culturen worden gescheiden gehouden door kleine paraffinebollen. Deze aanpak maakt het mogelijk de onafhankelijke manipulatie en de toepassing van specifieke behandelingen op elk celtype, die een voordeel in veel studies vertegenwoordigt.
Om te simuleren wat er gebeurt tijdens een ischemische beroerte, worden de culturen onderworpen aan een zuurstof- en glucosedeprivatieprotocol. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om de rol van neuron-glia interacties in ischemische beroerte te bestuderen.
Introduction
Volgens gegevens van de Wereldgezondheidsorganisatie sterven jaarlijks ongeveer 5,5 miljoen mensen aan ischemische beroerte1. Deze aandoening wordt gekenmerkt door de onderbreking van de bloedtoevoer naar een bepaald hersengebied, wat resulteert in een omkeerbaar of onomkeerbaar verlies in de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar het weefsel, wat de weefselfunctie verandert en leidt tot mitochondriale disfunctie, calciumdysregulatie, glutamaat excitotoxiciteit, ontsteking en celverlies2,3.
Afgezien van vasculaire cellen, neuronale en gliacellen zijn betrokken bij de pathofysiologie van de ischemische beroerte4. In het bijzonder, astrocyten zijn essentieel voor het onderhoud van neuronen en onlangs bleek een cruciale rol te spelen in de reactie op de ischemische laesie5. Dit type gliacel vervult functies van structurele ondersteuning, verdediging tegen oxidatieve stress, synthese van neurotransmitters, stabilisatie van celcelcommunicatie, onder andere6. Samen met neuronen, astrocyten spelen een directe rol in synaptische transmissie, het reguleren van de afgifte van moleculen zoals adenosine triphosfat, gamma-aminoboterzuur en glutamaat7. Een deel van de schade veroorzaakt door ischemie wordt veroorzaakt door de overmatige afgifte van glutamaat en de accumulatie ervan op de synaptische kloof, wat leidt tot de overactivatie van N-methyl-D-aspartaatreceptoren, het activeren van downstream signaalcascades, wat uiteindelijk resulteert in excitotoxiciteit8. Aangezien astrocyten glutamaat uit de synaptische kloof kunnen verwijderen en omzetten in glutamine, zijn ze cruciaal in het verdedigen tegen excitotoxiciteit, waardoor een neuroprotectief effect op ischemie wordt uitgeoefend. Deze cellen spelen ook een rol in ischemie-geïnduceerde neuro-ontsteking. Na de ischemische belediging ondergaan geactiveerde astrocyten morfologische veranderingen (hypertrofie), vermenigvuldigen, en tonen een toename van de gliafibrillaire zure eiwit (GFAP) expressie. Ze kunnen reactief worden (astroglise), het vrijgeven van pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrose factor-α, interleukine-1α en interleukine-1β, en het produceren van vrije radicalen, waaronder stikstofmonoxide en superoxide, die op hun beurt kan leiden tot neuronale dood9,10. In tegenstelling, reactieve astrocyten kunnen ook een neuroprotectief effect spelen, omdat ze ontstekingsremmende cytokinen afgeven, zoals het transformeren van groeifactor-β, die na beroerte11upgereguleerd is. Bovendien kunnen ze een glialitteken genereren, dat weefselregeneratie kan beperken door het remmen van axonale kiemen; dit glialitteken kan echter de letselplaats isoleren van levensvatbaar weefsel, waardoor een trapsgewijze golf van ongecontroleerde weefselschade12,13wordt voorkomen .
Zo is het noodzakelijk om modellen vast te stellen die het mogelijk maken het bestuderen van neuron-glia interacties onder een ischemische schade om therapeutische strategieën die beperken of omkeren van de effecten van ischemische letsel te vinden. In vergelijking met andere modellen die worden gebruikt om ischemische letsel te bestuderen, namelijk in vivo modellen14,15,16, organotypic culturen17,18,19 en acute hersenschijfjes20,21,22, primaire celculturen zijn minder complex, waardoor de studie van individuele bijdragen van elk celtype in de pathofysiologie van ischemische beroerte en hoe elk celtype reageert op mogelijke therapeutische doelen mogelijk maakt. Typisch, om de interacties tussen neuron-verrijkte culturen en astrocyten verrijkte culturen te bestuderen, neuronen en gliacellen van postnatale oorsprong worden gebruikt23,,24, of postnatale gliacellen en embryonale neuronen25,26. Hierin wordt voorgesteld een eenvoudige aanpak om neuron- of astrocyten verrijkte culturen en neuron-glia culturen vast te stellen uit hetzelfde weefsel. Deze primaire cellen worden verkregen uit rat embryonale cortex, een gebied vaak beïnvloed door beroerte27,28. Bovendien wordt de dissociatie van het weefsel alleen uitgevoerd door een mechanische procedure. Daarom maakt dit protocol het isoleren van cellen in dezelfde ontwikkelingsfase mogelijk, op een snelle en goedkope manier, en met hoge prestaties en reproduceerbaarheid.
De crosstalk tussen astrocyten en neuronen kan worden onderzocht met behulp van een co-cultuur systeem waarin neuronen gekweekt in coverslips worden onderhouden in contact met een monolaag van astrocyten gezaaid in multiwell platen. Kleine paraffinebollen kunnen worden gebruikt om de scheiding van de twee celculturen te garanderen. Deze aanpak maakt onafhankelijke manipulatie van elk celtype mogelijk voordat ze in contact worden gebracht. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een specifiek gen in astrocyten het zwijgen op te leggen en te zien hoe het de neuronale kwetsbaarheid of bescherming tegen ischemische schade kan beïnvloeden. Een gevestigde methode om ischemische omstandigheden in vitro te induceren is zuurstof- en glucosedeprivatie (OGD)3, die bestaat in het vervangen van de reguliere atmosfeer (95% lucht en 5% CO2)door een anoxische atmosfeer (95% N2 en 5% CO2), geassocieerd met het weglaten van glucose.
De beschreven methode is geschikt voor het bestuderen van de interacties tussen neuronen en astrocyten in de context van ischemische beroerte, op een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en goedkope manier.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode bestaat uit de astrocyten- en neuronisolatie van ratembryonal corticaal weefsel, waardoor neuron- of astrocytenverrijkte culturen of neuron-gliaculturen kunnen worden opgericht. Het werd aangepast aan een eerdere studie van onze groep5, waar de corticale neuron-glia en neuron-verrijkte embryonale culturen isolatie werden beschreven en de twee culturen gekenmerkt. Met behulp van deze culturen, Roque et al. vond dat astrocyten een belangrijke rol spelen bij het reageren op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de financieringssteun van Fundação para a Ciência e a Tecnologia via Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 en de beurs SFRH/BD/135936/2018 aan JP, door ”Programa Operacional do Centro, Centro 2020″ via het project CENTRO-01-0145-FEDER-000013 en financiering aan het PPBI-Portugees Platform of BioImaging via het project POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
