Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia
Summary
Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.
Abstract
L’ictus ischemico è una condizione clinica caratterizzata da ipoperfusione di tessuto cerebrale, che porta alla privazione di ossigeno e glucosio, e la conseguente perdita neuronale. Numerose prove suggeriscono che l’interazione tra cellule gliali e neuronali esercitano effetti benefici dopo un evento ischemico. Pertanto, per esplorare potenziali meccanismi protettivi, è importante sviluppare modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia in un ambiente ischemico. Qui presentiamo un approccio semplice per isolare gli astrociti e neuroni dalla corteccia embrionale del ratto, e che utilizzando specifici mezzi di coltura, permette la creazione di colture arricchite di neuroni o astrociti o colture neurone-glia con alto rendimento e riproducibilità.
Per studiare il crosstalk tra astrociti e neuroni, proponiamo un approccio basato su un sistema di co-coltura in cui i neuroni colti in coperture vengono mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti placcati in piastre multiwell. Le due culture sono tenute a parte da piccole sfere di paraffina. Questo approccio consente la manipolazione indipendente e l’applicazione di trattamenti specifici per ogni tipo di cellula, che rappresenta un vantaggio in molti studi.
Per simulare ciò che accade durante un ictus ischemico, le colture sono sottoposte a un protocollo di privazione di ossigeno e glucosio. Questo protocollo rappresenta uno strumento utile per studiare il ruolo delle interazioni neurone-glia nell’ictus ischemico.
Introduction
Secondo i dati dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, circa 5,5 milioni di persone muoiono ogni anno a causa di un ictus ischemico1. Questa condizione è caratterizzata dall’interruzione del flusso sanguigno in una determinata regione del cervello, con conseguente perdita reversibile o irreversibile nell’apporto di ossigeno e sostanze nutritive al tessuto, che altera la funzione del tessuto e porta a disfunzione mitocondriale, disregolazione del calcio, ecitotossicità del glutammato, infiammazione e perdita cellulare2,3.
Oltre alle cellule vascolari, le cellule neuronali e gliali sono coinvolte nella fisiofisiologia dell’ictus ischemico4. In particolare, gli astrociti sono essenziali per il mantenimento dei neuroni e recentemente hanno dimostrato di svolgere un ruolo critico nella risposta alla lesione ischemica5. Questo tipo di cellula gliale svolge funzioni di supporto strutturale, difesa contro lo stress ossidativo, sintesi di neurotrasmettitori, stabilizzazione della comunicazione cellulare-cellula, tra gli altri6. Insieme ai neuroni, gli astrociti svolgono un ruolo diretto nella trasmissione sinaptica, regolando il rilascio di molecole come l’adenosina triphosfato, l’acido gamma-aminobutyrico e il glutammato7. Parte della lesione indotta dall’ischemia è causata dall’eccessivo rilascio di glutammato e dal suo accumulo alla fessura sinaptica, che porta all’eccessiva attivazione dei recettori N-methyl-D-aspartate, attivando le cascate di segnalazione a valle, con conseguente ecitotossicità8. Poiché gli astrociti sono in grado di rimuovere il glutammato dalla fessura sinaptica e convertirlo in glutammina, sono fondamentali per difendersi dall’eccitatossicità, esercitando così un effetto neuroprotettivo sull’ischemia. Queste cellule svolgono anche un ruolo nella neuroinfiammazione indotta da ischemia. Dopo l’insulto ischemico, gli astrociti attivati subiscono cambiamenti morfologici (ipertrofia), proliferano e mostrano un aumento dell’espressione della proteina acida fibrillale gliale (GFAP). Possono diventare reattivi (astrogliosi), rilasciando citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale-α, l’interleuchina-1 e l’interleuchina-1β, e producendo radicali liberi, tra cui ossido nitrico e superossido, che a sua volta possono indurre la morte neuronale9,10. Al contrario, gli astrociti reattivi possono anche svolgere un effetto neuroprotettivo, poiché rilasciano citochine antinfiammatorie, come trasformare il fattore di crescita-β, che viene regolato dopol’ictus 11. Inoltre, possono generare una cicatrice gliale, che può limitare la rigenerazione dei tessuti inibendo la germogliazione assonale; tuttavia, questa cicatrice gliale può isolare il sito di lesione dal tessuto vitale, impedendo così un’ondata a cascata di danni ai tessutiincontrollati 12,13.
Pertanto, è imperativo stabilire modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia sotto una lesione ischemica al fine di trovare strategie terapeutiche che limitino o inverodino gli effetti della lesione ischemica. Rispetto ad altri modelli utilizzati per studiare le lesioni ischemiche, vale a dire i modelli in vivo 14,15,16, le colture organotipiche17,18,19 e le fette cerebrali acute20,21,22, le colture cellulari primarie sono meno complesse, il che rende possibile lo studio dei singoli contributi di ogni tipo di cellula nella fisiofisiologia dell’ictus ischemico e come ogni tipo di cellula risponde a possibili bersagli terapeutici.22 Tipicamente, al fine di studiare le interazioni tra colture arricchite di neuroni e colture arricchite di astrociti, i neuroni e le cellule gliali di origine postnatale vengonoutilizzati 23,24, o cellule gliali postnatali e neuroni embrionali25,26. Qui viene proposto un approccio semplice per stabilire colture arricchite di neuroni o astrociti e colture neurone-glia dallo stesso tessuto. Queste cellule primarie sono ottenute dalla corteccia embrionale del ratto, una regione spesso colpitadall’ictus 27,28. Inoltre, la dissociazione del tessuto viene eseguita solo con una procedura meccanica. Pertanto, questo protocollo consente di isolare le cellule nella stessa fase di sviluppo, in modo rapido ed economico e con elevate prestazioni e riproducibilità.
L’incrocio tra astrociti e neuroni può essere esplorato utilizzando un sistema di co-coltura in cui i neuroni colturati in co-lips sono mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti semi di placche multiwell. Piccole sfere di paraffina possono essere utilizzate per garantire la separazione delle due colture cellulari. Questo approccio consente la manipolazione indipendente di ogni tipo di cella prima che siano portati in contatto. Ad esempio, è possibile silenziare un gene specifico negli astrociti e vedere come può influenzare la vulnerabilità neuronale o la protezione contro i danni indotta dall’ischemia. Un metodo consolidato per indurre condizioni ischemiche in vitro è la privazione di ossigeno e glucosio (OGD)3, che consiste nel sostituire l’atmosfera regolare (95% aria e 5% CO2) da un’atmosfera anossica (95% N2 e 5% CO2), associata all’omissione di glucosio.
Il metodo descritto è adatto per studiare le interazioni tra neuroni e astrociti nel contesto dell’ictus ischemico, in modo semplice, veloce, riproducibile ed economico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto consiste nell’isolamento dell’astrocito e del neurone dal tessuto corticale embrionale del ratto, consentendo la creazione di colture arricchite di neuroni o astrociti o colture neurone-glia. È stato adattato da un precedente studio del nostro gruppo5, dove sono stati descritti l’isolamento delle colture embrionali corticali neurone-glia e neurone-arricchite e le due culture caratterizzate. Utilizzando queste colture, Roque et al. ha scoperto che gli astrociti svolgono un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario da parte di Fundao para a Ciància e a Tecnologia attraverso i progetti UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 e la borsa di studio SFRH/BD/135936/2018 a JP, di ”Programa Operacional do Centro, Centro 2020′ attraverso il progetto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 e il finanziamento alla Piattaforma PPBI-Portoghese di BioImaging attraverso il Progetto POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
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