이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델
Summary
여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.
Abstract
허혈성 뇌졸중은 뇌 조직의 저혈당을 특징으로하는 임상 상태이며 산소와 포도당 부족으로 이어지며 결과적으로 뉴런 손실이 있습니다. 수많은 증거는 신경 교교와 신경 세포 사이 상호 작용 허 혈 이벤트 후 유익한 효과 발휘 제안. 따라서 잠재적인 보호 메커니즘을 탐구하려면 허혈성 환경에서 신경 신경 교상호 작용을 연구 할 수있는 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서 우리는 쥐 배아 피질로부터 성상세포와 뉴런을 분리하는 간단한 접근법을 제시하며, 특정 배양 매체를 사용하여, 높은 수율과 재현성을 가진 뉴런 또는 성상세포 농축 배양 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있도록 한다.
성상 세포와 뉴런 사이의 교차 토크를 연구하기 위해, 우리는 커버립에서 배양 된 뉴런이 다중 웰 플레이트에 도금 된 성상 세포의 단층과 접촉하여 유지되는 공동 배양 시스템을 기반으로 한 접근 방식을 제안합니다. 두 문화권은 작은 파라핀 구체에 의해 떨어져 유지된다. 이 접근은 많은 연구 결과에서 이점을 나타내는 각 세포 모형에 독립적인 조작 및 특정 처리의 적용을 허용합니다.
허혈성 뇌졸중 중에 발생하는 것을 시뮬레이션하기 위해 배양은 산소 및 포도당 박탈 프로토콜을 받습니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중에서 신경 신경 교상호작용의 역할을 연구하는 유용한 도구를 나타냅니다.
Introduction
세계보건기구(WHO)의 자료에 따르면 매년 약 550만 명이 허혈성 뇌졸중1로사망합니다. 이러한 상태는 특정 뇌 영역으로의 혈류의 중단을 특징으로 하며, 조직기능 변경 및 미토콘드리아 기능 장애, 칼슘 장애, 글루타민절 절제, 염증 및 세포 손실2,,3로이어지는 조직에 산소및 영양소의 공급에 가역적 또는 돌이킬 수 없는 손실이 발생한다.
혈관 세포 외에도, 신경 세포와 신경교 세포는 허혈성 뇌졸중4의병리생리학에 관여한다. 특히, 성상세포는 뉴런의 유지에 필수적이며 최근에는 허혈성 병변5에대한 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이러한 유형의 신경교 세포는 구조적 지지, 산화 스트레스에 대한 방어, 신경 전달 물질의 합성, 세포 세포 통신의 안정화 등의 기능을 수행6. 뉴런과 함께, 성상세포는 시냅스 전달에 직접적인 역할을 하며, 아데노신 삼위산염, 감마-아미노부티산 및 글루타메이트7과같은 분자의 방출을 조절한다. 허혈증에 의해 유도된 상해의 일부는 글루타민의 과도한 방출과 시냅스 갈라짐에 축적되어 N-메틸-D-아스파르타테 수용체의 과잉 활성화로 이어지며, 다운스트림 신호 캐스케이드를 활성화하여 궁극적으로흥분독성 8을초래한다. 성상 세포는 시 냅 스 갈라 진 에서 글루타민을 제거 하 고 글루타민으로 변환 할 수 있기 때문에, 그들은 흥분 독성에 대 한 방어에 중요 한, 그로 인하여 허혈에 신경 보호 효과 발휘. 이 세포는 또한 허혈 유도 신경 염증에 있는 역할을 합니다. 허혈성 모욕 후, 활성화된 성상세포는 형태학적 변화(비대) 증식, 증식, 신경교 세동산성 단백질(GFAP) 발현의 증가를 보여준다. 그(것)들은 반응성이 될 수 있습니다 (천체 글리오증), 종양 괴사 인자-α, 인터류킨 -1α 및 인터류킨-1β와 같은 프로 염증성 사이토카인을 방출하고, 차례로 신경 죽음을 유도 할 수있는 산화 질소 및 초산화질소를 포함한 자유 라디칼을 생산9,,10. 대조적으로, 반응성 성상세포는 또한 신경 보호 효과를 재생할 수 있습니다, 그들은 뇌졸중 후 상승 조절되는 성장 인자 β 변환과 같은 항 염증 성 사이토카인을 방출하기 때문에11. 더욱이, 그들은 축 사 발아를 억제 하 여 조직 재생을 제한할 수 있는 신경 교 반을 생성할 수 있습니다.; 그러나, 이러한 신경교 흉터는 부상 부위를 실행 가능한 조직으로부터 분리하여 통제되지 않는 조직손상(12,,13)의계단식 파를 방지할 수 있다.
따라서 허혈성 상해의 영향을 제한하거나 되돌리는 치료 전략을 찾기 위해서는 허혈성 상해하에서 뉴런-glia 상호 작용을 연구할 수 있는 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 허혈성 상해를 연구하는 데 사용되는 다른 모델과 비교하여, 즉 생체 내 모델(14,15,,16),조직형 배양17,,18,,19 및 급성 뇌 슬라이스,20,,21,,22,1차 세포 배양은 덜 복잡하여 각 세포 유형의 병리학적 인 뇌졸중 및 각 세포 표적에 대한 개별 기여도에 대한 연구가 가능하도록 합니다. 전형적으로, 뉴런 농축 배양과 성상세포 농축 배양 사이의 상호작용을 연구하기 위해, 산후 기원의 뉴런 및 신경교 세포는23,,24,또는 산후 신경교세포 및 배아 뉴런(25,2526)을26사용한다. 본명에서 동일한 조직에서 뉴런 또는 성상세포농축 배양 및 뉴런-글리아 배양을 확립하는 간단한 접근법이 제안된다. 이들 1차 세포는 쥐 배아 피질로부터 얻어지며, 뇌졸중27,,28에의해 자주 영향을 받는 부위이다. 더욱이, 조직의 해리는 기계적 절차에 의해서만 수행됩니다. 따라서 이 프로토콜은 동일한 개발 단계, 빠르고 저렴한 방법으로, 고성능 및 재현성을 통해 세포를 격리할 수 있습니다.
성상 세포와 뉴런 사이의 크로스토크는 다중웰 플레이트에 시드된 성상세포의 단층과 접촉하여 커버립으로 배양된 뉴런이 유지되는 공동 배양 시스템을 사용하여 탐구할 수 있습니다. 작은 파라핀 구체는 두 세포 배양의 분리를 보장하기 위해 사용될 수 있다. 이 접근은 접촉하기 전에 각 세포 모형의 독립적인 조작을 허용합니다. 예를 들어, 성상세포에서 특정 유전자를 침묵시키고 허혈성으로 인한 손상에 대한 신경 취약성 또는 보호에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 확인할 수 있다. 시험관 내 허혈성 과 같은 조건을 유도하는 확립된 방법은 산소 및 포도당 박탈(OGD)3이며,이는 무산소 대기(95% N2 및 5% CO2)에 의해 일반 대기(95% 공기 및 5%CO2)를대체하는 것으로 구성된다.2
설명된 방법은 허혈성 뇌졸중의 맥락에서 뉴런과 성상세포 사이의 상호 작용을 간단하고 빠르며 재현 가능하며 저렴한 방식으로 연구하는 데 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명된 방법은 쥐 배아 피질 조직에서 성상세포 및 뉴런 절연으로 이루어져 뉴런 또는 천상세포 농축 배양 또는 뉴런-글리아 배양의 확립을 허용한다. 그것은 우리 그룹5의이전 연구에서 적응 되었다, 어디 피 질 뉴런-glia와 뉴런 농축 배아 배아 문화 격리 설명 하 고 두 문화 특징. 이러한 배양식을 사용하여, Roque 외. 성상 세포가 허혈성 손상에 반응하는 데 중요한 역할을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Fundação 파라 프로젝트 UIDB /00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 및 펠로우십 SFRH/BD/135936/2018을 통해 Tecnologia를 통해 자금 지원을 인정합니다. 프로젝트 CENTRO-01-0145-FEDER-000013을 통해 ”Programa Operacional do Centro, Centro 2020’에 의해 프로젝트 POCI-01-0145-FEDER-022122를 통해 바이오 이미징의 PPBI-포르투갈 플랫폼에 자금을 지원합니다.
Materials
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
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