Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Summary

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Abstract

O AVC isquêmico é uma condição clínica caracterizada pela hipoperfusão do tecido cerebral, levando à privação de oxigênio e glicose, e à consequente perda neuronal. Inúmeras evidências sugerem que a interação entre células gliais e neuronais exerce efeitos benéficos após um evento isquêmico. Portanto, para explorar potenciais mecanismos de proteção, é importante desenvolver modelos que permitam estudar interações neurônio-glia em um ambiente isquêmico. Aqui apresentamos uma abordagem simples para isolar astrócitos e neurônios do córtex embrionário de ratos, e que, usando meios de cultura específicos, permite o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neuron-glia com alto rendimento e reprodutibilidade.

Para estudar a conversa cruzada entre astrócitos e neurônios, propomos uma abordagem baseada em um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos banhados em placas multiwell. As duas culturas são mantidas separadas por pequenas esferas de parafina. Essa abordagem permite a manipulação independente e a aplicação de tratamentos específicos a cada tipo celular, o que representa uma vantagem em muitos estudos.

Para simular o que ocorre durante um acidente vascular cerebral isquêmico, as culturas são submetidas a um protocolo de privação de oxigênio e glicose. Este protocolo representa uma ferramenta útil para estudar o papel das interações neurônio-glia no derrame isquêmico.

Introduction

Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 5,5 milhões de pessoas morrem todos os anos por acidente vascular cerebral isquêmico¹. Essa condição é caracterizada pela interrupção do fluxo sanguíneo para uma determinada região cerebral, resultando em uma perda reversível ou irreversível no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o tecido, o que altera a função tecidual e leva à disfunção mitocondrial, desregulação de cálcio, excitoxicidade do glutamato, inflamação e perda celular^2,,3.

Além das células vasculares, as células neuronais e gliais estão envolvidas na fisiopatologia do derrame isquêmico⁴. Em particular, os astrócitos são essenciais para a manutenção dos neurônios e recentemente mostraram-se um papel crítico na resposta à lesão isquêmica⁵. Este tipo de célula gliaial exerce funções de suporte estrutural, defesa contra estresse oxidativo, síntese de neurotransmissores, estabilização da comunicação célula-célula, entre outras⁶. Junto com os neurônios, os astrócitos desempenham um papel direto na transmissão sináptica, regulando a liberação de moléculas como triphosfato de adenosina, ácido gama-aminobutírico e glutamato⁷. Parte da lesão induzida pela isquemia é causada pela liberação excessiva de glutamato e seu acúmulo na fissura sináptica, levando à superativação de receptores N-metil-D-aspartato, ativando cascatas de sinalização a jusante, resultando em excitotoxicidade⁸. Uma vez que os astrócitos são capazes de remover o glutamato da fissura sináptica e convertê-lo em glutamina, eles são cruciais na defesa contra a excitotoxicidade, exercendo assim um efeito neuroprotetor sobre a isquemia. Essas células também desempenham um papel na neuroinflamação induzida pela isquemia. Após o insulto isquêmico, os astrócitos ativados sofrem alterações morfológicas (hipertrofia), proliferam e mostram um aumento na expressão de proteína ácida fibrilar gliana (GFAP). Eles podem se tornar reativos (astrogliose), liberando citocinas pró-inflamatórias como o fator necrose tumoral-α, interleucina-1α e interleucina-1β, e produzindo radicais livres, incluindo óxido nítrico e superóxido, que por sua vez pode induzir a morte neuronal^9,,10. Em contraste, os astrócitos reativas também podem ter um efeito neuroprotetor, uma vez que liberam citocinas anti-inflamatórias, como transformar fator de crescimento-β, que é regulado após o derrame¹¹. Além disso, podem gerar uma cicatriz glianal, que pode limitar a regeneração tecidual inibindo o broto axonal; no entanto, essa cicatriz gliaria pode isolar o local da lesão do tecido viável, evitando assim uma onda cascata de danos teciduais descontrolados^12,13.

Assim, é imprescindível estabelecer modelos que permitam estudar interações neurônio-glia sob uma lesão isquêmica, a fim de encontrar estratégias terapêuticas que limitem ou revertam os efeitos da lesão isquêmica. Comparado com outros modelos usados para estudar lesões isquêmicas, ou seja, os modelos in vivo ^14,,15,16, culturas organotípicas^17,,18,,19 e fatias cerebrais agudas^20,,21,,22, culturas celulares primárias são menos complexas, o que possibilita o estudo de contribuições individuais de cada tipo celular na fisiopatologia do derrame isquêmico e como cada tipo de célula responde a possíveis alvos terapêuticos. Tipicamente, para estudar as interações entre culturas enriquecidas por neurônios e culturas enriquecidas por astrócitos, são utilizados neurônios e células gliais de origem pós-natal^23,,24ou células gliais pós-natais e neurônios embrionários^25,,26. Aqui é proposto uma abordagem simples para estabelecer culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos e culturas neurônio-glia a partir do mesmo tecido. Essas células primárias são obtidas a partir do córtex embrionário de rato, uma região frequentemente afetada pelo acidente vascular cerebral^27,28. Além disso, a dissociação do tecido é realizada apenas por um procedimento mecânico. Portanto, este protocolo permite isolar células no mesmo estágio de desenvolvimento, de forma rápida e barata, e com alto desempenho e reprodutibilidade.

O crosstalk entre astrócitos e neurônios pode ser explorado usando um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos semeados em placas multiwell. Pequenas esferas de parafina podem ser usadas para garantir a separação das duas culturas celulares. Esta abordagem permite manipulação independente de cada tipo de célula antes de serem colocados em contato. Por exemplo, é possível silenciar um gene específico em astrócitos e ver como ele pode influenciar a vulnerabilidade neuronal ou proteção contra danos induzidos por isquêmicos. Um método estabelecido para induzir condições isquêmicas in vitro é a privação de oxigênio e glicose (OGD)³, que consiste em substituir a atmosfera regular (95% de ar e 5% DE CO₂) por uma atmosfera anoxica (95% N₂ e 5% CO_2),associada à omissão de glicose.

O método descrito é adequado para estudar as interações entre neurônios e astrócitos no contexto do AVC isquêmico, de forma simples, rápida, reprodutível e barata.

Protocol

Todos os animais utilizados foram criados no Centro de Pesquisa em Ciência da Saúde CICS-UBI, de acordo com os requisitos éticos nacionais para a pesquisa animal e com a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados Usados para Fins Experimentais e Outros Científicos (Diretiva 2010/63/UE). 1. Cultura celular primária do córtex do embrião do rato Preparação média da cultura Prepare o Neurobasal Medium (NBM) adicionando os seguintes suplementos: 2% B27…

Representative Results

Para caracterizar as culturas, a imunocitoquímica para avaliar o número de células que expressavam GFAP ou MAP2, marcadores amplamente utilizados de astrócitos e neurônios (Figura 2),foi realizada em cada tipo de cultura cortical. Esta análise revelou que as culturas enriquecidas com astrócito apresentaram 97% das células expressas GFAP (Figura 2A). Em relação à cultura enriquecida com neurônios, 78% das células expressas MAP2, 4% das células expre…

Discussion

O método aqui descrito consiste no isolamento de astrócito e neurônio do tecido cortical embrionário de ratos, permitindo o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neurônio-glia. Foi adaptado de um estudo anterior do nosso grupo^5,onde foram descritas as culturas embrionárias do neurônio cortical-glia e do neurônio enriquecidos com neurônios e as duas culturas caracterizadas. Usando essas culturas, Roque et al. descobriram que os astrócitos desem…

Materials

24 -well culture plates	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 gas cylinder	ArLíquido
Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature
Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature
B27 supplement (50x)	Gibco	17504-044
Dako Fluorescence Mounting Medium	Dako	S3023
D-glucose anhydrous	Fisher Scientific	G/0450/60	3.4 g/L
Epifluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x objective
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom	S0615	10%
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1272	120 µg/mL
Glutamate	Sigma-Aldrich	G8415	25µM
Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	0.5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µM; incubation period – 10 min at room temperature
Hypoxia incubation chamber	Stemcell Technologies	27310	Chamber used for OGD induction
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
Ketamine	Sigma-Aldrich	K-002	87.5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium	Sigma-Aldrich	M0268	warm up to 37 °C before use
Mouse Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	warm up to 37 °C before use
Paraffin pastilles for histology	Sigma-Aldrich	1.07164	Solidification point 56-58°C
Paraformaldehyde	Sigma -Aldrich	P6148	4% in PBS
Penicilin/Streptomycin	Biochrom	A 2213	penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL)
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1024
Rabbit Anti-GFAP	DAKO	Z0334	1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C
Sodium hydrogen carbonate	Fisher Scientific	S/4240/60	2.2g/L
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg